Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
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Wir danken Fox Avery für das Testen dieser Protokolle und die Durchsicht des Manuskripts und Eric Hall für die Unterstützung bei der Programmierung. Die hier vorgestellten Methoden wurden zum Teil von der National Science Foundation 1724026 (D.R.A.) finanziert.

1. Neuronale Bildgebungsgeräte
HINWEIS: In Lawler und Albrecht15 finden Sie detaillierte Anweisungen zum Aufbau des Bildgebungs- und Stimulationssystems, das den Zeitpunkt der Mikroskopbeleuchtung, die Bildaufnahme und die Stimulusabgabe steuert (Abbildung 1). Ein preiswerter Arduino Nano Stimulusregler steuert die fluidischen Ventile durch digitale Signale an einen Ventilregler und steuert die optogenetische Beleuchtung dur...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir ein frei zugängliches Mikroskopiesystem zur Beurteilung neuronaler Aktivitätsphänomene unter Verwendung der zeitlich präzisen Abgabe verschiedener Reizmuster. Die mikrofluidische Plattform liefert wiederholbare Stimuli, während Dutzende von Tieren im Sichtfeld des Mikroskops bleiben. Nur wenige kommerzielle Mikroskopie-Softwarepakete ermöglichen die einfache Programmierung verschiedener Stimulus-Timing-Muster, und diejenigen, die dies tun, erfordern oft die manuelle Eingabe jedes...

Calcium-Bildgebungsverfahren haben die nicht-invasive Aufzeichnung der neuronalen Dynamik in vivo in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und genetisch kodierten Calciumindikatoren, die in Zielzellen exprimiert werden, ermöglicht 1,2,3. Diese Sensoren verwenden in der Regel ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie z. B. die GFP-Calmodulin-M13-Peptidfamilie (GCaMP), um die Fluoreszenzintensität bei neuronaler Aktivierung und erhöhten intrazellulären Kalziumspiegeln zu erhöhen. Die Kalzium-Bildgebung hat sich beim Fadenwurm C. elegans als besonders leistungsfähig erwiesen, um zu untersuchen, wie Neuronen und neuronale Schaltkreise in lebenden, sich verhaltenden Tieren funktionieren 4,5,6,7,8,9,10, da ihre transparente Natur bedeutet, dass kein chirurgischer Prozess für den optischen Zugang erforderlich ist und zellspezifische Genpromotoren die Expression auf die interessierenden Zellen abzielen. Bei diesen Techniken kommen häufig mikrofluidische Geräte zum Einsatz, die präzise kontrollierte Umgebungen bieten, um biologische, chemische und physikalische Phänomene auf kleinem physikalischen Maßstab zu untersuchen11,12. Mikrofluidische Geräte zur Messung der neuronalen Aktivität gibt es in Hülle und Fülle, wobei ständig neue Designs entwickelt werden, und sie werden leicht im Forschungslabor hergestellt. Bei vielen Konstruktionen wird jedoch jeweils ein einzelnes Tier gefangen, was den experimentellen Durchsatz begrenzt 7,9,13. Neuronale Reaktionen variieren oft erheblich zwischen den Tieren, was auf Unterschiede in früheren Erfahrungen, inneren Zuständen wie Stress oder Hunger oder stochastischen Faktoren wie der Genexpression zurückzuführen ist. Diese Unterschiede begründen den Bedarf an Methoden, die gleichzeitig viele Tiere stimulieren und beobachten und Informationen von Individuen extrahieren können4.
Darüber hinaus zeigen sich bestimmte neuromodulatorische Phänomene erst unter bestimmten Stimulationsbedingungen, wie z. B. die zeitliche Hemmung14, die sich auf die kurzzeitige Unterdrückung von Reaktionen bezieht, wenn die Stimulation in schneller Folge erfolgt. Elektrophysiologische Systeme können zu diesem Zweck die neuronale Aktivität über einen breiten Reizraum steuern, indem sie beispielsweise den elektrischen Impulsstrom, die Spannung, die Frequenz, die Wellenform, das Tastverhältnis und das Timing periodischer Reizzüge modulieren. Die indirekte Stimulation durch natürlich detektierte Reize oder optogenetische Systeme würde von einer ähnlichen Bandbreite an Kontrollmechanismen profitieren. Gegenwärtig werden viele natürliche Reize auf einfache "On-Off"-Weise präsentiert, wie z. B. die Geruchspräsentation und -entfernung, wobei kommerzielle Systeme verwendet werden, die nur langsam Flexibilität bieten. Kostengünstige Mikrocontroller können nun jedoch die Abgabe verschiedener Arten von Stimuli auf eine Weise automatisieren, die an die Bedürfnisse der Forscher angepasst werden kann. In Kombination mit der Mikrofluidik haben diese Systeme das Ziel erreicht, den experimentellen Durchsatz und die Flexibilität zu erhöhen, so dass neuronale Reaktionen auf eine Vielzahl präziser Reize bei vielen Tieren gleichzeitig gemessen werden können 4,6. Die multimodale Stimulation kann verwendet werden, um die neuronalen Schaltkreise weiter abzufragen, z. B. durch die Überwachung von Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit bei konsistenter Stimulation vor, während und nach einer orthogonalen Störung, wie z. B. einer Arzneimittelexposition4. Die Vorteile kostengünstiger, offener Mikroskopiesysteme liegen auf der Hand, um die wissenschaftliche Forschung voranzutreiben, doch in der Praxis kann die Notwendigkeit der Beschaffung, Konstruktion und Leistungsvalidierung von Teilen die Einführung dieser Techniken behindern.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, einige dieser technischen Herausforderungen zu entschärfen. Während sich frühere Protokolle auf die Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen und die grundlegende Stimulation 9,15,17 konzentriert haben, beschreiben wir hier die Konstruktion und Verwendung eines flexiblen, automatisierten, multimodalen Stimulusabgabesystems für die neuronale Bildgebung in C. elegans oder anderen kleinen Organismen unter Verwendung zuvor beschriebener mikrofluidischer Vorrichtungen4. Das Open-Source-System wird über einfache Textdateien programmiert, um die Experimente zu definieren, und das NeuroTracker-Datenanalyseprogramm extrahiert halbautomatisch die neuronalen Aktivitätsdaten aus den Mikroskopvideos. Wir demonstrieren dieses System anhand von Beispielen zur Beurteilung der zeitlichen Hemmung, Enthemmung und des Reizübersprechens mit Hilfe des chemosensorischen Neurons AWA, das als Reaktion auf verschiedene Lebensmittelgerüche oder als Reaktion auf Licht depolarisiert, wenn optogenetische lichtempfindliche Ionenkanäle exprimiertwerden 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

Fluoreszierende genetisch kodierte Kalziumindikatoren haben wesentlich zu unserem Verständnis der neuronalen Dynamik von der Ebene einzelner Neuronen bis hin zu ganzen Gehirnschaltkreisen beigetragen. Neuronale Reaktionen können jedoch aufgrund früherer Erfahrungen, interner Zustände oder stochastischer Faktoren variieren, so dass Methoden erforderlich sind, die die neuronale Funktion bei vielen Individuen gleichzeitig bewerten können. Während die meisten Aufzeichnungstechniken jeweils ein einzelnes Tier untersuchen, beschreiben wir die Verwendung der Weitfeldmikroskopie, um neuronale Aufzeichnungen auf Dutzende von Caenorhabditis elegans oder anderen Organismen im Submillimeterbereich gleichzeitig zu skalieren. Open-Source-Hardware und -Software ermöglichen eine große Flexibilität bei der Programmierung vollautomatischer Experimente, die die Intensität und das Timing verschiedener Stimulustypen steuern, einschließlich chemischer, optischer, mechanischer, thermischer und elektromagnetischer Reize. Insbesondere mikrofluidische Durchflussgeräte ermöglichen eine präzise, wiederholbare und quantitative Steuerung chemosensorischer Reize mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Sekunde. Die halbautomatische Datenanalyse-Pipeline von NeuroTracker extrahiert dann individuelle und populationsweite neuronale Reaktionen, um funktionelle Veränderungen in der neuronalen Erregbarkeit und Dynamik aufzudecken. In diesem Artikel werden Beispiele für die Messung der neuronalen Adaptation, der zeitlichen Hemmung und des Stimulus-Crosstalks vorgestellt. Diese Techniken erhöhen die Präzision und Wiederholbarkeit der Stimulation, ermöglichen die Erforschung der Populationsvariabilität und sind auf andere dynamische Fluoreszenzsignale in kleinen Biosystemen von Zellen und Organoiden bis hin zu ganzen Organismen und Pflanzen verallgemeinerbar.

Wir präsentieren mehrere Beispiele für Stimulusmuster, die verschiedene neuronale Phänomene untersuchen, einschließlich zeitlicher Hemmung, Anpassung und Enthemmung. Zeitliche Hemmung ist die kurzzeitige Unterdrückung einer neuronalen Reaktion auf eine zweite Reizpräsentation, die kurz nach der ersten Präsentation auftritt14. Um dieses Phänomen zu testen, wurden in einem Paarpulsexperiment acht Muster präsentiert, die aus zwei 1 s Geruchsimpulsen bestehen, die durch ein I...

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Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.

Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

Neuronale Reaktionen geben Aufschluss über die Gehirnaktivität, können aber je nach Experiment und Individuum variieren. Dieses Protokoll hilft bei der Automatisierung der Stimulationsaufzeichnung und -analyse und vereinfacht die Programmierung verschiedener Arten und Muster von Stimuli. Die automatisierte Technik ermöglicht die parallele Aufzeichnung mehrerer Neuronen und Organismen im gleichen mikrofluidischen Format.Dies verbessert die Wiederholbarkeit von Aufzeichnungen und ermöglicht die Erforschung der neuronalen Variabilität zwischen Populationen. Verschiedene Stimulationsmuster sind erforderlich, um neuronale Phänomene wie Anpassung und sensorische Integration aufzudecken. Diese Methode ist verallgemeinerbar auf andere dynamische Signale von Zellen und Organoiden auf Organismen und Pflanzen.Schalten Sie zunächst das Mikroskop ein, füllen und entfernen Sie die Luftblasen mit der Ansaugspritze aus dem Reservoirschlauch und füllen Sie dann den Ausflussschlauch mit Puffer. Entfernen Sie das mikrofluidische Gerät aus dem Vakuum-Exsikkator. Setzen Sie das Gerät auf das Mikroskop und führen Sie den Auslassschlauch schnell ein.Drücken Sie vorsichtig auf die Auslassspritze, um Flüssigkeit in das Gerät zu injizieren, bis ein Tröpfchen aus einem Einlass austritt. Verwenden Sie an diesem Tröpfcheneinlass eine Tropfen-zu-Tropfen-Verbindung, um das entsprechende fluidische Einlassrohr einzuführen, und stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitstropfen sowohl auf dem Einlassschlauch als auch auf dem Bullauge des Geräts vorhanden sind, um das Einführen einer Blase zu vermeiden. Verbinden Sie das nächste Einlassrohr mit dem nächsten Tröpfchen.Injizieren Sie bei Bedarf mehr Flüssigkeit aus dem Auslass und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Einlässe gefüllt sind. Setzen Sie einen soliden Sperrstift in unbenutzte Einlässe und die Schneckenladeöffnung ein. Überprüfen Sie den Durchfluss auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass der Durchfluss in die gewünschte Richtung geht.Drehen Sie das erste Ventil auf der Ventilsteuerung um und beobachten Sie, wie der Reizfluss in den mikrofluidischen Bereich fließt. Wenn der Durchfluss unausgeglichen ist, passen Sie die Behälterhöhen an. Übertragen Sie die jungen erwachsenen Tiere mit einem Drahtspitzpickel auf ein nicht ausgesätes Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Agarplatte und fluten Sie die Platte dann mit etwa fünf Millilitern eines XS-Basalpuffers, damit die Tiere schwimmen können.Ziehen Sie die Würmer mit dem beigefügten Schlauch, der mit einem XS-Basalpuffer vorgefüllt ist, in eine Ein- bis Drei-Milliliter-Ladespritze. Bewegen Sie den Schlauch mit einem Handgriff unter die Flüssigkeitsoberfläche zu jedem gewünschten Tier und ziehen Sie ihn mit der in der anderen Hand gehaltenen Spritze in den Schlauch. Schließen Sie den Auslassumriss, entfernen Sie den Schneckenladestift und verbinden Sie die Schneckenladespritze über eine Drop-to-Drop-Verbindung mit dem Gerät.Dann lassen die Tiere sanft in die Arena strömen. Stellen Sie einen Pufferfluss her und planen Sie bis zu einer Stunde für die Immobilisierung durch Tetramisol ein. Erstellen Sie mit dem Texteditor eine Stimulusdefinitionstextdatei mit dem Namen userdefinedacquisitionsettings.txt mit den Stimulationseinstellungen für die automatische Bildaufnahme. In dieser Datei werden Mikroskopaufnahmeparameter wie Belichtungs- und Anregungszeitpunkt, Versuchsdauer, Intervalle und Speicherverzeichnis definiert. Außerdem werden der Experimenttyp und die Einstellungen für den Stimulationszeitpunkt definiert.Verwenden Sie für ein Experiment mit einem einzelnen Stimulus ein Format mit nur einem wiederholten Stimulationsbefehl. Verwenden Sie für ein Multi-Muster-Experiment ein Format mit mehreren Stimulationsbefehlen, indem Sie eine Mustersequenz von Ziffern einfügen, die die Reihenfolge der Stimulusmuster darstellt. Geben Sie für jedes Muster einen Stimulationsbefehl in einer separaten Zeile ein.Führen Sie als Nächstes die Mikroskopsteuerungssoftware aus. Stellen Sie sicher, dass alle fluidischen Einlässe geöffnet sind, der Fluss innerhalb der Arena erwünscht ist und die interessierenden Neuronen innerhalb des Live-Fensters fokussiert sind. Schließen Sie dann das Live-Fenster und führen Sie das Skript multipatternrunscript aus.bsh innerhalb der Software. Um die Daten zu analysieren, führen Sie NeuroTracker aus, indem Sie nacheinander auf Plugins, dann auf Tracking und dann auf NeuroTracker klicken. Wählen Sie den Ordner aus, der die zu verfolgenden TIFF-Videodateien enthält, und wählen Sie den Bereich der zu verarbeitenden Dateien aus.Öffnen Sie als Nächstes mithilfe der Menüs "Bild" und "Anpassen" die Fenster zur Steuerung von Helligkeit, Kontrast und Schwellenwert. Überprüfen Sie den dunklen Hintergrund und setzen Sie den Bereich im Schwellenwertfenster nicht zurück, indem Sie die Schwellenwertmethode auf Standard und die Visualisierung auf Rot setzen. Klicken Sie dann im Helligkeitskontrastfenster auf "Auto", um die Sichtbarkeit der Neuronen zu erhöhen.Passen Sie im Helligkeitskontrastfenster die minimalen und maximalen Schieberegler an, bis die Neuronen deutlich zu unterscheiden sind. Passen Sie dann den Schwellenwert an, bis alle Neuronen als kleine rote Punkte angezeigt werden, die von anderen Objekten getrennt sind. Passen Sie den Frame-Schieberegler an, um die Bewegungen und Intensitätsänderungen der Neuronen zu beobachten, und notieren Sie alle Tiere, die von der Verfolgung ausgeschlossen werden sollen, z. B. aufgrund von Überschneidungen mit anderen Tieren.Nachdem Sie die zu verfolgenden Neuronen identifiziert haben, passen Sie bei Bedarf den Schwellenwert für jedes Tier so an, dass der rote Schwellenbereich über dem Neuron in jedem Frame sichtbar ist. Klicken Sie auf das Neuron, um seine Position und seinen Schwellenwert aufzuzeichnen. Wenn alle Neuronen ausgewählt sind, drücken Sie die Leertaste, um mit der Verfolgung zu beginnen.Überwachen Sie den Tracking-Prozess für jedes Tier und nehmen Sie alle erforderlichen Korrekturen vor. Wenn der NeuroTracker pausiert, hat er das Neuron verloren. Passen Sie den Schwellenwert nach Bedarf an und klicken Sie erneut auf das Neuron.Wenn die Integrationsbox zu einem anderen Tier oder einer anderen nicht-neuronalen Struktur in der Nähe springt, drücken Sie die Leertaste, um anzuhalten. Bewegen Sie den Schieberegler zurück zum ersten fehlerhaften Frame und klicken Sie erneut auf die richtige Neuronenposition. Führen Sie das neurotrackersummarypdf aus.m-Datei in MATLAB und wählen Sie den Ordner aus, der die NeuroTracker-Datentextdateien enthält. Warten Sie, bis eine Zusammenfassungs-PDF-Datei generiert wurde, die eine Überprüfung des Tracking-Prozesses ermöglicht. Die Tiere können anhand der Anzahl und der neuronalen Reaktionen jedes Tieres und Versuchs identifiziert und zur Beurteilung der Populationsvariabilität betrachtet werden.Verwenden Sie die Funktion DataBrowse. m, um die neuronalen Daten zu untersuchen, die nach Versuchsnummer, Tiernummer, Stimulationsmuster oder einer anderen Kategorie gruppiert sind. Das Phänomen der zeitlichen Hemmung wurde in einem Experiment mit gepaarten Impulsen getestet, das acht Muster erzeugte, die aus zwei einsekündigen Geruchsimpulsen bestanden, die durch ein Intervall von null bis 20 Sekunden getrennt waren.Der erste einsekündige Geruchsimpuls löste eine gleiche Reaktionsstärke in den Diacetyl-detektierenden AWA-Neuronen aus, und die Antworten im zweiten Puls variierten mit dem Interstimulus-Intervall. Die Enthemmung wurde durch das Catch-Experiment untersucht, bei dem eine Anpassung an den Diacetyl-Stimulus beobachtet wurde, aber die Präsentation des neuartigen 2-Methylpyrazin-Stimulus keinen starken Enthemmungseffekt hervorrief. Die getestete multimodale Stimulation zeigte, dass die chemische Stimulation allein eine Anpassung bewirkte, während die optische Stimulation allein dies nicht tat.Das kombinierte multimodale Stimulusmuster zeigte jedoch, dass optogene Antworten anfällig für chemisch induzierte Anpassung sind. Indem wir das mikrofluidische Design so modifizieren, dass es zwei Arenen umfasst, können wir genetische oder andere Störungen gleichzeitig mit einer übereinstimmenden Referenz vergleichen. Einmal eingerichtet, kann das System in vielerlei Hinsicht modifiziert werden.So haben wir beispielsweise chemische Dosiswirkungen und zustandsabhängige Veränderungen der neuronalen Aktivität wie zwischen Schlaf- und Wachzustand automatisch gemessen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Planung und Bau eines kostengünstigen Headstage für Simultaneous Neural Stimulation und Aufnahme in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Forschung

Neurowissenschaften

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Ein vollautomatisiertes und vielseitig verwendbares System zum Testen von Multi-kognitiven Funktionen und Aufnahme neuronaler Aktivitäten bei Nagetieren

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation mit gleichzeitiger fMRT in Nagetiere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gleichzeitige Langzeit-Aufnahmen auf zwei neuronale Verarbeitungsstufen in Behaving Honigbienen

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...