Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81974056) à R.Z. et de la National Nature Youth Foundation of China (82101808) et du Science and Technology Planning Project of Guangzhou (No. 202102020196) à Z.L.

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre animalier biomédical Yongnuo de Guangzhou (IACUC-AEWC-F2208020), où toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées.
1. Mise en place du modèle murin BA fibrotique chronique
NOTE: Tous les animaux ont été gardés dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques (SPF) dans la même pièce, et les expériences ont été menées dans un environnement conventionnel. Les souris BALB/c au jour 12,5 de gestation (âge : 10-12 semaines ; poids 35-40 g) ont été gardées dans une pièce sans agents pathogènes spécifiques à 25 °C dans un cycle sombre/lumière de 12 h et ont eu libre accès à de la nourriture et de l’eau autoclavées. Des souris néonatales, dans les 24 heures suivant la naissance (poids corporel moyen: 1,5-1,6 g), ont été sélectionnées pour le modèle BA de souris.
<ol><li>Préparer le RRV comme indiqué précédemment16. REMARQUE: En raison du mauvais état de survie des souris modèles, elles doivent être séparées à l’âge de 21 jours pour éviter qu’elles ne soient mordues ou même tuées par d’autres souris dans la même cage.</li>
	<li>Divisez les souris néonatales en trois groupes: le groupe témoin, le groupe RRV et le groupe RRV + anti-Ly6G. Injecter par voie intrapéritonéale aux souris néonatales 20 μL de RRV (titre: 1,5 x 106 UFP / mL) (groupe RRV) ou de solution saline (groupe témoin) dans les 24 heures suivant la naissance. Pour épuiser les cellules Gr-1+ , prétraiter chaque souris avec une injection intrapéritonéale de 5 μg d’anticorps anti-Ly6G 4 h avant l’injection de RRV. REMARQUE: La solution d’anticorps anti-Ly6G est conservée entre 2 et 8 °C et ne doit pas être congelée. Retirez l’anticorps avant utilisation et mettez-le à température ambiante pendant 30 minutes pour le réchauffer.</li>
	<li>Injecter 10 μg d’anticorps anti-Ly6G dans l’abdomen de la souris tous les 3 jours jusqu’au 12e jour après l’injection de RRV (Figure 1A).</li>
	<li>Vérifiez et notez l’apparence, le poids et la survie de toutes les souris quotidiennement.</li>
</ol>2. Injection intrapéritonéale des souris
<ol><li>Retirez les souris nouveau-nées de la cage. Utilisez une seringue à insuline de 1 mL pour injecter 20 μL de solution RRV ou 50 μL de solution d’anticorps anti-Ly6G. Pincez la peau du cou de la jeune souris avec l’index et le pouce d’une main, et tenez doucement les pattes postérieures de la souris avec l’annulaire et l’auriculaire pour exposer l’abdomen.</li>
	<li>Soulevez l’aiguille en pente ascendante. Insérez l’aiguille dans le milieu de la cuisse de la patte postérieure droite de la souris à un angle de 15° avec la peau. Après s’être déplacé le long du chemin sous-cutané jusqu’à ce que l’aiguille atteigne le bord costal droit de la souris, dirigez l’aiguille vers le bas dans la cavité abdominale. Ensuite, injectez le liquide sous le foie de la souris. REMARQUE: Les souris nouveau-nées ont leur estomac et leur rate dans l’abdomen gauche. Si une aiguille est insérée sur le côté gauche, il est facile de percer l’estomac ou de provoquer une hémorragie splénique.</li>
	<li>Retirez l’aiguille immédiatement après l’injection et observez s’il y a des saignements ou des fuites au site d’injection. S’il y en a, essuyez-le avec un coton autoclavé. Remettez la souris dans la cage de sa mère. REMARQUE: Afin de réduire l’influence des fuites de liquide pendant l’injection sur les résultats expérimentaux, assurez-vous que l’action d’injection est douce, retirez lentement l’aiguille et appuyez sur le site d’injection avec un coton-tige pendant 30 s.</li>
</ol>3. Prélèvement de l’échantillon de tissu
<ol><li>Au jour 12, anesthésiez les souris avec une inhalation d’isoflurane à 4% et disséquez-les au microscope. Insérez une seringue à insuline de 1 mL dans le ventricule gauche du cœur pour recueillir du sang. Après prélèvement sanguin, euthanasier les souris par inhalation d’isoflurane à 4% pendant 10 min. Centrifuger le sang à 400 × g pendant 5 min à température ambiante et séparer le sérum pour les mesures de la fonction hépatique. REMARQUE: Le prélèvement sanguin doit être effectué pendant que les souris sont vivantes. Si les souris meurent, le sang sera retenu dans les vaisseaux sanguins et ne pourra pas être collecté.</li>
	<li>Photographiez l’aspect général du foie et des voies biliaires. Ensuite, disséquez le foie et la rate de souris des tissus environnants avec des ciseaux et des pincettes. NOTE: Le foie et les autres tissus sont prélevés et réservés à -80 ° C pour l’extraction de l’ARN et des protéines ou trempés dans du formol à 10% pour la préparation de spécimens histologiques.</li>
</ol>4. Angiographie à la fluorescéine du canal biliaire extrahépatique
<ol><li>Après avoir euthanasié la souris, exposez entièrement le foie, la vésicule biliaire et les voies biliaires extrahépatiques avec des ciseaux et des cotons-tiges.</li>
	<li>Observez au microscope postal, injectez 5 à 10 μL du colorant fluorescent rhodamine 123 (20 mg/mL) dans la vésicule biliaire avec une seringue à insuline de 1 mL et prenez des photos. Ce processus est le même que celui rapporté dans unprécédent 16. NOTE: Différentes souris du même groupe sont utilisées pour le prélèvement de tissus et l’angiographie par fluorescence.</li>
</ol>5. Coloration H&E
<ol><li>Plongez le tissu hépatique frais de souris dans du formol à 10% pendant 24 h.</li>
	<li>Après avoir encastré le tissu dans la paraffine, utilisez un microtome de paraffine pour couper le bloc de paraffine en sections d’une épaisseur de 4 μm et placez deux sections consécutives sur la même lame. Un personnel expérimenté est nécessaire pour normaliser l’opération afin d’éviter les coupures de doigts17.</li>
	<li>Placez les tranches dans une grille de tranchage, dépaillez-les dans du xylène, hydratez-les successivement dans de l’éthanol absolu, de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 80%, de l’éthanol à 70% et de l’eau distillée, puis faites tremper chacune pendant 5 min.</li>
	<li>Colorer les sections avec une solution d’hématoxyline pendant 5 min et les faire tremper dans de l’acide chlorhydrique à 1% et de l’alcool à 75% pendant 5 s. Rincer les sections à l’eau claire et les colorer avec une solution d’éosine pendant 1 min.</li>
</ol>6. Coloration immunohistochimique CK19 et F4/80
<ol><li>Les trois premières étapes sont les mêmes que les étapes d’encastrement, de section et de déparaffinage des tissus dans la section de coloration H & E.</li>
	<li>Effectuer une réparation antigénique avec un tampon Tris-EDTA (10 mmol/L de Tris base, 1 mmol/L de solution EDTA, pH 9,0), chauffer les sections dans un four à micro-ondes à 95 °C pendant 10 min, puis les retirer et les refroidir naturellement à température ambiante.</li>
	<li>Placer les coupes de tissu dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 min pour éliminer la peroxydase endogène.</li>
	<li>Traiter les tranches avec du sérum de chèvre à 5% pour bloquer la liaison non spécifique.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps monoclonal primaire anti-souris anti-souris 19 ou anti-souris F4/80 chez le rat aux coupes et incuber pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Incuber les coupes avec les anticorps secondaires appropriés pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Utiliser la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comme agent chromogène pour observer la réaction chromogène au microscope.</li>
	<li>Observez les tranches au microscope 40x pour obtenir des images et analysez-les au besoin.</li>
</ol>7. Coloration rouge Sirius
<ol><li>Effectuez les trois premières étapes de l’encastrement, de la section et du déparaffinage des tissus, comme décrit dans la section coloration H&E.</li>
	<li>Une fois les sections de tissu contre-colorées avec de l’hématoxyline, couvrir chaque tissu avec 50 μL de solution de colorant rouge Sirius à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Sécher les lames naturellement à température ambiante pendant 4 h, ajouter une goutte de gomme neutre à chaque lame et utiliser une lame-couverture pour couvrir lentement le tissu afin d’éviter les bulles. Laisser les lames à température ambiante pendant 24 h pour solidifier la gomme neutre.</li>
	<li>Utilisez une microscopie à contraste polarisé pour observer les détails du dépôt de collagène; Sélectionnez un champ de vision clair et approprié, puis réglez la luminosité et la balance des blancs du champ visuel du microscope. Obtenez des images et analysez-les au besoin au microscope 40x.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans notre étude, nous avons utilisé des anticorps anti-Ly6G pour éliminer ou diminuer les cellules Gr-1+ dans un modèle murin d’atrésie biliaire infectée par le RRV afin d’améliorer le syndrome BA aigu, de prolonger le taux de survie et de permettre aux souris BA d’entrer dans la phase chronique. La réduction de la dose d’anticorps peut conduire à une BA chronique avec fibrose hépatique, ce qui indique que le nombre de cellules Gr-1+ modifie le résultat de BA dans les phases aiguë et chronique. Dans notre étude précédente, les cellules Gr-1+ ont été réduites après l’administration d’anticorps anti-Ly6G, et le statut de survie globale des souris BA a été amélioré15. Dans le même temps, il a été rapporté que les macrophages Gr-1+19, les neutrophiles Gr-1+20, les cellules myéloïdes Gr-1+ 21 et les granulocytes Gr-1+ peuvent améliorer la fibrose dans certains modèles animaux 22. Cependant, dans cette étude, les cellules Gr-1+ chez les souris ont été partiellement appauvries avec de faibles doses d’anticorps anti-Ly6G, et des dépôts de collagène sont restés. En conséquence, plus de temps peut être nécessaire pour traiter la maladie plus en profondeur.
L’application de l’anticorps anti-Ly6G a diminué l’inflammation, préservé partiellement les voies biliaires et empêché la mort aiguë induite par BA chez la souris. Cependant, seulement 20% à 30% des souris sont entrées dans la phase chronique de l’AB; cela peut être lié au point temporel et au nombre d’injections d’anticorps anti-Ly6G. Nous devons explorer davantage ce point clé pour améliorer le taux de réussite. En outre, nous considérons que non seulement les cellules Gr-1+ , mais aussi d’autres cellules immunitaires peuvent jouer un rôle important, telles que les cellules NK, les cellules T, les cellules B et les macrophages.
En ce qui concerne le protocole, certains détails doivent être notés. (i) Afin d’éviter les fuites de drogues injectables, nous utilisons une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 0,33 mm de diamètre, car le diamètre de l’aiguille est petit et le trou de l’aiguille dans la seringue est petit, ce qui est propice à réduire la possibilité de fuite de drogue. (ii) Avant l’injection, la souris doit être fixée pour l’empêcher de bouger, éviter les fuites de médicament et, ainsi, assurer davantage l’effet expérimental. (iii) Pendant l’injection du médicament, nous avons injecté le médicament dans la surface ou la marge inférieure du foie de souris autant que possible afin que le médicament pénètre dans l’abdomen et entre complètement en contact avec le foie pour faire effet. (iv) L’injection est généralement faite à partir de la cuisse supérieure droite de la souris, parce que l’estomac et la rate de la souris nouveau-née sont dans l’abdomen gauche, et l’estomac est plein de lait. Si l’aiguille est insérée du côté gauche, elle peut facilement percer l’estomac, provoquant l’écoulement du lait dans l’abdomen, ou perforer la rate, provoquant des saignements.
CD177 est un homologue de Ly6G, et l’expression de CD177 chez les patients atteints de BA a été étudiée. CD177 peut être utilisé comme marqueur pour le diagnostic précoce de l’AB chez les enfants, ce qui indique que les cellules CD177+ jouent un rôle important dans l’évolution de l’AB23. En analysant les données de séquençage de l’ARN, notre équipe a découvert que les cellules CD177 constituaient la population dominante de cellules Gr-1+ ; pendant ce temps, les souris Cd177−/− BALB/ c vaccinées avec le RRV ont montré un début retardé de BA et une réduction de la morbidité et de la mortalité18. Ainsi, notre modèle murin BA chronique présente des avantages évidents pour étudier la pathogenèse et la progression de la maladie de BA; il fournit également un modèle animal approprié pour étudier les traitements potentiels de l’AB.

L’atrésie biliaire (AB) est une maladie hépatobiliaire grave qui survient souvent chez les nourrissons et les jeunes enfants; Plus précisément, il se présente comme une cholangiopathie oblitérante avec ictère néonatal et selles pâles1. Ses caractéristiques cliniques sont la destruction inflammatoire des voies biliaires intrahépatiques et extrahépatiques et la fibrose progressive, qui finit par se transformer en insuffisance hépatique2. Selon les statistiques, l’incidence de BA dans les pays asiatiques est plus élevée que dans les pays européens et américains, et l’incidence de BA dans les pays asiatiques est de 1/8 000. L’étiologie de l’AB comprend une infection virale, un développement anormal des voies biliaires, des troubles immunitaires et des variations génétiques3. La chirurgie du Kasaï est la méthode la plus couramment utilisée pour améliorer la cholestase chez les enfants atteints de BA, mais en fin de compte, cela ne peut pas empêcher la progression de la fibrose4. Le traitement actuel de l’AB repose principalement sur la transplantation hépatique, qui est limitée par le manque de sources hépatiques. Une étude approfondie de la pathogenèse de l’AB est le moyen le plus direct de résoudre les défis de cette maladie. Cependant, les études sur la pathogenèse de l’AB reposent principalement sur des modèles animaux de l’AB, et il est crucial de sélectionner un modèle animal approprié.
La plupart des études histopathologiques sur l’AB ont montré que l’hyperplasie des voies biliaires (BDP), la thrombose biliaire et la fibrose de la veine porte sont les caractéristiques pathologiques les plus importantes de l’AB, et que d’autres caractéristiques pathologiques de différents grades existent en même temps, telles que l’infiltration de cellules inflammatoires portes et le gonflement des hépatocytes 5,6. À l’heure actuelle, il existe une variété de modèles murins qui imitent l’AB, tels que le modèle murin chronique nourri à la 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) avec obstruction segmentaire des voies biliaires et péricholangite impliquant les canaux biliaires extrahépatiques7 et le modèle murin de fibrose hépatique avec une injection intrapéritonéale de tétrachlorure de carbone8. Le modèle de ligature des voies biliaires (LDB) est caractérisé par une jaunisse et une fibrose rapide de la veine porte9. Le modèle murin nourri à l’alpha-naphtylisothiocyanate (ANIT) présente une cholangite confinée au canal biliaire intrahépatique et une lésion des hépatocytes10. Un modèle murin avec un ictère prolongé est induit par l’inoculation retardée du rotavirus rhésus (VRR)11. Bien qu’il existe une variété de modèles animaux, en particulier des modèles murins, chaque modèle a ses propres limites. Ils ne peuvent simuler qu’une partie des caractéristiques de la maladie de l’AB, telles que l’inflammation aiguë ou la fibrose hépatique dans le processus d’atrésie biliaire, et il n’existe aucun modèle très cohérent avec le processus pathologique et les caractéristiques pathologiques de l’AB.
Le modèle murin BA classique est induit par RRV, et ce modèle est le modèle le plus similaire à BA chez l’homme. Cependant, alors que les souris modèles de BA induites par le RRV présentent des symptômes cliniques et des caractéristiques pathologiques similaires à ceux de l’atrésie biliaire extrahépatique, ce modèle manque de fibrose hépatique, ce qui limite considérablement l’étude approfondie des mécanismes de l’AB et le développement de nouveaux traitements12. Par conséquent, cette étude a développé un nouveau modèle murin BA de fibrose hépatique chronique. L’anticorps anti-Ly6G a été injecté par voie intrapéritonéale avant l’inoculation du VRR le jour de la naissance. Ensuite, 5 à 10 μg d’anticorps anti-Ly6G ont été injectés quatre fois, avec des intervalles de 2 jours entre chaque injection. Les symptômes BA des souris ont été améliorés, le temps de survie a été prolongé et les souris sont entrées dans le stade de fibrose chronique. Ce modèle simule non seulement la réponse de phase aiguë de l’AB, mais imite également les processus du foie et de la fibrose progressive. Ainsi, il s’agit d’un modèle animal plus approprié pour l’étude mécaniste de l’AB, et il pourrait fournir une base théorique pour le développement de futurs traitements pour l’AB.
La molécule Gr-1 est un marqueur de surface cellulaire dérivé de myéloïdes qui s’est initialement exprimé dans les neutrophiles13. L’épuisement des anticorps anti-Ly6G réduit les neutrophiles circulants de plus de 90% et modifie la réponse activée par d’autres cellules immunitaires. Les fonctions des populations de cellules Gr-1+ ont été rapportées dans diverses études utilisant des anticorps de piégeage spécifiques, avec des effets variables identifiés sur les cytokines et la protection immunitaire médiée14. Nous avons étudié la fonction des cellules Gr-1+ dans des modèles murins BA inoculés par RRV. Cependant, comme la molécule Gr-1 n’a pas été exprimée chez l’homme, une molécule similaire, CD177, a été étudiée chez les patients BA15. Nos données prouvent l’importance des populations de cellules Gr-1+ , en particulier dans la phase fibrotique chronique de la maladie, et fournissent un modèle animal approprié pour étudier les thérapies potentielles de l’AB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

L’atrésie biliaire (AB) est une maladie mortelle impliquant un ictère obstructif, et c’est l’indication la plus courante pour la transplantation hépatique chez les enfants. En raison de l’étiologie complexe et de la pathogenèse inconnue, il n’existe toujours pas de traitements médicamenteux efficaces. À l’heure actuelle, le modèle murin classique BA induit par le rotavirus rhésus (RRV) est le modèle le plus couramment utilisé pour étudier la pathogenèse de l’AB. Ce modèle se caractérise par un retard de croissance, une jaunisse de la peau et des muqueuses, des selles argileuses et une urine jaune foncé. L’histopathologie montre une inflammation hépatique sévère et une obstruction des voies biliaires intrahépatiques et extrahépatiques, qui sont similaires aux symptômes de l’AB humaine. Cependant, les foies des souris en phase terminale dans ce modèle manquent de fibrose et ne peuvent pas simuler complètement les caractéristiques de la fibrose hépatique dans l’AB clinique. L’étude présentée a développé un nouveau modèle murin BA de fibrose hépatique chronique en injectant 5-10 μg d’anticorps anti-Ly6G quatre fois, avec des intervalles de 2 jours après chaque injection. Les résultats ont montré que certaines des souris ont réussi à former une BA chronique avec une fibrose typique après le laps de temps, ce qui signifie que ces souris représentent un modèle animal approprié pour l’étude mécaniste de la fibrose hépatique induite par le virus de l’AB et une plate-forme pour le développement de futurs traitements BA .

Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 5 μg d’anticorps anti-Ly6G dans les 24 heures suivant la naissance, puis une injection intrapéritonéale de 20 μL de RRV 4 heures plus tard. Ensuite, 10 μg d’anticorps anti-Ly6G ont été injectés tous les 3 jours jusqu’au jour 12 (Figure 1A). Le temps de survie médian dans le groupe RRV était de 13 jours. Au contraire, la plupart des souris traitées avec l’anticorps ont développé un léger ictère, et aucune perte de poids n’a été observée (Figure 1C). Environ 20% à 30% des souris avaient le syndrome BA avec jaunisse à long terme et faible poids corporel, mais ont survécu pendant plus de 42 jours. Après un traitement par anticorps anti-Ly6G, le nombre de cellules Gr-1+ a diminuéde 15 et les souris sont entrées dans le stade de la fibrose chronique, appelée BA. Des échantillons ont été prélevés au jour 12 et au jour 42, et les tranches de tissu colorées avec Sirius Red ont montré une augmentation progressive de la fibrose hépatique. Les souris BA chroniques survivant pendant 42 jours ont été utilisées pour des analyses détaillées. En plus de la petite taille, les oreilles, les pattes et la peau de la queue présentaient une jaunisse marquée (flèches bleues sur la figure 1E). Le jour 6 après l’injection de RRV, la couleur des matières fécales des souris est devenue plus claire et la couleur de l’urine est devenue plus foncée; cela est devenu significativement différent du groupe témoin le jour 12, lorsque les souris du groupe RRV ont montré des matières fécales blanches et une urine jaune foncé. Au jour 42, l’urine et les matières fécales des souris BA chroniques présentaient également des caractéristiques évidentes de jaunisse (Figure 1D,E). Les foies des souris BA ont été prélevés et comparés à ceux des témoins. Les foies étaient plus petits (figure 2B), des lésions nécrotiques étaient visibles à l’œil nu (figure 2A, triangle noir) et un segment d’atrésie des voies biliaires a également été observé de façon extrahépatique (figure 2A, astérisques blancs).
L’analyse de la coupe du tissu hépatique a montré que le traitement anti-Ly6G à faible dose diminuait l’inflammation de la veine porte. Cependant, une accumulation de cellules inflammatoires a encore été observée dans les tranches de tissu hépatique au jour 42 (figure 3A). La coloration rouge de Sirius a montré une légère augmentation du dépôt de collagène dans la région porte le jour 12 après l’injection de RRV. De plus, aucun changement significatif n’a été observé dans l’expression du collagène après traitement avec l’anticorps anti-Ly6g, mais l’expression de collagène dans les échantillons de tissus BA au jour 42 a été significativement augmentée (Figure 3B). Lors de l’examen au microscope à lumière polarisée, il a été observé que des fibres de collagène s’étaient accumulées dans le tissu hépatique adjacent. Un dépôt substantiel de collagène, principalement vert, a été observé dans les échantillons de tissus BA au jour 42 (Figure 3C), et le dépôt de collagène a encore augmenté chez les souris qui ont survécu pendant 42 jours sans gain de poids. Avec la réduction de l’inflammation portale, les cellules des canaux biliaires CK19+ ont été observées au jour 12. Au jour 42, cependant, les voies biliaires matures étaient à peine détectables, même si une augmentation des cellules des canaux biliaires CK19+ a été observée (Figure 4A, les flèches rouges indiquent les cellules épithéliales des canaux biliaires). Dans le cas des voies biliaires extrahépatiques chez les souris atteintes d’AB chronique, la dissection en série de la région porte des souris a révélé que les voies biliaires extrahépatiques étaient bloquées et présentaient des infiltrats inflammatoires de macrophages (Figure 4B, les flèches noires indiquent les macrophages).
Par rapport au RRV seul, le traitement avec une faible dose d’anticorps anti-Ly6G a diminué les lésions hépatiques en termes de taux d’enzymes hépatiques au jour 12 après l’inoculation du RRV. Les taux d’alanine aminotransférase et de phosphatase alcaline dans le foie étaient plus élevés dans le groupe BA chronique que dans le groupe témoin normal. Les changements les plus prononcés ont été observés dans les taux de bilirubine, les souris RRV + anti-Ly6G montrant des taux réduits de TBIL, DBIL et IBIL dans le BA aigu contrairement au RRV seul. Chez les souris atteintes d’AB chronique, les taux de TBIL, DBIL et IBIL ont augmenté (Figure 5), ce qui indique que la fonction hépatique était significativement réduite au stade de fibrose chronique de l’AB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> Figure 1 : Effets du traitement par anticorps anti-Ly6G dans un modèle murin d’atrésie biliaire infectée par le VRR. (A) Illustration schématique de faibles doses d’anticorps induisant une phase BA aiguë et chronique chez la souris avec des flèches indiquant le moment de l’injection de l’anticorps et du VRR. (B) Courbes de survie des souris du groupe témoin normal (suite), du groupe rotavirus rhésus (RRV) et du groupe anticorps RRV + anti-Ly6G. (C) Courbes de poids corporel des souris de chaque groupe. (D) Des images représentatives des souris, de leurs excréments et de leur urine dans chaque groupe au jour 12. (E) Des images représentatives des souris, de leurs excréments et de leur urine dans chaque groupe au jour 42. Les flèches bleues indiquent les oreilles et la queue jaunes. Cette figure a été reproduite avec la permission de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> Figure 2 : Effets du traitement par anticorps anti-Ly6G sur le foie dans un modèle murin d’atrésie biliaire infectée par le RRV. (A) Comparaison de l’anatomie du foie et de l’angiographie par fluorescence extrahépatique des voies biliaires entre des souris BA chroniques (à droite) et des souris normales au jour 42. (B) Comparaison de la taille du foie entre les souris BA chroniques et les souris normales. Le triangle noir indique une nécrose hépatique chez les souris atteintes d’AB chronique. L’astérisque blanc indique une atrésie biliaire extrahépatique. Cette figure a été reproduite avec la permission de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> Figure 3 : Tranches de tissu hépatique des souris du groupe témoin normal (suite), du groupe du rotavirus rhésus (RRV) et du groupe des anticorps RRV + anti-Ly6G au jour 12 et au jour 42. (A) Images de coupes de tissu hépatique colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E). (B) La coloration rouge Sirius a montré un dépôt de collagène (PSR). (C) Observation plus poussée des tranches par microscopie à lumière polarisée (Pol. Light). Abréviation : PV = veine porte. Barre d’échelle = 50 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> Figure 4 : Coloration immunohistochimique de tranches de tissu hépatique du groupe témoin normal (suite), du groupe rotavirus rhésus (RRV) et du groupe anticorps RRV + anti-Ly6G au jour 12 et au jour 42. (A) L’expression du marqueur des cellules épithéliales des canaux biliaires (CK19) dans différents groupes de traitement. (B) L’infiltration de macrophages par des cellules inflammatoires a été démontrée dans différents groupes de traitement. Abréviation : PV = veine porte. La flèche rouge indique les cellules épithéliales des voies biliaires. La flèche noire indique les macrophages. Barre d’échelle = 50 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> Figure 5 : Comparaison de la fonction hépatique chez des souris de différents groupes de traitement. Le sang de souris a été prélevé après l’expérience et testé dans le département de laboratoire de l’hôpital. Chaque groupe contenait trois à cinq souris. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abréviations : ALT = alanine aminotransférase; AST = aspartate aminotransférase; PA = phosphatase alcaline; TBIL = bilirubine totale; DBIL = bilirubine directe; IBIL = bilirubine indirecte. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Nous avons établi un modèle murin de fibrose hépatique chronique, qui fournit un modèle animal approprié pour l’étude mécaniste de la fibrose hépatique induite par le virus de l’atrésie biliaire (AB) et une plate-forme pour les futurs traitements de l’AB.

Un modèle murin de fibrose hépatique chronique pour l’étude de l’atrésie biliaire

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour créer un modèle murin plus cohérent avec les changements pathologiques de l’atrésie biliaire. Cette technique peut simuler les symptômes de l’atrésie biliaire aiguë et chronique, ce qui est utile pour la recherche future sur le mécanisme de la maladie. Après l’utilisation d’anticorps, le temps de survie des souris a été prolongé et les symptômes ont été atténués, suggérant l’effet thérapeutique de l’anticorps sur l’atrésie biliaire.Après avoir divisé les souris néonatales en différents groupes, comme décrit dans le manuscrit, prétraiter chaque souris avec une injection intrapéritonéale de cinq microgrammes d’anticorps anti-Ly6G quatre heures avant l’injection de rotavirus rhésus ou RRV pour épuiser les cellules Gr1-positives. Dans les 24 heures suivant la naissance, injectez par voie intrapéritonéale à la souris néonatale 20 microlitres de rotavirus rhésus ou de solution saline. Après l’injection de RRV, administrer 20 microgrammes d’anticorps anti-Ly6G dans l’abdomen de la souris.Vérifiez et notez l’apparence, le poids et la survie de toutes les souris quotidiennement. Pour l’injection intrapéritonéale, exposer l’abdomen de la jeune souris en pinçant la peau du cou avec l’index et le pouce d’une main et en tenant doucement les pattes postérieures de la souris avec l’annulaire et l’auriculaire. Soulevez l’aiguille de la seringue vers le haut et insérez l’aiguille dans le milieu de la cuisse arrière droite de la souris à un angle de 15 degrés avec la peau.Tout en déplaçant l’aiguille le long du chemin sous-cutané jusqu’à ce qu’elle atteigne le bord costal droit de la souris, dirigez l’aiguille vers le bas dans la cavité abdominale et injectez le liquide sous le foie de la souris. Retirez l’aiguille immédiatement après l’injection. Observez s’il y a des saignements ou des fuites au site d’injection.Après avoir anesthésié la souris le 12ème jour, disséquez-la au microscope. Insérez une seringue d’insuline d’un millilitre dans le ventricule gauche du cœur pour recueillir du sang. Centrifuger le sang à 400 g pendant cinq minutes à température ambiante et séparer le sérum pour les mesures de la fonction hépatique.Disséquer le foie et la rate de souris des tissus environnants à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler. Photographiez l’aspect général du foie et des voies biliaires. Après l’anesthésie par inhalation, exposer le foie, la vésicule biliaire et les voies biliaires extrahépatiques avec des ciseaux et des cotons-tiges.Sous un microscope postal, injectez cinq à 10 microlitres du colorant fluorescent Rhodamine 123 dans la vésicule biliaire avec une seringue à insuline d’un millilitre et prenez des photos. Immergez le tissu hépatique frais de souris dans du formol à 10% pendant 24 heures. Une fois que le tissu est incorporé dans la paraffine, utilisez un microtome de paraffine pour couper le bloc de paraffine en sections d’une épaisseur de quatre micromètres et placez deux sections consécutives sur la même lame.Placez ensuite les tranches dans une grille de tranchage, dépaillez-les dans du xylène et hydratez-les successivement dans de l’éthanol absolu, de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 80%, de l’éthanol à 70% et de l’eau distillée pendant cinq minutes chacune. Colorez les sections avec une solution d’hématoxyline pendant cinq minutes et faites-les tremper dans de l’acide chlorhydrique à 1% et de l’alcool à 75% pendant cinq secondes. Après avoir rincé les sections à l’eau claire, colorez-les avec une solution d’éosine pendant une minute.Préparer les coupes de tissu pour la coloration, comme démontré précédemment, et effectuer la réparation de l’antigène avec le tampon Tris-EDTA. Chauffer les sections dans un four à micro-ondes à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis les retirer et les refroidir naturellement à température ambiante. Pour éliminer la peroxydase endogène, placez les sections de tissu dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes et traitez les tranches avec du sérum de chèvre à 5 % pour bloquer la liaison non spécifique.Ensuite, ajoutez l’anticorps monoclonal primaire anti-souris Cytokeratin 19 ou Rat anti-souris F4 / 80 aux sections, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Incuber les sections avec les anticorps secondaires appropriés pendant 30 minutes à température ambiante. Utilisez la 3, 3-prime-diaminobenzidine comme agent chromogène pour observer la réaction chromogène au microscope.Observez les tranches au microscope 40x pour obtenir des images et les analyser au besoin. Une fois les sections de tissu préparées et contre-colorées avec de l’hématoxyline, couvrir chaque tissu avec 50 microlitres de solution de colorant rouge sirius à température ambiante pendant une heure. Séchez les lames naturellement à température ambiante pendant quatre heures, ajoutez une goutte de gomme neutre à chaque lame et utilisez un couvercle pour couvrir le tissu afin d’éviter les bulles.Laissez les lames à température ambiante pendant 24 heures pour solidifier la gomme neutre. Observez les détails du dépôt de collagène à l’aide de la microscopie à contraste polarisé. Sélectionnez un champ de vision clair et approprié, et ajustez la luminosité et la balance des blancs du champ visuel du microscope.Obtenez des images et analysez-les au besoin sous un microscope 40x. Après l’injection de RRV, le temps de survie médian dans le groupe RRV était de 13 jours. La plupart des souris traitées avec l’anticorps ont développé une légère jaunisse et aucune perte de poids n’a été observée.Le foie des souris BA présentait des lésions nécrotiques et un segment extrahépatique d’atrésie des voies biliaires. La taille du foie est plus petite que celle des témoins. L’analyse histologique a montré que le traitement anti-Ly6G à faible dose diminuait l’inflammation de la veine porte.Une accumulation de cellules inflammatoires a encore été observée dans les tranches de tissu hépatique au jour 42. Le jour 12, il y avait une légère augmentation des dépôts de collagène dans la région portail. Au jour 42, l’expression du collagène a été significativement augmentée et un dépôt substantiel de collagène a été observé dans le tissu BA.Les cellules CK19-positives ont été observées au jour 12. Au jour 42, les cellules CK19-positives ont augmenté, mais il y avait peu de voies biliaires matures. Les voies biliaires extrahépatiques chez les souris BA chroniques étaient bloquées et présentaient des infiltrats inflammatoires de microphages.Les taux d’ALT et d’ALP dans le foie étaient plus élevés dans le groupe BA chronique que dans le groupe témoin normal. Les taux de bilirubine totale, de bilirubine directe et de bilirubine indirecte ont augmenté, ce qui indique que la fonction hépatique était significativement réduite au stade de la fibrose chronique de l’AB. L’injection doit être faite avec prudence pour ne pas percer le foie de souris. Après l’injection, nous devrions prendre environ 10 secondes pour observer l’état de la souris et nettoyer le sang de la plaie.

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