Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms at JoVE.com

이러한 프로토콜을 테스트하고 원고를 검토해 주신 Fox Avery와 프로그래밍 지원을 요청해 주신 Eric Hall에게 감사드립니다. 본원에 제시된 방법에 대한 자금은 미국 국립과학재단(National Science Foundation 1724026, D.R.A.)에 의해 부분적으로 제공되었다.

1. 신경 영상 장비
참고: 현미경 조명 타이밍, 이미지 획득 및 자극 전달을 제어하는 이미징 및 자극 시스템 구축에 대한 자세한 지침은 Lawler 및 Albrecht15를 참조하십시오(그림 1). 저렴한 Arduino Nano 자극 컨트롤러는 디지털 신호를 통해 밸브 컨트롤러에 대한 유체 밸브를 작동시키고 LED 컨트롤러에 대한 아날로그 전압 신호를 ?...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

이 프로토콜에서 우리는 다양한 자극 패턴의 시간적으로 정확한 전달을 사용하여 신경 활동 현상을 평가하기 위한 개방형 현미경 시스템을 설명합니다. 미세 유체 플랫폼은 수십 마리의 동물을 현미경 시야에 유지하면서 반복 가능한 자극을 전달합니다. 다양한 자극 타이밍 패턴을 쉽게 프로그래밍할 수 있는 상용 현미경 소프트웨어 패키지는 거의 없으며, 각 패턴 또는 독점 파일 형식을 수동으...

칼슘 이미징 기술은 형광 현미경 및 표적 세포에서 발현된 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하여 실시간으로 생체 내 신경 역학을 비침습적으로 기록할 수 있게 해주었다 1,2,3. 이러한 센서는 일반적으로 GFP-칼모듈린-M13 펩타이드(GCaMP) 패밀리와 같은 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 신경 활성화 및 세포 내 칼슘 수치 상승 시 형광 강도를 증가시킵니다. 칼슘 이미징은 선충 C. elegans에서 뉴런과 신경 회로가 살아 있고 행동하는 동물 4,5,6,7,8,9,10에서 어떻게 기능하는지 조사하는 데 특히 강력했습니다. 이러한 기술은 종종 작은 물리적 규모에서 생물학적, 화학적, 물리적 현상을 연구하기 위해 정밀하게 제어된 환경을 제공하는 미세유체 장치를 사용한다11,12. 신경 활동을 측정하기 위한 미세 유체 장치는 풍부하며 새로운 디자인이 지속적으로 개발 중이며 연구실에서 쉽게 제작할 수 있습니다. 그러나 많은 설계가 한 번에 한 마리의 동물을 가두어 실험 처리량을 7,9,13으로 제한합니다. 신경 반응은 종종 이전 경험의 차이, 스트레스 또는 배고픔과 같은 내부 상태 또는 유전자 발현 수준과 같은 확률적 요인으로 인해 동물마다 크게 다릅니다. 이러한 차이로 인해 많은 동물을 자극하고 관찰하는 동시에 개체로부터 정보를 추출할 수 있는 방법이 필요합니다4.
또한, 특정 신경조절 현상은 자극이 빠르게 연속적으로 발생할 때 반응의 짧은 억제를 의미하는 시간적 억제(temporal inhibition)14와 같은 특정 자극 조건에서만 명백해진다. 전기생리학적 시스템은 이러한 목적을 위해 광범위한 자극 공간에서 신경 활동을 유도할 수 있으며, 예를 들어 주기적 자극 트레인의 전기 펄스 전류, 전압, 주파수, 파형, 듀티 사이클 및 타이밍을 변조할 수 있습니다. 자연적으로 감지된 자극 또는 광유전학적 시스템에 의한 간접 자극은 유사한 범위의 제어 메커니즘으로부터 이익을 얻을 것입니다. 현재, 많은 자연적 자극은 유연성을 추가하는 데 느린 상용 시스템을 사용하여 냄새 표현 및 제거와 같은 간단한 "온-오프" 방식으로 제공됩니다. 그러나 저렴한 마이크로 컨트롤러는 이제 연구원의 요구에 맞게 사용자 정의 할 수있는 방식으로 여러 유형의 자극 전달을 자동화 할 수 있습니다. 미세 유체 공학과 결합 된이 시스템은 실험 처리량과 유연성을 증가시켜 많은 동물에서 다양한 정밀 자극에 대한 신경 반응을 동시에 측정 할 수 있도록하는 목표를 달성했습니다 4,6. 멀티모달 자극(multimodal stimulation)은 약물 노출과 같은 직교 섭동 전, 도중, 후에 지속적으로 자극할 때 신경 흥분성의 변화를 모니터링하는 것과 같이 신경 회로를 추가로 조사하는 데 사용할 수 있다4. 저렴한 개방형 현미경 시스템의 이점은 과학 연구를 발전시키는 데 분명하지만 실제로는 부품 소싱, 구성 및 성능 검증의 필요성이 이러한 기술의 채택을 방해할 수 있습니다.
이 프로토콜은 이러한 기술적 문제 중 일부를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이전 프로토콜은 미세유체 장치 사용 및 기본 자극에 초점을 맞추었지만 9,15,17, 여기서는 이전에 설명한 미세유체 장치 4를 사용하는 예쁜꼬마선충 또는 기타 작은 유기체의 신경 이미징을 위한 유연하고 자동화된 다중 모드 자극 전달 시스템의 구성 및 사용을 설명합니다. 오픈 소스 시스템은 실험을 정의하기 위해 간단한 텍스트 파일을 통해 프로그래밍되며 NeuroTracker 데이터 분석 프로그램은 현미경 비디오에서 신경 활동 데이터를 반자동으로 추출합니다. 우리는 광유전학적 빛에 민감한 이온 채널을 발현할 때 다양한 음식 냄새에 반응하거나 빛에 반응하여 탈분극하는 화학감각 뉴런 AWA를 사용하여 시간적 억제, 탈억제 및 자극 누화를 평가하는 예를 통해 이 시스템을 보여줍니다 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

형광 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표는 개별 뉴런 수준에서 전체 뇌 회로에 이르기까지 신경 역학에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 그러나 신경 반응은 이전 경험, 내부 상태 또는 확률적 요인으로 인해 달라질 수 있으므로 한 번에 많은 개인의 신경 기능을 평가할 수 있는 방법이 필요합니다. 대부분의 기록 기술은 한 번에 한 마리의 동물을 검사하는 반면, 우리는 광시야 현미경을 사용하여 한 번에 수십 개의 예쁜꼬마선충 또는 기타 서브밀리미터 규모의 유기체로 신경 기록을 확장하는 방법을 설명합니다. 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어는 화학적, 광학적, 기계적, 열적 및 전자기 자극을 포함한 다양한 자극 유형의 강도와 타이밍을 제어하는 완전 자동화된 실험을 프로그래밍하는 데 뛰어난 유연성을 제공합니다. 특히, 미세유체 유동 장치는 초 미만의 시간 분해능으로 화학감각 자극의 정밀하고 반복 가능하며 정량적인 제어를 제공합니다. 그런 다음 NeuroTracker 반자동 데이터 분석 파이프라인은 개별 및 인구 전체의 신경 반응을 추출하여 신경 흥분성 및 역학의 기능적 변화를 발견합니다. 이 논문은 뉴런 적응, 시간적 억제 및 자극 누화를 측정하는 예를 제시합니다. 이러한 기술은 자극의 정밀도와 반복성을 높이고, 개체군 변동성을 탐색할 수 있으며, 세포 및 오가노이드에서 전체 유기체 및 식물에 이르기까지 소규모 생물 시스템의 다른 동적 형광 신호로 일반화할 수 있습니다.

우리는 시간적 억제, 적응 및 탈억제를 포함하여 다양한 신경 현상을 평가하는 자극 패턴의 몇 가지 예를 제시합니다. 시간적 억제는 초기 발현 직후에 발생하는 두 번째 자극 제시에 대한 신경 반응의 일시적인 억제이다14. 이 현상을 테스트하기 위해 쌍 펄스 실험에서 0초에서 20초 범위의 간격으로 분리된 두 개의 1초 냄새 펄스로 구성된 8개의 패턴이 제시되었습니...

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Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.

여러 개의 작은 유기체에서 자동화된 다중 모드 자극 및 동시 신경 기록

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

신경 반응은 뇌 활동에 대한 통찰력을 제공하지만 실험과 개인에 따라 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 자극 기록 및 분석을 자동화하고 다양한 유형 및 패턴의 자극 프로그래밍을 단순화함으로써 도움이 됩니다. 자동화된 기술을 통해 여러 뉴런과 유기체를 동일한 미세유체 형식으로 병렬로 기록할 수 있습니다.이것은 기록의 반복성을 향상시키고 집단 전반에 걸친 신경 가변성을 탐색할 수 있게 해줍니다. 적응 및 감각 통합과 같은 신경 현상을 나타내기 위해서는 다양한 자극 패턴이 필요합니다. 이 방법은 세포와 오가노이드에서 유기체와 식물에 이르는 다른 동적 신호로 일반화할 수 있습니다.시작하려면 현미경을 켜고 프라이밍 주사기를 사용하여 저장소 튜브에서 기포를 채우고 제거한 다음 유출 튜브에 버퍼를 채웁니다. 진공 건조기에서 미세 유체 장치를 제거합니다. 장치를 현미경에 놓고 배출 튜브를 빠르게 삽입합니다.출구 주사기를 부드럽게 눌러 입구에서 물방울이 나올 때까지 장치에 유체를 주입합니다. 이 물방울이 나타난 입구에서 드롭 투 드롭 연결을 사용하여 해당 유체 입구 튜브를 삽입하고 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 입구 튜브와 장치 포트홀 모두에 액체 방울이 존재하도록 합니다. 다음 흡입 튜브를 다음 물방울에 연결합니다.필요한 경우 배출구에서 더 많은 유체를 주입하고 모든 흡입구가 채워질 때까지 반복합니다. 사용하지 않는 입구와 웜 로딩 포트에 단단한 차단 핀을 삽입합니다. 화면의 흐름을 확인하여 흐름이 원하는 방향으로 진행되는지 확인합니다.밸브 컨트롤러에서 밸브 1을 뒤집고 미세 유체 영역으로 흐르는 자극 흐름을 관찰합니다. 흐름이 불균형하면 저장소 높이를 조정하십시오. 와이어 팁 픽을 사용하여 어린 성인 동물을 씨를 뿌리지 않은 선충 성장 배지 또는 NGM 한천 플레이트에 옮긴 다음 동물이 수영할 수 있도록 약 5밀리리터의 XS 기초 완충액으로 플레이트를 범람시킵니다.하나의 XS 기본 버퍼로 미리 채워진 부착된 튜브를 사용하여 1-3밀리리터 로딩 주사기에 웜을 그립니다. 입체경을 사용하여 한 손으로 튜브를 액체 표면 아래로 원하는 각 동물에게 옮기고 다른 손에 들고 있는 주사기를 사용하여 튜브로 끌어들입니다. 출구 윤곽을 닫고 웜 로딩 핀을 제거한 다음 드롭 투 드롭 연결을 사용하여 웜 로딩 주사기를 장치에 연결합니다.그런 다음 동물을 경기장으로 부드럽게 흘립니다. 버퍼 흐름을 설정하고 테트라미솔에 의한 고정화를 위해 최대 1시간을 허용합니다. 텍스트 편집기를 사용하여 userdefinedacquisitionsettings라는 자극 정의 텍스트 파일을 만듭니다.TXT에는 자동 이미지 획득을 위한 자극 설정이 포함되어 있습니다. 이 파일은 노출 및 여기 타이밍, 시험 기간, 간격 및 저장 디렉토리와 같은 현미경 획득 매개변수를 정의합니다. 또한 실험 유형 및 자극 타이밍 설정을 정의합니다.단일 자극 실험의 경우 반복 자극 명령이 하나만 있는 형식을 사용합니다. 다중 패턴 실험의 경우, 자극 패턴의 순서를 나타내는 숫자의 패턴 시퀀스를 포함하여 다중 자극 명령이 있는 형식을 사용합니다. 각 패턴에 대해 별도의 줄에 자극 명령을 입력합니다.그런 다음 현미경 제어 소프트웨어를 실행합니다. 모든 유체 흡입구가 열려 있는지, 경기장 내에서 흐름이 필요한지, 관심 있는 뉴런이 라이브 창 내에서 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 그런 다음 라이브 창을 닫고 multipatternrunscript 스크립트를 실행합니다.소프트웨어 내에서 bsh. 데이터를 분석하려면 플러그인을 순차적으로 클릭한 다음 추적한 다음 NeuroTracker를 클릭하여 NeuroTracker를 실행합니다. 추적할 tiff 비디오 파일이 포함된 폴더를 선택하고 처리할 파일 범위를 선택합니다.그런 다음 이미지 및 조정 메뉴를 사용하여 밝기 대비 및 임계 값 제어 창을 엽니 다. 어두운 배경을 확인하고 임계값 창에서 범위를 재설정하지 않고 임계값 지정 방법을 기본값으로 설정하고 시각화를 빨간색으로 설정합니다. 그런 다음 뉴런 가시성을 위해 밝기 대비 창에서 자동을 클릭합니다.밝기 대비 창에서 뉴런을 명확하게 구분할 수 있을 때까지 최소 및 최대 슬라이더를 조정합니다. 그런 다음 모든 뉴런이 다른 물체와 분리된 작은 붉은 점으로 나타날 때까지 임계값 수준을 조정합니다. 프레임 슬라이더를 조정하여 뉴런의 움직임과 강도 변화를 관찰하고, 다른 동물과의 겹침 등 추적에서 제외해야 할 동물을 확인합니다.추적할 뉴런을 식별한 후 필요한 경우 각 동물의 임계값 수준을 조정하여 뉴런 위의 빨간색 임계값 영역이 모든 프레임에서 보이도록 합니다. 뉴런을 클릭하여 위치와 임계값 수준을 기록합니다. 모든 뉴런이 선택되면 스페이스바를 눌러 추적을 시작합니다.각 동물에 대한 추적 프로세스를 모니터링하고 필요한 수정을 수행합니다. NeuroTracker가 일시 중지되면 뉴런이 손실됩니다. 필요에 따라 임계값 수준을 조정하고 뉴런을 다시 클릭합니다.통합 상자가 근처의 다른 동물 또는 비신경 구조로 이동하면 스페이스바를 눌러 일시 중지합니다. 슬라이더를 첫 번째 잘못된 프레임으로 다시 이동하고 올바른 뉴런 위치를 다시 클릭합니다. neurotrackersummarypdf를 실행합니다.m 파일을 열고 NeuroTracker 데이터 텍스트 파일이 포함된 폴더를 선택합니다. 요약 PDF가 생성될 때까지 기다렸다가 추적 프로세스를 확인할 수 있습니다. 동물은 각 동물 및 시험의 수와 신경 반응으로 식별할 수 있으며 개체군 변동성을 평가하기 위해 관찰할 수 있습니다.DataBrowse 함수를 사용합니다. m을 사용하여 시험 번호, 동물 번호, 자극 패턴 또는 다른 범주별로 그룹화된 신경 데이터를 탐색합니다. 시간적 억제 현상은 0에서 20초 범위의 간격으로 분리된 2개의 1초 냄새 펄스로 구성된 8개의 패턴을 생성하는 쌍 펄스 실험에서 테스트되었습니다.첫 번째 1초 냄새 펄스는 디아세틸 감지 AWA 뉴런에서 동일한 반응 크기를 유도했으며 두 번째 펄스의 반응은 자극 간 간격에 따라 다양했습니다. 탈억제는 디아세틸 자극에 대한 적응이 관찰된 캐치 시험 실험에 의해 평가되었지만 새로운 2-메틸피라진 자극의 제시는 강력한 탈억제 효과를 이끌어내지 못했습니다. 테스트된 다중 모드 자극은 화학적 자극만으로는 적응을 유발하는 반면 광학 자극 단독으로는 적응을 일으키지 않는 것으로 나타났습니다.그러나 결합된 다중 모드 자극 패턴은 광유전자 반응이 화학적으로 유도된 적응에 취약하다는 것을 보여주었습니다. 두 개의 영역을 포함하도록 미세유체 설계를 수정함으로써 일치하는 참조와 함께 유전적 또는 기타 섭동을 동시에 비교할 수 있습니다. 일단 설정되면 시스템을 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다.예를 들어, 우리는 화학 물질 투여 반응과 수면 상태와 깨어있는 상태 사이와 같은 신경 활동에 대한 상태 의존적 변화를 자동으로 측정했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

동시 신경 자극과 워터 미로에서 녹음을위한 설계 및 비용 효율적인 Headstage 구축

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

연구

신경과학

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

여러인지 기능을 테스트 및 설치류에의 연결 활동을 녹음하기위한 완전 자동화된 고도 다목적 시스템

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경 근육 공동 문화

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

설치류에 동시 fMRI를 깊은 뇌 자극

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

골드 신경 세포의 자극을 광학 나노로드가 보조

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

전위도의 동시 녹화 및 마취 된 흰쥐의 비주얼 사건 관련 전위

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...