Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81974056) إلى R.Z. ومن مؤسسة شباب الطبيعة الوطنية في الصين (82101808) ومشروع تخطيط العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 202102020196) إلى Z.L.

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مركز قوانغتشو يونغنو للحيوانات الطبية الحيوية (IACUC-AEWC-F2208020) ، حيث تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات.
1. إنشاء نموذج الفأر الليفي المزمن BA
ملاحظة: تم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في نفس الغرفة ، وأجريت التجارب في بيئة تقليدية. تم الاحتفاظ بالفئران BALB / c في اليوم 12.5 من الحمل (العمر: 10-12 أسبوعا ؛ الوزن 35-40 جم) في غرفة بدون مسببات أمراض محددة عند 25 درجة مئوية في ظل دورة مظلمة / خفيفة مدتها 12 ساعة وتم تزويدها بحرية الوصول إلى الطعام والماء المعقم. تم اختيار الفئران الوليدية ، في غضون 24 ساعة بعد الولادة (متوسط وزن الجسم: 1.5-1.6 جم) ، لنموذج BA للفأر.
<ol><li>إعداد RRV كما ورد سابقا16. ملاحظة: نظرا لضعف حالة البقاء على قيد الحياة للفئران النموذجية ، يجب فصلها في عمر 21 يوما لتجنب تعرضها للعض أو حتى القتل من قبل الفئران الأخرى في نفس القفص.</li>
	<li>قسم الفئران حديثي الولادة إلى ثلاث مجموعات: المجموعة الضابطة ، ومجموعة RRV ، ومجموعة RRV + المضادة ل Ly6G. حقن الفئران الوليدية داخل الصفاق ب 20 ميكرولتر من RRV (عيار: 1.5 × 106 PFU / مل) (مجموعة RRV) أو محلول ملحي (مجموعة التحكم) في غضون 24 ساعة بعد الولادة. لاستنفاد خلايا Gr-1 + ، قم بمعالجة كل فأر مسبقا بحقن داخل الصفاق يبلغ 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G قبل 4 ساعات من حقن RRV. ملاحظة: يتم تخزين محلول الأجسام المضادة Ly6G عند 2-8 درجة مئوية ويجب عدم تجميده. أخرج الجسم المضاد قبل الاستخدام وضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للإحماء.</li>
	<li>حقن 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G في بطن الفأر كل 3 أيام حتى اليوم 12 بعد حقن RRV (الشكل 1A).</li>
	<li>تحقق وسجل مظهر ووزن وبقاء جميع الفئران يوميا.</li>
</ol>2. الحقن داخل الصفاق للفئران
<ol><li>إزالة الفئران حديثي الولادة من القفص. استخدم حقنة أنسولين سعة 1 مل لحقن 20 ميكرولتر من محلول RRV أو 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة ل Ly6G. قرصة جلد الرقبة للفأر الصغير بإصبع السبابة والإبهام بيد واحدة ، وأمسك برفق الأرجل الخلفية للفأر بإصبع البنصر وإصبع الذيل لفضح البطن.</li>
	<li>ارفع الإبرة في منحدر تصاعدي. أدخل الإبرة في الفخذ الأوسط من الساق الخلفية اليمنى للماوس بزاوية 15 درجة مع الجلد. بعد التحرك على طول المسار تحت الجلد حتى تصل الإبرة إلى الحافة الساحلية اليمنى للماوس ، قم بتوجيه الإبرة لأسفل إلى تجويف البطن. ثم ، حقن السائل تحت كبد الماوس. ملاحظة: الفئران حديثة الولادة لديها المعدة والطحال في البطن الأيسر. إذا تم إدخال إبرة على الجانب الأيسر ، فمن السهل اختراق المعدة أو التسبب في نزيف الطحال.</li>
	<li>اسحب الإبرة للخارج مباشرة بعد الحقن ، ولاحظ النزيف أو التسرب في موقع الحقن. إذا كان هناك أي ، امسحه بقطن معقم. أعد الفأر إلى قفص أمه. ملاحظة: من أجل تقليل تأثير تسرب السوائل أثناء الحقن على النتائج التجريبية ، تأكد من أن إجراء الحقن لطيف ، وقم بإزالة الإبرة ببطء ، واضغط على موقع الحقن بقطعة قطن لمدة 30 ثانية.</li>
</ol>3. جمع عينة من الأنسجة
<ol><li>في اليوم 12 ، قم بتخدير الفئران باستنشاق الأيزوفلوران بنسبة 4٪ ، وقم بتشريحها تحت المجهر. أدخل حقنة أنسولين سعة 1 مل في البطين الأيسر للقلب لجمع الدم. بعد جمع الدم ، القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق 4 ٪ إيزوفلوران لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي الدم في 400 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وفصل المصل لقياسات وظائف الكبد. ملاحظة: يجب إجراء جمع الدم أثناء بقاء الفئران على قيد الحياة. إذا ماتت الفئران ، سيتم الاحتفاظ بالدم في الأوعية الدموية ولا يمكن جمعه.</li>
	<li>تصوير المظهر العام للكبد والقناة الصفراوية. بعد ذلك ، تشريح كبد الفأر والطحال من الأنسجة المحيطة بالمقص والملاقط. ملاحظة: يتم جمع الكبد والأنسجة الأخرى وحجزها عند -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين أو نقعها في 10٪ فورمالين لإعداد العينات النسيجية.</li>
</ol>4. تصوير الأوعية بالفلوريسئين للقناة الصفراوية خارج الكبد
<ol><li>بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بفضح الكبد والمرارة والقنوات الصفراوية خارج الكبد تماما بالمقص ومسحات القطن.</li>
	<li>راقب تحت مجهر الموقف ، وحقن 5-10 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت رودامين 123 (20 مجم / مل) في المرارة باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل ، والتقط الصور. هذه العملية هي نفسها التي تم الإبلاغ عنها في16 سابقا. ملاحظة: يتم استخدام فئران مختلفة في نفس المجموعة لجمع عينات الأنسجة وتصوير الأوعية الفلورية.</li>
</ol>5. تلطيخ H& E
<ol><li>اغمر أنسجة كبد الفأر الطازجة في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>بعد تضمين الأنسجة في البارافين ، استخدم ميكروتوم البارافين لقطع كتلة البارافين إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر ، ووضع قسمين متتاليين على نفس الشريحة. مطلوب موظفين ذوي خبرة لتوحيد العملية لتجنب جروح الأصابع17.</li>
	<li>ضع الشرائح في رف تقطيع ، وقم بإزالة الشمع منها في الزيلين ، وقم بترطيبها على التوالي في الإيثانول المطلق ، والإيثانول بنسبة 95٪ ، والإيثانول بنسبة 80٪ ، والإيثانول بنسبة 70٪ ، والماء المقطر ، ثم انقعها في كل منها لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تلطيخ المقاطع بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، وانقعها في 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 75٪ كحول لمدة 5 ثوان. شطف الأقسام بالماء النظيف ، وصمة عار بمحلول eosin لمدة 1 دقيقة.</li>
</ol>6. CK19 و F4 / 80 تلطيخ كيميائي مناعي
<ol><li>الخطوات الثلاث الأولى هي نفس خطوات تضمين الأنسجة وتقسيمها وإزالة الشمع في قسم تلطيخ H&E .</li>
	<li>قم بإجراء إصلاح المستضد باستخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA (قاعدة Tris 10 مليمول / لتر ، 1 مليمول / لتر محلول EDTA ، درجة الحموضة 9.0) ، سخني الأقسام في فرن ميكروويف على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بإزالتها وتبريدها بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>ضع أقسام الأنسجة في محلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق لإزالة البيروكسيديز الداخلي.</li>
	<li>عالج الشرائح بمصل الماعز بنسبة 5٪ لمنع الارتباط غير المحدد.</li>
	<li>أضف السيتوكيراتين الأولي المضاد للفأر 19 أو الجسم المضاد أحادي النسيلة F4 / 80 المضاد للفأر إلى الأقسام ، واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>استخدم 3،3'-ديامينوبنزيدين (DAB) كعامل كروموجيني لمراقبة التفاعل الكروموجيني تحت المجهر.</li>
	<li>راقب الشرائح تحت مجهر 40x للحصول على الصور وتحليلها حسب الحاجة.</li>
</ol>7. سيريوس تلطيخ أحمر
<ol><li>قم بتنفيذ الخطوات الثلاث الأولى من تضمين الأنسجة وتقسيمها وإزالة الشمع كما هو موضح في قسم تلطيخ H&E.</li>
	<li>بعد تلطيخ أقسام الأنسجة بالهيماتوكسيلين ، قم بتغطية كل نسيج ب 50 ميكرولتر من محلول صبغة Sirius Red في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>جفف الشرائح بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات ، وأضف قطرة من العلكة المحايدة إلى كل شريحة ، واستخدم غطاء لتغطية الأنسجة ببطء لتجنب الفقاعات. اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة لتصلب اللثة المحايدة.</li>
	<li>استخدام المجهر ضوء التباين المستقطب لمراقبة تفاصيل ترسب الكولاجين ؛ حدد مجال رؤية واضحا ومناسبا ، واضبط السطوع وتوازن اللون الأبيض للمجال البصري للمجهر. احصل على الصور وحللها حسب الحاجة تحت مجهر 40x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lakshminarayanan, B., Davenport, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+A+comprehensive+review.">Biliary atresia: A comprehensive review.</a> Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).</li><li>Bassett, M. D., Murray, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+Recent+progress.">Biliary atresia: Recent progress.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).</li><li>Bezerra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+Clinical+and+research+challenges+for+the+twenty-first+century.">Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century.</a> Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).</li><li>Lee, W. S., Looi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+a+scoring+system+in+the+interpretation+of+histology+in+neonatal+cholestasis.">Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis.</a> World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).</li><li>Russo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+histopathologic+features+of+liver+biopsies+that+distinguish+biliary+atresia+from+other+causes+of+infantile+cholestasis+and+their+correlation+with+outcome:+A+multicenter+study.">Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).</li><li>Fickert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+animal+models+for+primary+sclerosing+cholangitis+(PSC).">Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC).</a> Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia-specific+deciduous+pulp+stem+cells+feature+biliary+deficiency.">Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+contributes+to+cholangiocyte+proliferation+and+cholestatic+liver+fibrosis+in+biliary+atresia.">Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia.</a> Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Van Damme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+associated+with+survival+times+of+pediatric+patients+with+biliary+atresia+identify+potential+therapeutic+agents.">Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents.</a> Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).</li><li>Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+biliary+injury+and+altered+bile+acid+metabolism.">Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).</li><li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1(+)+cell+subpopulations+during+microbial+infection.">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).</li><li>McDermott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Gr-1(+)+cells+and+tumour+necrosis+factor-&#945;+signalling+during+Clostridium+difficile+colitis+in+mice.">The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-&#945; signalling during Clostridium difficile colitis in mice.</a> Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neonatal+Gr-1(+)+myeloid+cells+in+a+murine+model+of+rhesus-rotavirus-induced+biliary+atresia.">The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia.</a> The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+nanoparticle+method+for+ameliorating+biliary+atresia+syndrome+in+mice.">A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).</li><li>Sy, J., Ang, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD177(+)+cells+produce+neutrophil+extracellular+traps+that+promote+biliary+atresia.">CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia.</a> Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).</li><li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+reduces+kidney+fibrosis+by+inhibiting+local+proliferation+of+profibrotic+macrophages.">CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages.</a> Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+murine+model+of+systemic+sclerosis:+Bleomycin+given+by+pump+infusion+induced+skin+and+pulmonary+inflammation+and+fibrosis.">A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis.</a> Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sorafenib+on+liver+versus+tumor+fibrosis+mediated+by+stromal-derived+factor+1+alpha/C-X-C+receptor+type+4+axis+and+myeloid+differentiation+antigen-positive+myeloid+cell+infiltration+in+mice.">Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice.</a> Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).</li><li>Tomasson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+myeloproliferation,+induced+in+mice+by+TEL/PDGFbetaR+expression,+depends+on+PDGFbetaR+tyrosines+579/581.">Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).</li><li>Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+CD177(+)+cells+as+an+early+diagnostic+marker+for+biliary+atresia:+A+prospective+multicentre+study+in+pediatric+patients+with+cholestasis.">Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis.</a> Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

في دراستنا ، استخدمنا الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G لإزالة أو تقليل خلايا Gr-1 + في نموذج فأر من رتق القناة الصفراوية المصاب ب RRV لتحسين متلازمة BA الحادة ، وإطالة معدل البقاء على قيد الحياة ، وتمكين الفئران BA من دخول المرحلة المزمنة. يمكن أن يؤدي تقليل جرعة الأجسام المضادة إلى BA المزمن مع التليف الكبدي ، مما يشير إلى أن عدد خلايا Gr-1 + يغير نتيجة BA في المراحل الحادة والمزمنة. في دراستنا السابقة ، تم تقليل خلايا Gr-1 + بعد إعطاء الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G ، وتم تحسين حالة البقاء الإجمالية لفئران BA15. في الوقت نفسه ، تم الإبلاغ عن أن Gr-1 + البلاعم19 ، Gr-1 + العدلات 20 ، الخلايا النخاعية Gr-1 +21 ، والخلايا المحببة Gr-1 + يمكن أن تعزز التليف في بعض النماذج الحيوانية 22. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، استنفدت خلايا Gr-1 + في الفئران جزئيا بجرعات منخفضة من الأجسام المضادة ل Ly6G ، وبقيت رواسب الكولاجين. نتيجة لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لمعالجة المرض بشكل أكثر شمولا.
أدى تطبيق الجسم المضاد ل Ly6G إلى تقليل الالتهاب ، والحفاظ جزئيا على القنوات الصفراوية ، ومنع الموت الحاد الناجم عن BA في الفئران. ومع ذلك ، فقط 20 ٪ إلى 30 ٪ من الفئران دخلت المرحلة المزمنة من BA. قد يكون هذا مرتبطا بالنقطة الزمنية وعدد حقن الأجسام المضادة ل Ly6G. نحن بحاجة إلى مزيد من استكشاف هذه النقطة الرئيسية لتحسين معدل النجاح. بالإضافة إلى ذلك ، نعتبر أنه ليس فقط خلايا Gr-1 + ولكن أيضا الخلايا المناعية الأخرى قد تلعب أدوارا مهمة ، مثل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية والخلايا البائية والبلاعم.
أما بالنسبة للبروتوكول ، فيجب ملاحظة بعض التفاصيل. (ط) من أجل تجنب تسرب العقاقير المحقونة ، نستخدم حقنة أنسولين سعة 1 مل مع إبرة قطرها 0.33 مم ، لأن قطر الإبرة صغير ، وثقب الإبرة في المحقنة صغير ، مما يساعد على تقليل إمكانية تسرب الدواء. (ii) قبل الحقن ، يجب تثبيت الماوس لمنعه من الحركة ، وتجنب تسرب الدواء ، وبالتالي ضمان التأثير التجريبي بشكل أكبر. (iii) أثناء حقن الدواء ، قمنا بحقن الدواء في السطح أو الهامش السفلي لكبد الفأر قدر الإمكان حتى يدخل الدواء إلى البطن ويتصل تماما بالكبد ليصبح ساري المفعول. (iv) عادة ما يتم الحقن من أعلى الفخذ الأيمن للفأر ، لأن معدة الفأر حديث الولادة وطحاله في البطن الأيسر ، والمعدة مليئة بالحليب. إذا تم إدخال الإبرة من الجانب الأيسر ، فيمكنها بسهولة ثقب المعدة ، مما يتسبب في تدفق الحليب إلى البطن ، أو ثقب الطحال ، مما يسبب النزيف.
CD177 هو متجانس ل Ly6G ، وقد تم التحقيق في تعبير CD177 في مرضى BA. يمكن استخدام CD177 كعلامة للتشخيص المبكر ل BA عند الأطفال ، مما يشير إلى أن خلايا CD177 + تلعب دورا مهما في مسار BA23. من خلال تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي ، وجد فريقنا أن خلايا CD177 كانت السكان المهيمنين لخلايا Gr-1 + . وفي الوقت نفسه ، أظهرت الفئران Cd177− / - BALB / c الملقحة ب RRV بداية متأخرة ل BA وانخفاض المراضة والوفيات18. وبالتالي ، فإن نموذج فأر BA المزمن لدينا له مزايا واضحة لدراسة التسبب في المرض وتطور المرض في BA. كما يوفر نموذجا حيوانيا مناسبا لدراسة العلاجات المحتملة ل BA.

رتق القناة الصفراوية (BA) هو مرض كبدي خطير يحدث غالبا عند الرضع والأطفال الصغار. على وجه التحديد ، يظهر على شكل اعتلال الأقنية الصفراوية مع اليرقان الوليدي والبراز الشاحب1. خصائصه السريرية هي التدمير الالتهابي للقنوات الصفراوية داخل الكبد وخارج الكبد والتليف التدريجي ، والذي يتطور في النهاية إلى فشل الكبد2. وفقا للإحصاءات ، فإن معدل الإصابة ب BA في الدول الآسيوية أعلى منه في الدول الأوروبية والأمريكية ، ومعدل الإصابة ب BA في الدول الآسيوية هو 1/8,000. تشمل مسببات BA العدوى الفيروسية ، وتطور القناة الصفراوية غير الطبيعي ، واضطرابات المناعة ، والاختلافات الجينية3. جراحة كاساي هي الطريقة الأكثر استخداما لتحسين ركود صفراوي لدى الأطفال المصابين ب BA ، ولكن في النهاية ، هذا لا يمكن أن يمنع تطور التليف4. يعتمد العلاج الحالي ل BA بشكل أساسي على زراعة الكبد ، والتي تقتصر على نقص مصادر الكبد. دراسة متعمقة للتسبب في BA هي الوسيلة الأكثر مباشرة لحل تحديات هذا المرض. ومع ذلك ، تعتمد الدراسات حول التسبب في BA بشكل أساسي على النماذج الحيوانية BA ، ومن الأهمية بمكان اختيار نموذج حيواني مناسب.
أظهرت معظم الدراسات النسيجية المرضية ل BA أن تضخم القناة الصفراوية (BDP) ، وتجلط الصفراء ، وتليف الوريد البابي هي أهم السمات المرضية ل BA ، وتوجد سمات مرضية أخرى من درجات مختلفة في نفس الوقت ، مثل تسلل الخلايا الالتهابية البابية وتورم خلايا الكبد 5,6. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة متنوعة من نماذج الفئران التي تحاكي BA ، مثل نموذج الفأر المزمن 3،5-die-thoxycarbonyl-1،4-dihydrocollidine (DDC) مع انسداد القناة الصفراوية القطاعية والتهاب الأقنية الصفراوية الذي يشمل القنوات الصفراوية خارج الكبد7 ونموذج الفأر لتليف الكبد مع حقن داخل الصفاق من رابع كلوريد الكربون8. يتميز نموذج ربط القناة الصفراوية (BDL) باليرقان وتليف الوريد البابيالسريع 9. يقدم نموذج الفأر الذي يتغذى على ألفا نفثيليزوثيوسيانات (ANIT) مع التهاب الأقنية الصفراوية المحصور في القناة الصفراوية داخل الكبد وإصابة خلايا الكبد10. يتم تحفيز نموذج الفأر المصاب باليرقان لفترات طويلة عن طريق التلقيح المتأخر لفيروس الروتا الريسوس (RRV)11. على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية ، وخاصة نماذج الفئران ، إلا أن كل نموذج له حدوده الخاصة. يمكنهم فقط محاكاة جزء من خصائص مرض BA ، مثل الالتهاب الحاد أو تليف الكبد في عملية رتق القناة الصفراوية ، ولا يوجد نموذج يتوافق بشكل كبير مع عملية المرض والسمات المرضية ل BA.
يتم تحفيز نموذج الماوس BA الكلاسيكي بواسطة RRV ، وهذا النموذج هو النموذج الأكثر تشابها مع BA في البشر. ومع ذلك ، في حين أن الفئران النموذجية BA التي يسببها RRV تظهر أعراضا سريرية وخصائص مرضية مماثلة لبعض تلك الخاصة برتق القناة الصفراوية خارج الكبد ، فإن هذا النموذج يفتقر إلى تليف الكبد ، مما يحد بشكل كبير من الدراسة المتعمقة لآليات BA وتطوير علاجات جديدة12. لذلك ، طورت هذه الدراسة نموذجا جديدا للفأر BA لتليف الكبد المزمن. تم حقن الجسم المضاد ل Ly6G داخل الصفاق قبل تلقيح RRV في يوم الولادة. ثم ، تم حقن 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G أربع مرات ، مع وجود فجوات لمدة يومين بين كل حقنة. تحسنت أعراض BA للفئران ، وطال وقت البقاء على قيد الحياة ، ودخلت الفئران مرحلة التليف المزمن. لا يحاكي هذا النموذج استجابة المرحلة الحادة ل BA فحسب ، بل يحاكي أيضا عمليات الكبد والتليف التدريجي. وبالتالي ، فهو نموذج حيواني أكثر ملاءمة للدراسة الميكانيكية لمكتبة الإسكندرية ، ويمكن أن يوفر أساسا نظريا لتطوير العلاجات المستقبلية ل BA.
جزيء Gr-1 هو علامة سطح خلية مشتقة من النخاع تم العثور عليها في الأصل في العدلات13. يقلل استنفاد الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G من العدلات المنتشرة بأكثر من 90٪ ويغير الاستجابة التي تنشطها الخلايا المناعية الأخرى. تم الإبلاغ عن وظائف مجموعات خلايا Gr-1 + في دراسات مختلفة باستخدام أجسام مضادة كسح محددة ، مع تأثيرات متفاوتة تم تحديدها على السيتوكينات والحماية المناعية بوساطة14. لقد درسنا وظيفة خلايا Gr-1 + في نماذج فأر BA الملقحة ب RRV. ومع ذلك ، نظرا لعدم العثور على جزيء Gr-1 في البشر ، فقد تمت دراسة جزيء مماثل ، CD177 ، في مرضىBA 15. تثبت بياناتنا أهمية مجموعات خلايا Gr-1 + ، خاصة في المرحلة الليفية المزمنة من المرض ، وتوفر نموذجا حيوانيا مناسبا للتحقيق في علاجات BA المحتملة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

رتق القناة الصفراوية (BA) هو مرض قاتل ينطوي على اليرقان الانسدادي ، وهو المؤشر الأكثر شيوعا لزراعة الكبد عند الأطفال. بسبب المسببات المعقدة والتسبب غير المعروف ، لا توجد حتى الآن علاجات دوائية فعالة. في الوقت الحاضر ، يعد نموذج الفأر BA الكلاسيكي الناجم عن فيروس الروتا الريسوس (RRV) هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة التسبب في BA. يتميز هذا النموذج بتأخر النمو واليرقان في الجلد والغشاء المخاطي والبراز الطيني والبول الأصفر الداكن. يظهر التشريح المرضي التهاب الكبد الحاد وانسداد القنوات الصفراوية داخل الكبد وخارج الكبد ، والتي تشبه أعراض BA البشرية. ومع ذلك ، فإن كبد الفئران في المرحلة النهائية في هذا النموذج يفتقر إلى التليف ولا يمكنه محاكاة خصائص تليف الكبد بشكل كامل في BA السريري. طورت الدراسة المقدمة نموذجا جديدا للفأر BA لتليف الكبد المزمن عن طريق حقن 5-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G أربع مرات ، مع وجود فجوات لمدة يومين بعد كل حقنة. أظهرت النتائج أن بعض الفئران نجحت في تكوين BA المزمن مع تليف نموذجي بعد الفاصل الزمني ، مما يعني أن هذه الفئران تمثل نموذجا حيوانيا مناسبا للدراسة الميكانيكية لتليف الكبد الناجم عن الفيروس ل BA ومنصة لتطوير علاجات BA المستقبلية.

تم حقن الفئران داخل الصفاق ب 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G في غضون 24 ساعة من الولادة ثم حقنت داخل الصفاق ب 20 ميكرولتر من RRV بعد 4 ساعات. بعد ذلك ، تم حقن 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G كل 3 أيام حتى اليوم 12 (الشكل 1 أ). كان متوسط وقت البقاء على قيد الحياة في مجموعة RRV 13 يوما. على العكس من ذلك ، فإن معظم الفئران التي عولجت بالجسم المضاد أصيبت باليرقان الخفيف ، ولم يلاحظ أي فقدان للوزن (الشكل 1C). حوالي 20٪ -30٪ من الفئران كانت تعاني من متلازمة BA مع اليرقان على المدى الطويل وانخفاض وزن الجسم ولكنها نجت لأكثر من 42 يوما. بعد العلاج بالأجسام المضادة ل Ly6G ، انخفض عدد خلايا Gr-1 + بمقدار 15 ، ودخلت الفئران مرحلة التليف المزمن ، والتي تسمى BA المزمن. تم جمع العينات في اليوم 12 واليوم 42 ، وأظهرت شرائح الأنسجة الملطخة ب Sirius Red زيادة تدريجية في تليف الكبد. تم استخدام الفئران المزمنة BA التي بقيت على قيد الحياة لمدة 42 يوما لإجراء تحليلات مفصلة. بالإضافة إلى صغر الحجم ، أظهرت الأذنين والقدمين وجلد الذيل يرقانا ملحوظا (الأسهم الزرقاء في الشكل 1E). في اليوم 6 بعد حقن RRV ، أصبح لون براز الفئران أفتح ، وأصبح لون البول أغمق. أصبح هذا مختلفا بشكل كبير عن المجموعة الضابطة في اليوم 12 ، عندما أظهرت فئران مجموعة RRV برازا أبيض وبولا أصفر داكنا. في اليوم 42 ، أظهر بول وبراز الفئران المزمنة BA أيضا سمات واضحة لليرقان (الشكل 1D ، E). تمت إزالة أكباد الفئران BA ومقارنتها بأكباد الضوابط. كانت الكبد أصغر (الشكل 2 ب) ، وكانت الآفات الميتة مرئية للعين المجردة (الشكل 2 أ ، مثلث أسود) ، كما لوحظ جزء من رتق القناة الصفراوية خارج الكبد (الشكل 2 أ ، العلامات النجمية البيضاء).
أظهر تحليل قسم أنسجة الكبد أن العلاج المضاد ل Ly6G بجرعة منخفضة قلل من التهاب الوريد البابي. ومع ذلك ، لا يزال لوحظ تراكم الخلايا الالتهابية في شرائح أنسجة الكبد في اليوم 42 (الشكل 3 أ). أظهر تلطيخ Sirius Red زيادة طفيفة في ترسب الكولاجين في منطقة البوابة في اليوم 12 بعد حقن RRV. علاوة على ذلك ، لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في تعبير الكولاجين بعد العلاج بالجسم المضاد ل Ly6g ، ولكن تعبير الكولاجين في عينات أنسجة BA في اليوم 42 زاد بشكل ملحوظ (الشكل 3B). عند فحصها تحت المجهر الضوئي المستقطب ، لوحظ أن ألياف الكولاجين قد تراكمت في أنسجة الكبد المجاورة. شوهد ترسب كبير للكولاجين ، يغلب عليه اللون الأخضر ، في عينات أنسجة BA في اليوم 42 (الشكل 3C) ، وزاد ترسب الكولاجين بشكل أكبر في الفئران التي نجت لمدة 42 يوما دون زيادة الوزن. مع الحد من التهاب البوابة ، لوحظت خلايا القناة الصفراوية CK19 + في اليوم 12. ومع ذلك ، في اليوم 42 ، كان من الصعب اكتشاف القنوات الصفراوية الناضجة ، على الرغم من ملاحظة زيادة في خلايا القناة الصفراوية CK19 + (الشكل 4A ، تشير الأسهم الحمراء إلى الخلايا الظهارية للقناة الصفراوية). في حالة القنوات الصفراوية خارج الكبد في الفئران المصابة ب BA المزمن ، كشف التشريح التسلسلي للمنطقة البابية للفئران أن القنوات الصفراوية خارج الكبد كانت مسدودة وكان لها ارتشاح التهابي للبلاعم (الشكل 4B ، تشير الأسهم السوداء إلى البلاعم).
بالمقارنة مع RRV وحده ، أدى العلاج بجرعة منخفضة من الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G إلى تقليل إصابة الكبد من حيث مستويات إنزيم الكبد في اليوم 12 بعد تلقيح RRV. كانت مستويات ألانين أمينوترانسفيراز والفوسفاتيز القلوي في الكبد أعلى في مجموعة BA المزمنة منها في المجموعة الضابطة العادية. تم العثور على التغييرات الأكثر وضوحا في مستويات البيليروبين ، حيث أظهرت الفئران RRV + المضادة ل Ly6G مستويات منخفضة من TBIL و DBIL و IBIL في BA الحاد على النقيض من RRV وحده. في الفئران المصابة ب BA المزمن ، زادت مستويات TBIL و DBIL و IBIL (الشكل 5) ، مما يشير إلى أن وظائف الكبد قد انخفضت بشكل ملحوظ في مرحلة التليف المزمن من BA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> الشكل 1: آثار العلاج بالأجسام المضادة ل Ly6G في نموذج فأر من رتق القناة الصفراوية المصاب ب RRV. (أ) رسم تخطيطي لجرعات منخفضة من الأجسام المضادةللحث على المرحلة الحادة والمزمنة BA في الفئران ذات الأسهم التي تشير إلى وقت حقن الجسم المضاد و RRV. (ب) منحنيات البقاء على قيد الحياة للفئران في مجموعة التحكم العادية (تابع) ، ومجموعة فيروس الروتا الريسوس (RRV) ، ومجموعة الأجسام المضادة RRV + المضادة ل Ly6G. ج: منحنيات وزن جسم الفئران في كل مجموعة. د: صور تمثيلية للفئران وبرازها وبولها في كل مجموعة في اليوم 12. ه: صور تمثيلية للفئران وبرازها وبولها في كل مجموعة في اليوم 42. تشير الأسهم الزرقاء إلى الأذنين والذيل الأصفر. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> الشكل 2: آثار العلاج بالأجسام المضادة ل Ly6G على الكبد في نموذج فأر من رتق القناة الصفراوية المصاب ب RRV . (أ) مقارنة بين تشريح الكبد وتصوير الأوعية الفلورية للقناة الصفراوية خارج الكبد بين الفئران المزمنة BA (يمين) والفئران الطبيعية في اليوم 42. ب: مقارنة حجم الكبد بين الفئران المزمنة والفئران الطبيعية. يشير المثلث الأسود إلى نخر الكبد في الفئران المصابة ب BA المزمن. تشير العلامة النجمية البيضاء إلى رتق القناة الصفراوية خارج الكبد. أعيد طبع هذا الرقم بإذن من Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> الشكل 3: شرائح أنسجة الكبد للفئران في مجموعة التحكم الطبيعي (تابع) ، ومجموعة فيروس الروتا الريسوس (RRV) ، ومجموعة الأجسام المضادة RRV + anti-Ly6G في اليوم 12 واليوم 42. أ: صور لمقاطع أنسجة الكبد الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E). (ب) أظهر تلطيخ سيريوس الأحمر ترسب الكولاجين (PSR). (ج) مزيد من المراقبة للشرائح باستخدام المجهر الضوئي المستقطب (Pol. Light). اختصار: PV = الوريد البابي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> الشكل 4: التلوين الكيميائي المناعي لشرائح أنسجة الكبد من مجموعة التحكم الطبيعية (Cont.) ، ومجموعة فيروس الروتا الريسوس (RRV) ، ومجموعة الأجسام المضادة RRV + anti-Ly6G في اليوم 12 واليوم 42. أ: التعبير عن علامة الخلايا الطلائية للقناة الصفراوية (CK19) في مجموعات العلاج المختلفة. (ب) تم توضيح تسلل الخلايا الالتهابية للبلاعم في مجموعات العلاج المختلفة. اختصار: PV = الوريد البابي. يشير السهم الأحمر إلى الخلايا الظهارية للقناة الصفراوية. يشير السهم الأسود إلى البلاعم. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> الشكل 5: مقارنة وظائف الكبد في الفئران في مجموعات العلاج المختلفة. تم جمع دم الفأر بعد التجربة واختباره في قسم المختبر بالمستشفى. احتوت كل مجموعة على ثلاثة إلى خمسة فئران. *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. الاختصارات: ALT = ألانين أمينوترانسفيراز. AST = الأسبارتات أمينوترانسفيراز. ALP = الفوسفاتيز القلوي ؛ TBIL = إجمالي البيليروبين. DBIL = البيليروبين المباشر. IBIL = البيليروبين غير المباشر. تم تعديل هذا الرقم من Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia at JoVE.com

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

أنشأنا نموذجا للفأر لتليف الكبد المزمن ، والذي يوفر نموذجا حيوانيا مناسبا للدراسة الميكانيكية لتليف الكبد الناجم عن الفيروس لرتق القناة الصفراوية (BA) ومنصة لعلاجات BA المستقبلية.

نموذج فأر لتليف الكبد المزمن لدراسة رتق القناة الصفراوية

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

لقد استخدمنا هذه الطريقة بنجاح لإنشاء نموذج فأر أكثر اتساقا مع التغيرات المرضية في رتق القناة الصفراوية. يمكن لهذه التقنية محاكاة أعراض رتق القناة الصفراوية الحاد والمزمن وهو أمر مفيد لأبحاث آلية المرض في المستقبل. بعد استخدام الأجسام المضادة ، تم إطالة وقت بقاء الفئران وتم تخفيف الأعراض ، مما يشير إلى التأثير العلاجي للأجسام المضادة على رتق القناة الصفراوية.بعد تقسيم الفئران الوليدية إلى مجموعات مختلفة ، كما هو موضح في المخطوطة ، قم بمعالجة كل فأر بحقن داخل الصفاق من خمسة ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G قبل أربع ساعات من حقن فيروس الروتا الريسوس أو RRV لاستنفاد الخلايا الإيجابية Gr1. في غضون 24 ساعة بعد الولادة ، حقن الفأر الوليدي داخل الصفاق مع 20 ميكرولتر من فيروس الروتا ريسوس أو المالحة. بعد حقن RRV ، يتم تطبيق 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل Ly6G في بطن الفأر.تحقق وسجل مظهر ووزن وبقاء جميع الفئران يوميا. للحقن داخل الصفاق ، قم بفضح بطن الفأر الصغير عن طريق قرص جلد الرقبة بإصبع السبابة والإبهام بيد واحدة وإمساك الأرجل الخلفية للفأر برفق بإصبع البنصر وإصبع الذيل. ارفع إبرة المحقنة في منحدر تصاعدي وأدخل الإبرة في منتصف الفخذ من الساق الخلفية اليمنى للفأر بزاوية 15 درجة مع الجلد.أثناء تحريك الإبرة على طول المسار تحت الجلد حتى تصل إلى الحافة الساحلية اليمنى للماوس ، قم بتوجيه الإبرة لأسفل إلى تجويف البطن وحقن السائل تحت كبد الفأر. اسحب الإبرة للخارج مباشرة بعد الحقن. مراقبة النزيف أو التسرب في موقع الحقن.بعد تخدير الماوس في اليوم 12 ، قم بتشريحه تحت المجهر. أدخل حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد في البطين الأيسر للقلب لجمع الدم. الطرد المركزي الدم عند 400 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وفصل المصل لقياسات وظائف الكبد.تشريح كبد الفأر والطحال من الأنسجة المحيطة باستخدام المقص والملاقط. تصوير المظهر العام للكبد والقناة الصفراوية. بعد التخدير بالاستنشاق ، قم بفضح الكبد والمرارة والقنوات الصفراوية خارج الكبد بالمقص ومسحات القطن.تحت مجهر الموقف ، قم بحقن خمسة إلى 10 ميكرولترات من صبغة الفلورسنت Rhodamine 123 في المرارة باستخدام حقنة أنسولين سعة ملليلتر واحد والتقاط الصور. اغمر أنسجة كبد الفأر الطازجة في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة. بمجرد تضمين الأنسجة في البارافين ، استخدم ميكروتوم البارافين لقطع كتلة البارافين إلى أقسام بسمك أربعة ميكرومتر ، ووضع قسمين متتاليين على نفس الشريحة.ثم ضع الشرائح في رف تقطيع ، وقم بإزالة الشمع منها في الزيلين ، وقم بترطيبها على التوالي في الإيثانول المطلق ، والإيثانول 95٪ ، والإيثانول 80٪ ، والإيثانول 70٪ ، والماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل منها. تلطيخ المقاطع بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة خمس دقائق ، وانقعها في 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 75٪ كحول لمدة خمس ثوان. بعد شطف الأقسام بالماء النظيف ، قم بتلطيخها بمحلول eosin لمدة دقيقة واحدة.تحضير أقسام الأنسجة للتلطيخ ، كما هو موضح سابقا ، وإجراء إصلاح المستضد باستخدام العازلة Tris-EDTA. سخني الأقسام في فرن الميكروويف على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم أخرجيها وبردها بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. لإزالة البيروكسيديز الداخلي ، ضع أقسام الأنسجة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق ، وعالج الشرائح بمصل الماعز 5٪ لمنع الارتباط غير المحدد.بعد ذلك ، أضف Cytokeratin 19 المضاد للفأر الأساسي المضاد للفأر أو الجسم المضاد أحادي النسيلة F4 / 80 للفأر إلى الأقسام ، واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 3،3-برايم-ديامينوبنزيدين كعامل كروموجيني لمراقبة التفاعل الكروموجيني تحت المجهر.راقب الشرائح تحت مجهر 40x للحصول على الصور وتحليلها حسب الحاجة. بمجرد تحضير أقسام الأنسجة وتلطيخها بالهيماتوكسيلين ، قم بتغطية كل نسيج ب 50 ميكرولترا من محلول صبغة سيريوس الحمراء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. جفف الشرائح بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، وأضف قطرة من العلكة المحايدة إلى كل شريحة ، واستخدم زلة غطاء لتغطية الأنسجة لتجنب الفقاعات.اترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة لتصلب اللثة المحايدة. راقب تفاصيل ترسب الكولاجين باستخدام المجهر الضوئي المستقطب. حدد مجال رؤية واضحا ومناسبا ، واضبط السطوع وتوازن اللون الأبيض للمجال البصري للمجهر.احصل على الصور وقم بتحليلها حسب الحاجة تحت مجهر 40x. بعد حقن RRV ، كان متوسط وقت البقاء على قيد الحياة في مجموعة RRV 13 يوما. أصيبت معظم الفئران التي عولجت بالجسم المضاد باليرقان الخفيف ولم يلاحظ أي فقدان للوزن.أظهرت أكباد الفئران BA آفات نخرية وجزء خارج الكبد من رتق القناة الصفراوية. حجم الكبد أصغر من الضوابط. أظهر التحليل النسيجي أن جرعة منخفضة من العلاج المضاد ل Ly6G قللت من التهاب الوريد البابي.لا يزال لوحظ تراكم الخلايا الالتهابية في شرائح أنسجة الكبد في اليوم 42. في اليوم 12 ، كانت هناك زيادة طفيفة في ترسب الكولاجين في منطقة البوابة. في اليوم 42 ، زاد تعبير الكولاجين بشكل ملحوظ ، وشوهد ترسب كبير للكولاجين في أنسجة BA.لوحظت الخلايا الإيجابية CK19 في اليوم 12. في اليوم 42 ، زادت الخلايا الإيجابية CK19 ، ولكن كان هناك عدد قليل من القنوات الصفراوية الناضجة. تم حظر القناة الصفراوية خارج الكبد في الفئران المزمنة BA وكان لها ارتشاح التهابي من microphages.كانت مستويات ALT و ALP في الكبد أعلى في مجموعة BA المزمنة منها في المجموعة الضابطة العادية. تمت زيادة إجمالي مستويات البيليروبين والبيليروبين المباشر والبيليروبين غير المباشر ، مما يشير إلى انخفاض وظائف الكبد بشكل كبير في مرحلة التليف المزمن من BA. يجب أن يتم الحقن بحذر حتى لا يثقب كبد الفأر. بعد الحقن ، يجب أن نأخذ حوالي 10 ثوان لمراقبة حالة الماوس وتنظيف الدم من الجرح.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

داء الليشمانيات الجلدي في الجلد الظهرية من الهامستر: نموذجا مفيدا لفحص المخدرات مضاد الليشمانيات

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

نموذج الفأر لالتهاب الناجم عن مسببات الأمراض المزمنة في مواقع المحلية والجهازية

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

و إيل-8 عابر نموذج الماوس المعدلة وراثيا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; رصد طويل الأمد للردود الالتهابية

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

اثنين-فوتون تصوير إينترافيتال من الكريات البيضاء خلال الاستجابة المناعية في الكبد تعامل Lipopolysaccharide الماوس

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

أسلوب نانوحبيبات الفضي للتخفيف من حدة المتلازمة الكبدية الصفراوية في الفئران

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

إنشاء نموذج الماوس ثنائي الأنسنة TK-NOG لمسببات أمراض الكبد المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...