Name: automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00
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Agradecemos a Fox Avery por probar estos protocolos y revisar el manuscrito y a Eric Hall por la asistencia de programación. El financiamiento para los métodos presentados en este documento fue proporcionado en parte por la National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

1. Equipo de imagen neuronal
NOTA: Consulte Lawler y Albrecht15 para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción del sistema de imágenes y estimulación, que controla el tiempo de iluminación del microscopio, la adquisición de imágenes y la entrega de estímulos (Figura 1). Un controlador de estímulo Arduino Nano de bajo costo acciona las válvulas fluídicas a través de señales digitales a un controlador d...

<ol>
	<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li><li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis.">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy.">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217 (2018).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses.">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li><li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons.">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy.">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li><li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments.">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Inhibition.">Temporal Inhibition.</a> Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).</li><li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+neural+activity+during+sleep/wake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation.">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).</li><li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis,+microscopy,+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li><li>NeuroTracker. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens.">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li><li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids:+Advances,+applications+and+challenges.">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074 (2019).</li><li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+synaptic+signaling,+regulation,+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons.">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234 (2017).</li><li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

En este protocolo, describimos un sistema de microscopía de acceso abierto para la evaluación de fenómenos de actividad neuronal utilizando la entrega temporalmente precisa de diferentes patrones de estímulo. La plataforma microfluídica ofrece estímulos repetibles mientras mantiene a decenas de animales en el campo de visión del microscopio. Pocos paquetes de software de microscopía comerciales permiten la fácil programación de varios patrones de sincronización de estímulos, y los que lo hacen a menudo requie...

Las técnicas de imagen de calcio han permitido el registro no invasivo de la dinámica neuronal in vivo en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia e indicadores de calcio codificados genéticamente expresados en células diana 1,2,3. Estos sensores suelen utilizar una proteína fluorescente verde (GFP), como la familia de péptidos GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar la intensidad de fluorescencia tras la activación neuronal y los niveles elevados de calcio intracelular. Las imágenes de calcio han sido especialmente poderosas en el nematodo C. elegans para examinar cómo funcionan las neuronas y los circuitos neuronales en animales vivos, comportándose 4,5,6,7,8,9,10, ya que su naturaleza transparente significa que no se requiere ningún proceso quirúrgico para el acceso óptico, y los promotores de genes específicos de células dirigen la expresión a las células de interés. Estas técnicas a menudo hacen uso de dispositivos microfluídicos, que proporcionan ambientes controlados con precisión para estudiar fenómenos biológicos, químicos y físicos a pequeña escala física11,12. Los dispositivos microfluídicos abundan para medir la actividad neuronal, con nuevos diseños continuamente en desarrollo, y se fabrican fácilmente en el laboratorio de investigación. Sin embargo, muchos diseños atrapan a un solo animal a la vez, limitando el rendimiento experimental 7,9,13. Las respuestas neuronales a menudo varían sustancialmente entre los animales debido a diferencias en la experiencia previa, estados internos como el estrés o el hambre, o factores estocásticos como los niveles de expresión génica. Estas diferencias establecen la necesidad de métodos que puedan estimular y observar simultáneamente muchos animales y extraer información de los individuos4.
Además, ciertos fenómenos neuromoduladores se hacen evidentes sólo bajo condiciones específicas de estimulación, como la inhibición temporal14, que se refiere a la breve supresión de las respuestas cuando la estimulación ocurre en rápida sucesión. Los sistemas electrofisiológicos pueden impulsar la actividad neuronal a través de un amplio espacio de estímulo para este propósito, modulando, por ejemplo, la corriente de pulso eléctrico, el voltaje, la frecuencia, la forma de onda, el ciclo de trabajo y la sincronización de los trenes de estímulos periódicos. La estimulación indirecta por estímulos detectados naturalmente o sistemas optogenéticos se beneficiaría de una amplitud similar de mecanismos de control. Actualmente, muchos estímulos naturales se presentan de una manera simple "on-off", como la presentación y eliminación de olores, utilizando sistemas comerciales que han tardado en agregar flexibilidad. Sin embargo, los microcontroladores de bajo costo ahora pueden automatizar la entrega de varios tipos de estímulos de una manera que se puede personalizar según las necesidades de los investigadores. Combinados con la microfluídica, estos sistemas han logrado el objetivo de aumentar el rendimiento experimental y la flexibilidad, permitiendo que las respuestas neuronales a una variedad de estímulos precisos se midan simultáneamente en muchos animales 4,6. La estimulación multimodal se puede utilizar para interrogar aún más los circuitos neuronales, por ejemplo, mediante el monitoreo de los cambios en la excitabilidad neuronal cuando se estimula consistentemente antes, durante y después de una perturbación ortogonal como la exposición a drogas4. Los beneficios de los sistemas de microscopía abiertos y económicos son claros para avanzar en la investigación científica, pero en la práctica, la necesidad de abastecimiento de piezas, construcción y validación del rendimiento puede impedir la adopción de estas técnicas.
Este protocolo tiene como objetivo aliviar algunos de estos desafíos técnicos. Mientras que los protocolos anteriores se han centrado en el uso de dispositivos microfluídicos y la estimulación básica 9,15,17, describimos aquí la construcción y el uso de un sistema de administración de estímulos flexible, automatizado y multimodal para imágenes neuronales en C. elegans u otros organismos pequeños utilizando dispositivos microfluídicos previamente descritos4. El sistema de código abierto está programado a través de archivos de texto simples para definir los experimentos, y el programa de análisis de datos NeuroTracker extrae semiautomáticamente los datos de actividad neuronal de los videos del microscopio. Demostramos este sistema con ejemplos de evaluación de la inhibición temporal, la desinhibición y la diafonía de estímulos utilizando la neurona quimiosensorial AWA, que se despolariza en respuesta a diferentes olores de alimentos o en respuesta a la luz al expresar canales iónicos optogenéticos sensibles a la luz 5,6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.&#160;coli (OP50)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>Cat# OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Organisms/strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.&#160;elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work</td>
			<td>NZ1091, for example</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# B85307</td>
			<td>diacetyl, example chemical stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein, Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass water repellant</td>
			<td>Rain-X</td>
			<td>Cat #800002250</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (single-use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM) agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>Cat #: 20-273NGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60&#160;mm)</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>Cat #T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Cat# 1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>CAS# 78560-45-9</td>
			<td>glass hydrophobic treatment (durable)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino IDE</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>https://www.arduino.cc/en/software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotracker data analysis software</td>
			<td>Albrecht Lab</td>
			<td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope and Stimulation System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5&#215; objective or similar)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat #491237-0012-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>Cat #XYLIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Cat #C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino nano</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat #A000005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td>
			<td>Valve 1: Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-way normally-closed (NC) Pinch Valve</td>
			<td>Bio-Chem Valve Inc</td>
			<td>Cat #075P2-S432</td>
			<td>Valve 2: Outflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way Pinch Valve</td>
			<td>NResearch</td>
			<td>Cat #161P091</td>
			<td>Valve 3: Stimulus selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)</td>
			<td>Mightex</td>
			<td>Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink 8.2 digital/manual valve controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>Cat #01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wires and connectors</td>
			<td>various</td>
			<td>See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Device Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel variable speed rotary cutter 4000&#160;</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #F0134000AB</td>
			<td>Set speed to 5k RPM for cutting glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel drill press rotary tool workstation</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #220-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Cat #7134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, 1&#160;mm thick</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #75799-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scribe (Diamond scriber)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>Cat #54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 3-way stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-30600-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer 23 G blunt needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Cat #89134-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device</td>
			<td>Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device clamp</td>
			<td>Warner Instruments (or machine shop)</td>
			<td>P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic tubing, 0.02&#8243; ID</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Cat #EW-06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 19 G, 0.5&#8243;</td>
			<td>New England Small Tube</td>
			<td>Cat #NE-1027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated multimodal stimulation and simultaneous neuronal recording from multiple small organisms

Los indicadores fluorescentes de calcio codificados genéticamente han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de la dinámica neuronal desde el nivel de las neuronas individuales hasta los circuitos cerebrales completos. Sin embargo, las respuestas neuronales pueden variar debido a la experiencia previa, los estados internos o los factores estocásticos, lo que genera la necesidad de métodos que puedan evaluar la función neuronal en muchos individuos a la vez. Mientras que la mayoría de las técnicas de registro examinan un solo animal a la vez, describimos el uso de microscopía de campo amplio para ampliar las grabaciones neuronales a docenas de Caenorhabditis elegans u otros organismos a escala submilimétrica a la vez. El hardware y el software de código abierto permiten una gran flexibilidad en la programación de experimentos totalmente automatizados que controlan la intensidad y el tiempo de varios tipos de estímulos, incluidos los estímulos químicos, ópticos, mecánicos, térmicos y electromagnéticos. En particular, los dispositivos de flujo microfluídico proporcionan un control preciso, repetible y cuantitativo de los estímulos quimiosensoriales con una resolución de tiempo inferior a un segundo. La tubería de análisis de datos semiautomatizada NeuroTracker extrae respuestas neuronales individuales y de toda la población para descubrir cambios funcionales en la excitabilidad y dinámica neuronal. Este artículo presenta ejemplos de medición de la adaptación neuronal, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos. Estas técnicas aumentan la precisión y la repetibilidad de la estimulación, permiten la exploración de la variabilidad de la población y son generalizables a otras señales fluorescentes dinámicas en pequeños biosistemas, desde células y organoides hasta organismos completos y plantas.

Presentamos varios ejemplos de patrones de estímulo que evalúan diferentes fenómenos neuronales, incluida la inhibición temporal, la adaptación y la desinhibición. La inhibición temporal es la supresión momentánea de una respuesta neural a una segunda presentación de estímulo que ocurre poco después de la presentación inicial14. Para probar este fenómeno, en un experimento de pulso pareado, se presentaron ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de 1 s sep...

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Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

Presentamos un método para la estimulación química flexible y multimodal y el registro de la actividad neuronal simultánea de muchos gusanos Caenorhabditis elegans . Este método utiliza microfluídica, hardware y software de código abierto y análisis de datos automatizados supervisados para permitir la medición de fenómenos neuronales como la adaptación, la inhibición temporal y la diafonía de estímulos.

Estimulación multimodal automatizada y registro neuronal simultáneo de múltiples organismos pequeños

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

Las respuestas neuronales dan una idea de la actividad cerebral, pero pueden variar entre experimentos e individuos. Este protocolo ayuda automatizando el registro y análisis de la estimulación, y simplificando la programación de diferentes tipos y patrones de estímulos. La técnica automatizada permite grabaciones para múltiples neuronas y organismos en el mismo formato microfluídico en paralelo.Esto mejora la repetibilidad de las grabaciones y permite la exploración de la variabilidad neuronal entre poblaciones. Se necesitan diferentes patrones de estimulación para revelar fenómenos neuronales como la adaptación y la integración sensorial. Este método es generalizable a otras señales dinámicas de células y organoides a organismos y plantas.Para comenzar, encienda el microscopio, llene y retire las burbujas de aire del tubo del depósito con la jeringa de cebado, luego llene el tubo de salida con tampón. Retire el dispositivo microfluídico del desecador de vacío. Coloque el dispositivo en el microscopio e inserte rápidamente el tubo de salida.Empuje suavemente la jeringa de salida para inyectar líquido en el dispositivo hasta que una gota emerja de una entrada. En esta entrada emergente de gotas, use una conexión gota a gota para insertar el tubo de entrada fluídico correspondiente, asegurándose de que las gotas de líquido estén presentes tanto en el tubo de entrada como en el ojo de buey del dispositivo para evitar la introducción de una burbuja. Conecte el siguiente tubo de entrada a la siguiente gota.Inyecte más líquido de la salida si es necesario y repita hasta que todas las entradas estén llenas. Inserte un pasador de bloqueo sólido en las entradas no utilizadas y en el puerto de carga del gusano. Compruebe el flujo en la pantalla para asegurarse de que el flujo va en la dirección deseada.Gire la válvula uno en el controlador de la válvula y observe el flujo de estímulo que fluye hacia la arena microfluídica. Si el flujo está desequilibrado, ajuste las alturas del depósito. Transfiera los animales adultos jóvenes a un medio de crecimiento de nematodos sin semillas o placa de agar NGM usando un pico de punta de alambre, luego inunde la placa con aproximadamente cinco mililitros de un amortiguador basal XS para que los animales puedan nadar.Extraiga los gusanos en una jeringa de carga de uno a tres mililitros utilizando el tubo conectado precargado con un tampón basal XS. Usando un estereoscopio, mueva el tubo debajo de la superficie del líquido con una mano a cada animal deseado y tráigalo hacia el tubo usando la jeringa que se sostiene en la otra mano. Cierre el contorno de la salida, retire el pasador de carga del gusano y conecte la jeringa de carga del tornillo sin fin al dispositivo mediante una conexión gota a gota.Luego fluye suavemente a los animales hacia la arena. Establezca el flujo amortiguador y espere hasta una hora para la inmovilización por tetramisole. Con el editor de texto, cree un archivo de texto de definición de estímulo denominado userdefinedacquisitionsettings.TXT que contiene los ajustes de estimulación para la adquisición automatizada de imágenes. Este archivo define los parámetros de adquisición del microscopio, como el tiempo de exposición y excitación, la duración del ensayo, los intervalos y el directorio de guardado. También define el tipo de experimento y los ajustes de tiempo de estimulación.Para un solo experimento de estímulo, use un formato con un solo comando de estimulación repetida. Para un experimento de patrones múltiples, use un formato con múltiples comandos de estimulación incluyendo una secuencia de patrones de dígitos que represente el orden de los patrones de estímulo. Para cada patrón, introduzca un comando de estimulación en una línea separada.A continuación, ejecute el software de control del microscopio. Verifique que todas las entradas fluídicas estén abiertas, que el flujo se desee dentro de la arena y que las neuronas de interés estén enfocadas dentro de la ventana en vivo. A continuación, cierre la ventana activa y ejecute el script multipatternrunscript.BSH dentro del software. Para analizar los datos, ejecute NeuroTracker haciendo clic secuencialmente en los complementos, luego en el seguimiento y luego en NeuroTracker. Seleccione la carpeta que contiene los archivos de vídeo tiff a seguir y seleccione el rango de archivos que se procesarán.A continuación, utilizando los menús de imagen y ajuste, abra las ventanas de contraste de brillo y control de umbral. Compruebe el fondo oscuro y no restablezca el rango en la ventana de umbral, estableciendo el método de umbral en predeterminado y la visualización en rojo. Luego haga clic en automático en la ventana de contraste de brillo para la visibilidad de las neuronas.En la ventana de contraste de brillo, ajuste los controles deslizantes mínimo y máximo hasta que las neuronas sean claramente distinguibles. Luego ajuste el nivel umbral hasta que todas las neuronas aparezcan como pequeñas manchas rojas separadas de otros objetos. Ajuste el control deslizante del marco para observar el movimiento de la neurona y los cambios de intensidad, observando cualquier animal que deba excluirse del seguimiento, como debido a la superposición con otros animales.Después de identificar las neuronas para el seguimiento, ajuste el nivel umbral para cada animal si es necesario, de modo que el área de umbral rojo sobre la neurona sea visible en cada cuadro. Haga clic en la neurona para registrar su posición y nivel de umbral. Cuando todas las neuronas estén seleccionadas, presione la barra espaciadora para comenzar el seguimiento.Supervise el proceso de seguimiento de cada animal y realice las correcciones necesarias. Si NeuroTracker se detiene, pierde la neurona. Ajuste el nivel de umbral según sea necesario y vuelva a hacer clic en la neurona.Si el cuadro de integración salta a otro animal cercano o estructura no neuronal, presione la barra espaciadora para pausar. Mueva el control deslizante de nuevo al primer fotograma erróneo y vuelva a hacer clic en la ubicación correcta de la neurona. Ejecute el neurotrackersummarypdf.m en MATLAB y seleccione la carpeta que contiene los archivos de texto de datos de NeuroTracker. Espere a que se genere un PDF de resumen, lo que permite la verificación del proceso de seguimiento. Los animales pueden ser identificados por los números y las respuestas neuronales de cada animal y ensayo y ser vistos para evaluar la variabilidad de la población.Utilice la función Databrowse. m para explorar los datos neuronales agrupados por número de ensayo, número de animales, patrón de estimulación o por otra categoría. El fenómeno de inhibición temporal se probó en un experimento de pulso pareado que produjo ocho patrones que consisten en dos pulsos odorantes de un segundo separados por un intervalo que varía de cero a 20 segundos.El primer pulso de olor de un segundo provocó una magnitud de respuesta igual en las neuronas AWA que detectaban diacetilo y las respuestas en el segundo pulso variaron con el intervalo interestímulo. La desinhibición se evaluó mediante el experimento de prueba de captura donde se observó adaptación al estímulo diacetil, pero la presentación del nuevo estímulo 2-metilpirazina no provocó un fuerte efecto de desinhibición. La estimulación multimodal probada reveló que la estimulación química sola causó adaptación, mientras que la estimulación óptica sola no lo hizo.Sin embargo, el patrón de estímulo multimodal combinado demostró que las respuestas optogénicas eran susceptibles a la adaptación inducida químicamente. Al modificar el diseño microfluídico para incluir dos arenas, podemos comparar perturbaciones genéticas o de otro tipo junto con una referencia coincidente al mismo tiempo. Una vez configurado, el sistema se puede modificar de muchas maneras.Por ejemplo, hemos medido automáticamente las respuestas a la dosis química y los cambios dependientes del estado en la actividad neuronal, como entre los estados de sueño y vigilia.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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