Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
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Agradecemos à Fox Avery por testar esses protocolos e revisar o manuscrito e a Eric Hall pela assistência na programação. O financiamento para os métodos aqui apresentados foi fornecido em parte pela National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

1. Equipamento de imagem neural
NOTA: Veja Lawler e Albrecht15 para obter instruções detalhadas sobre a construção do sistema de imagem e estimulação, que controla o tempo de iluminação do microscópio, a aquisição da imagem e a entrega de estímulos (Figura 1). Um controlador de estímulo Arduino Nano de baixo custo aciona as válvulas fluídicas através de sinais digitais para um controlador de válvulas e contro...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual ...

Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo 1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar como neurônios e circuitos neurais funcionam em animais vivos e comportados 4,5,6,7,8,9,10, pois sua natureza transparente significa que nenhum processo cirúrgico é necessário para o acesso óptico, e promotores gênicos específicos de células têm como alvo a expressão para as células de interesse. Essas técnicas frequentemente utilizam dispositivos microfluídicos, que fornecem ambientes precisamente controlados para estudar fenômenos biológicos, químicos e físicos em pequena escala física11,12. Dispositivos microfluídicos são abundantes para medir a atividade neural, com novos projetos continuamente em desenvolvimento, e eles são prontamente fabricados no laboratório de pesquisa. No entanto, muitos delineamentos aprisionam um único animal de cada vez, limitando o rendimento experimental 7,9,13. As respostas neurais geralmente variam substancialmente entre os animais devido a diferenças na experiência anterior, estados internos, como estresse ou fome, ou fatores estocásticos, como níveis de expressão gênica. Essas diferenças estabelecem a necessidade de métodos que possam simultaneamente estimular e observar muitos animais e extrair informações dosindivíduos4.
Além disso, certos fenômenos neuromodulatórios tornam-se aparentes apenas sob condições específicas de estimulação, como a inibição temporal14, que se refere à supressão breve das respostas quando a estimulação ocorre em rápida sucessão. Sistemas eletrofisiológicos podem conduzir a atividade neural através de um amplo espaço de estímulo para esse fim, modulando, por exemplo, a corrente de pulso elétrico, tensão, frequência, forma de onda, ciclo de trabalho e tempo de trens de estímulos periódicos. A estimulação indireta por estímulos naturalmente detectados ou sistemas optogenéticos se beneficiaria de uma amplitude semelhante de mecanismos de controle. Atualmente, muitos estímulos naturais são apresentados de forma simples "on-off", como apresentação e remoção de odores, utilizando sistemas comerciais que têm demorado a agregar flexibilidade. No entanto, microcontroladores de baixo custo agora podem automatizar a entrega de vários tipos de estímulos de uma maneira personalizável às necessidades dos pesquisadores. Combinados com a microfluídica, esses sistemas alcançaram o objetivo de aumentar o rendimento experimental e a flexibilidade, permitindo que respostas neurais a uma variedade de estímulos precisos fossem medidas simultaneamente em muitos animais 4,6. A estimulação multimodal pode ser usada para interrogar ainda mais os circuitos neuronais, como por exemplo, monitorando mudanças na excitabilidade neural ao estimular consistentemente antes, durante e após uma perturbação ortogonal, como a exposição a drogas4. Os benefícios de sistemas de microscopia abertos e de baixo custo são claros para o avanço da pesquisa científica, mas, na prática, a necessidade de fornecimento de peças, construção e validação de desempenho pode impedir a adoção dessas técnicas.
Este protocolo visa atenuar alguns destes desafios técnicos. Considerando que protocolos anteriores enfocaram o uso de dispositivos microfluídicos e estimulação básica 9,15,17, descrevemos aqui a construção e o uso de um sistema flexível, automatizado e multimodal de liberação de estímulos para imagens neurais em C. elegans ou outros pequenos organismos utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos4. O sistema de código aberto é programado através de arquivos de texto simples para definir os experimentos, e o programa de análise de dados NeuroTracker extrai semi-automaticamente os dados de atividade neural dos vídeos do microscópio. Demonstramos esse sistema com exemplos de avaliação de inibição temporal, desinibição e crosstalk de estímulos utilizando o neurônio quimiossensorial AWA, que se despolariza em resposta a diferentes odores alimentares ou em resposta à luz ao expressar canais iônicos optogenéticos sensíveis à luz 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.

Apresentamos vários exemplos de padrões de estímulos que avaliam diferentes fenômenos neurais, incluindo inibição temporal, adaptação e desinibição. A inibição temporal é a supressão momentânea de uma resposta neural à apresentação de um segundo estímulo que ocorre logo após a apresentação inicial14. Para testar esse fenômeno, em um experimento de pulso pareado, oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de 1 s separados por um intervalo que variava ...

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Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.

Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

As respostas neurais dão informações sobre a atividade cerebral, mas podem variar entre experimentos e indivíduos. Esse protocolo auxilia automatizando o registro e a análise dos estímulos e simplificando a programação de diferentes tipos e padrões de estímulos. A técnica automatizada permite gravações para múltiplos neurônios e organismos no mesmo formato microfluídico em paralelo.Isso melhora a repetibilidade dos registros e permite a exploração da variabilidade neuronal entre populações. Diferentes padrões de estimulação são necessários para revelar fenômenos neurais como adaptação e integração sensorial. Este método é generalizável para outros sinais dinâmicos de células e organoides para organismos e plantas.Para começar, ligue o microscópio, preencha e remova as bolhas de ar da tubulação do reservatório usando a seringa de escorvamento e, em seguida, preencha a tubulação de saída com tampão. Remova o dispositivo microfluídico do dessecador a vácuo. Coloque o dispositivo no microscópio e insira rapidamente a tubulação de saída.Empurre suavemente a seringa de saída para injetar líquido no dispositivo até que uma gotícula saia de uma entrada. Nesta entrada de gotícula emergida, use uma conexão gota-a-gota para inserir o tubo de entrada fluídico correspondente, garantindo que as gotas de líquido estejam presentes na tubulação de entrada e na vigia do dispositivo para evitar a introdução de uma bolha. Conecte o próximo tubo de entrada à próxima gota.Injete mais líquido da saída, se necessário, e repita até que todas as entradas estejam cheias. Insira um pino de bloqueio sólido nas entradas não utilizadas e na porta de carregamento do worm. Verifique o fluxo na tela para garantir que o fluxo vá na direção desejada.Vire a válvula um no controlador da válvula e observe o fluxo do estímulo fluindo para a arena microfluídica. Se a vazão estiver desequilibrada, ajuste as alturas do reservatório. Transfira os animais adultos jovens para um meio de crescimento de nematódeo não semeado ou placa de ágar NGM usando um palito de ponta de arame e, em seguida, inunde a placa com aproximadamente cinco mililitros de um tampão basal XS para que os animais possam nadar.Desenhe os vermes em uma seringa de carregamento de um a três mililitros usando a tubulação conectada pré-cheia com um tampão basal XS. Usando um estereoscópio, mova a tubulação abaixo da superfície líquida com uma mão para cada animal desejado e desenhe-a para dentro da tubulação usando a seringa mantida na outra mão. Feche o contorno da tomada, remova o pino de carregamento do worm e conecte a seringa de carregamento do worm ao dispositivo usando uma conexão drop-to-drop.Em seguida, flua suavemente os animais para a arena. Estabelecer fluxo tampão e permitir até uma hora para imobilização por tetramisol. Usando o editor de texto, crie um arquivo de texto de definição de estímulo chamado userdefinedacquisitionsettings.txt contendo as configurações de estimulação para a aquisição automatizada das imagens. Esse arquivo define parâmetros de aquisição do microscópio, como tempo de exposição e excitação, duração do teste, intervalos e diretório de salvamento. Ele também define o tipo de experimento e as configurações de tempo de estimulação.Para um experimento de estímulo único, use um formato com apenas um comando de estimulação repetido. Para um experimento multipadrão, use um formato com múltiplos comandos de estimulação, incluindo uma sequência padrão de dígitos que representa a ordem dos padrões de estímulo. Para cada padrão, insira um comando de estimulação em uma linha separada.Em seguida, execute o software de controle do microscópio. Verifique se todas as entradas fluídicas estão abertas, o fluxo é desejado dentro da arena e os neurônios de interesse estão em foco dentro da janela ao vivo. Em seguida, feche a janela ao vivo e execute o script multipatternrunscript.bsh dentro do software. Para analisar os dados, execute o NeuroTracker clicando sequencialmente em plugins, depois rastreando e, em seguida, NeuroTracker. Selecione a pasta que contém os arquivos de vídeo tiff a serem rastreados e selecione o intervalo de arquivos a serem processados.Em seguida, usando a imagem e ajustar menus, abra as janelas de contraste de brilho e controle de limite. Verifique o plano de fundo escuro e não redefina o intervalo na janela de limite, definindo o método de limite como padrão e a visualização como vermelha. Em seguida, clique em auto na janela de contraste de brilho para visibilidade do neurônio.Na janela de contraste de brilho, ajuste os controles deslizantes mínimo e máximo até que os neurônios sejam claramente distinguíveis. Em seguida, ajuste o nível de limiar até que todos os neurônios apareçam como pequenos pontos vermelhos separados de outros objetos. Ajuste o controle deslizante do quadro para observar o movimento do neurônio e as mudanças de intensidade, observando quaisquer animais a serem excluídos do rastreamento, como devido à sobreposição com outros animais.Depois de identificar os neurônios para rastreamento, ajuste o nível de limiar para cada animal, se necessário, de modo que a área de limiar vermelha acima do neurônio seja visível em cada quadro. Clique no neurônio para registrar sua posição e nível de limiar. Quando todos os neurônios estiverem selecionados, pressione a barra de espaço para iniciar o rastreamento.Monitore o processo de rastreamento de cada animal e faça as correções necessárias. Se o NeuroTracker parar, ele perdeu o neurônio. Ajuste o nível de limite conforme necessário e clique novamente no neurônio.Se a caixa de integração saltar para outro animal próximo ou estrutura não neuronal, pressione a barra de espaço para pausar. Mova o controle deslizante de volta para o primeiro quadro errôneo e clique novamente no local correto do neurônio. Execute o neurotrackersummarypdf.m no MATLAB e selecione a pasta que contém os arquivos de texto de dados do NeuroTracker. Aguarde a geração de um PDF resumido, permitindo a verificação do processo de rastreamento. Os animais podem ser identificados pelos números e pelas respostas neurais de cada animal e ensaio e ser visualizados para avaliar a variabilidade populacional.Use a função DataBrowse. m para explorar os dados neurais agrupados por número de ensaio, número de animais, padrão de estimulação ou por outra categoria. O fenômeno de inibição temporal foi testado em um experimento de pulso pareado que produziu oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de um segundo separados por um intervalo que variou de zero a 20 segundos.O primeiro pulso de odor de um segundo provocou igual magnitude de resposta nos neurônios AWA que detectam o diacetil e as respostas no segundo pulso variaram com o intervalo inter-estímulo. A desinibição foi avaliada pelo experimento catch trial, onde foi observada adaptação ao estímulo diacetil, mas a apresentação do novo estímulo 2-metilpirazina não provocou um forte efeito de desinibição. A estimulação multimodal testada revelou que a estimulação química isoladamente causou adaptação, enquanto a estimulação óptica isoladamente não.No entanto, o padrão de estímulo multimodal combinado demonstrou que as respostas optogênicas foram suscetíveis à adaptação quimicamente induzida. Ao modificar o desenho microfluídico para incluir duas arenas, podemos comparar perturbações genéticas ou outras ao lado de uma referência combinada ao mesmo tempo. Uma vez configurado, o sistema pode ser modificado de várias maneiras.Por exemplo, medimos automaticamente as respostas químicas à dose e as mudanças dependentes do estado da atividade neural, como entre os estados de sono e vigília.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Concepção e Construção de um Headstage Custo Efetivo de Estimulação Neural Simultânea e Gravação no labirinto aquático

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Neurociência

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

A Fully Automated and Highly Versatile System for Testing Multi-cognitive Functions and Recording Neuronal Activities in Rodents

Um sistema totalmente automatizado e altamente versátil para testes de várias funções cognitivas e registro das atividades neuronais em roedores

We have developed a fully automated system for operant behavior testing and neuronal activity recording by which multiple cognitive brain functions can be ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo músculo-Co-culturas

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...