Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81974056) לר.ז. ומהקרן הלאומית לנוער הטבע של סין (82101808) ופרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה של גואנגז'ו (מס '202102020196) לז.ל.

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז בעלי החיים הביו-רפואיים בגואנגז'ו יונגנו (IACUC-AEWC-F2208020), שם בוצעו כל הניסויים בבעלי חיים.
1. ביסוס מודל עכבר BA פיברוטי כרוני
הערה: כל בעלי החיים הוחזקו בסביבה ספציפית נטולת פתוגן (SPF) באותו חדר, והניסויים נערכו בסביבה קונבנציונלית. עכברי BALB/c ביום ה-12.5 להריון (גיל: 10-12 שבועות; משקל 35-40 גרם) הוחזקו בחדר ללא פתוגנים ספציפיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס תחת מחזור חושך/אור של 12 שעות, וקיבלו גישה חופשית למזון ומים אוטומטיים. עכברי יילודים, תוך 24 שעות לאחר הלידה (משקל גוף ממוצע: 1.5-1.6 גרם), נבחרו לדגם BA של עכבר.
<ol><li>הכינו RRV כפי שדווח בעבר16. הערה: בשל מצב ההישרדות הנמוך של עכברי המודל, יש להפריד אותם בגיל 21 יום כדי למנוע מהם להינשך או אפילו להיהרג על ידי עכברים אחרים באותו כלוב.</li>
	<li>חלקו עכברים יילודים לשלוש קבוצות: קבוצת הביקורת, קבוצת RRV וקבוצת RRV + anti-Ly6G. הזריקו תוך צפקית לעכברים בילודים 20 μL של RRV (titer: 1.5 x 106 PFU/mL) (קבוצת RRV) או מלוחים (קבוצת ביקורת) תוך 24 שעות לאחר הלידה. כדי לרוקן תאי Gr-1+ , יש לטפל בכל עכבר בהזרקה תוך צפקית של 5 מיקרוגרם נוגדן נגד Ly6G 4 שעות לפני הזרקת RRV. הערה: תמיסת נוגדנים נגד Ly6G מאוחסנת ב 2-8 ° C ואין להקפיא אותה. הוציאו את הנוגדן לפני השימוש והניחו אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להתחמם.</li>
	<li>הזריקו 10 מיקרוגרם של נוגדן נגד Ly6G לתוך בטנו של העכבר כל 3 ימים עד היום ה-12 לאחר הזרקת RRV (איור 1A).</li>
	<li>בדוק ותעד את המראה, המשקל וההישרדות של כל העכברים מדי יום.</li>
</ol>2. הזרקה intraperitoneal של העכברים
<ol><li>הוציאו עכברים שזה עתה נולדו מהכלוב. השתמש מזרק אינסולין 1 מ"ל כדי להזריק 20 μL של תמיסת RRV או 50 μL של תמיסת נוגדנים נגד Ly6G. צבוט את עור הצוואר של העכבר הצעיר עם האצבע המורה והאגודל של יד אחת, והחזק בעדינות את רגליו האחוריות של העכבר עם אצבע הטבעת ואצבע הזנב כדי לחשוף את הבטן.</li>
	<li>הרימו את המחט בשיפוע כלפי מעלה. הכנס את המחט לירך האמצעית של הרגל האחורית הימנית של העכבר בזווית של 15° עם העור. לאחר תנועה לאורך השביל התת עורי עד שהמחט מגיעה לקצה הקוסטלי הימני של העכבר, כוונו את המחט כלפי מטה לתוך חלל הבטן. לאחר מכן, להזריק את הנוזל מתחת לכבד של העכבר. הערה: לעכברים שזה עתה נולדו יש בטן וטחול בבטן השמאלית. אם מחט מוכנס בצד שמאל, קל לחדור את הבטן או לגרום לדימום טחול.</li>
	<li>משוך את המחט החוצה מיד לאחר ההזרקה, וצפה לדימום או דליפה במקום ההזרקה. אם יש כזה, לנגב אותו עם כותנה autoclaved. החזירו את העכבר לכלוב אמו. הערה: על מנת להפחית את השפעת דליפת הנוזלים במהלך ההזרקה על תוצאות הניסוי, יש לוודא שפעולת ההזרקה עדינה, להסיר באיטיות את המחט וללחוץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן למשך 30 שניות.</li>
</ol>3. איסוף רקמת דגימה
<ol><li>ביום ה-12 מרדימים את העכברים בשאיפת איזופלורן 4%, ומנתחים אותם תחת מיקרוסקופ. הכנס מזרק אינסולין 1 מ"ל לחדר השמאלי של הלב כדי לאסוף דם. לאחר איסוף הדם, יש להרדים את העכברים על ידי שאיפה של 4% איזופלורן למשך 10 דקות. צנטריפוגו את הדם ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהפריד את הסרום למדידות תפקודי כבד. הערה: איסוף הדם חייב להתבצע כל עוד העכברים בחיים. אם העכברים ימותו, הדם יישמר בכלי הדם ולא ניתן יהיה לאסוף.</li>
	<li>צלם את המראה הכללי של הכבד וצינור המרה. לאחר מכן, לנתח את כבד העכבר ואת הטחול מן הרקמות שמסביב עם מספריים פינצטה. הערה: הכבד ורקמות אחרות נאספים ונשמרים בטמפרטורה של -80°C למיצוי RNA וחלבונים או מושרים ב-10% פורמלין להכנת דגימות היסטולוגיות.</li>
</ol>4. אנגיוגרפיה פלואורסצאין של צינור המרה החוץ כבד
<ol><li>לאחר המתת העכבר, חשוף לחלוטין את הכבד, כיס המרה וצינורות המרה החוץ-כבדיים בעזרת מספריים וצמר גפן.</li>
	<li>התבונן תחת מיקרוסקופ יציבה, להזריק 5-10 μL של צבע פלואורסצנטי רודאמין 123 (20 מ"ג / מ"ל) לתוך כיס המרה עם מזרק אינסולין 1 מ"ל, ולצלם. תהליך זה זהה לזה שדווחב-16 בעבר. הערה: עכברים שונים באותה קבוצה משמשים לאיסוף רקמות הדגימה ולאנגיוגרפיה פלואורסצנטית.</li>
</ol>5. צביעת יד
<ol><li>טבלו רקמת כבד עכבר טרייה ב-10% פורמלין למשך 24 שעות.</li>
	<li>לאחר הטמעת הרקמה בפרפין, השתמשו במיקרוטום פרפין כדי לחתוך את גוש הפרפין למקטעים בעובי של 4 מיקרומטר, והניחו שני מקטעים רצופים על אותה שקופית. כוח אדם מנוסה נדרש לתקנן את הפעולה כדי למנוע חתכים באצבע17.</li>
	<li>הכניסו את הפרוסות למדף חיתוך, טבלו אותן בשעווה בקסילן, רשמו אותן ברצף באתנול מוחלט, 95% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים, והשרו בכל אחת מהן למשך 5 דקות.</li>
	<li>מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות, ומשרים אותם בחומצה הידרוכלורית 1% ואלכוהול 75% למשך 5 שניות. יש לשטוף את המקטעים במים נקיים ולהכתים בתמיסת אאוזין למשך דקה.</li>
</ol>6. צביעה אימונוהיסטוכימית CK19 ו-F4/80
<ol><li>שלושת השלבים הראשונים זהים לשלבים של הטבעה, חתך והסרת שעווה במקטע צביעת H&E.</li>
	<li>בצע תיקון אנטיגן עם חיץ Tris-EDTA (בסיס טריס 10 mmol / L, 1 mmol / L תמיסת EDTA, pH 9.0), חמם את החלקים בתנור מיקרוגל ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר ולקרר אותם באופן טבעי לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הניחו את חלקי הרקמה בתמיסת מי חמצן 3% למשך 10 דקות כדי להסיר פרוקסידז אנדוגני.</li>
	<li>טפלו בפרוסות עם סרום עיזים 5% כדי לחסום קשירה לא ספציפית.</li>
	<li>הוסף נוגדן חד-שבטי ראשוני נגד עכבר מסוג cytokeratin 19 או נוגדן חד-שבטי F4/80 נגד עכבר לחלקים, ודגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>יש לדגור על המקטעים עם נוגדנים משניים מתאימים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השתמש 3,3'-diaminobenzidine (DAB) כסוכן כרומוגני כדי לצפות בתגובה הכרומוגנית תחת המיקרוסקופ.</li>
	<li>התבוננו בפרוסות תחת מיקרוסקופ 40x כדי לקבל תמונות, ונתחו אותן לפי הצורך.</li>
</ol>7. סיריוס מכתים אדום
<ol><li>בצע את שלושת השלבים הראשונים של הטבעה, חתך והסרת שעווה מרקמה כמתואר בסעיף צביעת H&E.</li>
	<li>לאחר שחלקי הרקמה מוכתמים בהמטוקסילין, כסו כל רקמה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת צבע אדום של סיריוס בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
	<li>יבשו את המגלשות באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, הוסיפו טיפת מסטיק ניטרלי לכל מגלשה והשתמשו בכיסוי כדי לכסות את הרקמה באיטיות כדי למנוע בועות. השאירו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי למצק את המסטיק הניטרלי.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ אור ניגודיות מקוטב כדי לבחון את הפרטים של תצהיר קולגן; בחרו שדה ראייה ברור ומתאים, והתאימו את הבהירות והאיזון הלבן של שדה הראייה של המיקרוסקופ. קבל תמונות, ונתח אותן לפי הצורך תחת מיקרוסקופ 40x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lakshminarayanan, B., Davenport, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+A+comprehensive+review.">Biliary atresia: A comprehensive review.</a> Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).</li><li>Bassett, M. D., Murray, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+Recent+progress.">Biliary atresia: Recent progress.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).</li><li>Bezerra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia:+Clinical+and+research+challenges+for+the+twenty-first+century.">Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century.</a> Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).</li><li>Lee, W. S., Looi, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+a+scoring+system+in+the+interpretation+of+histology+in+neonatal+cholestasis.">Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis.</a> World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).</li><li>Russo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+histopathologic+features+of+liver+biopsies+that+distinguish+biliary+atresia+from+other+causes+of+infantile+cholestasis+and+their+correlation+with+outcome:+A+multicenter+study.">Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).</li><li>Fickert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+animal+models+for+primary+sclerosing+cholangitis+(PSC).">Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC).</a> Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia-specific+deciduous+pulp+stem+cells+feature+biliary+deficiency.">Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency.</a> Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).</li><li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+contributes+to+cholangiocyte+proliferation+and+cholestatic+liver+fibrosis+in+biliary+atresia.">Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia.</a> Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).</li><li>Desmet, V. J., Krstulovi&#263;, B., Van Damme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+(ANIT)+induced+cholestasis.">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li><li>Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+signatures+associated+with+survival+times+of+pediatric+patients+with+biliary+atresia+identify+potential+therapeutic+agents.">Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents.</a> Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).</li><li>Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+biliary+injury+and+altered+bile+acid+metabolism.">Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).</li><li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1(+)+cell+subpopulations+during+microbial+infection.">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).</li><li>McDermott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Gr-1(+)+cells+and+tumour+necrosis+factor-&#945;+signalling+during+Clostridium+difficile+colitis+in+mice.">The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-&#945; signalling during Clostridium difficile colitis in mice.</a> Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neonatal+Gr-1(+)+myeloid+cells+in+a+murine+model+of+rhesus-rotavirus-induced+biliary+atresia.">The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia.</a> The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+nanoparticle+method+for+ameliorating+biliary+atresia+syndrome+in+mice.">A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).</li><li>Sy, J., Ang, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtomy:+Cutting+formalin-fixed,+paraffin-embedded+sections.">Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD177(+)+cells+produce+neutrophil+extracellular+traps+that+promote+biliary+atresia.">CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia.</a> Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).</li><li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+reduces+kidney+fibrosis+by+inhibiting+local+proliferation+of+profibrotic+macrophages.">CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages.</a> Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+murine+model+of+systemic+sclerosis:+Bleomycin+given+by+pump+infusion+induced+skin+and+pulmonary+inflammation+and+fibrosis.">A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis.</a> Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sorafenib+on+liver+versus+tumor+fibrosis+mediated+by+stromal-derived+factor+1+alpha/C-X-C+receptor+type+4+axis+and+myeloid+differentiation+antigen-positive+myeloid+cell+infiltration+in+mice.">Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice.</a> Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).</li><li>Tomasson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+myeloproliferation,+induced+in+mice+by+TEL/PDGFbetaR+expression,+depends+on+PDGFbetaR+tyrosines+579/581.">Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581.</a> Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).</li><li>Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+CD177(+)+cells+as+an+early+diagnostic+marker+for+biliary+atresia:+A+prospective+multicentre+study+in+pediatric+patients+with+cholestasis.">Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis.</a> Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במחקר שלנו, השתמשנו בנוגדן נגד Ly6G כדי לחסל או להקטין תאי Gr-1+ במודל עכברי של אטרזיה מרה נגועה ב- RRV כדי לשפר תסמונת BA חריפה, להאריך את שיעור ההישרדות ולאפשר לעכברי BA להיכנס לשלב הכרוני. הפחתת מינון הנוגדנים עלולה להוביל ל-BA כרוני עם פיברוזיס בכבד, מה שמצביע על כך שמספר תאי Gr-1+ משנה את התוצאה של BA בשלבים החריפים והכרוניים. במחקר הקודם שלנו, תאי Gr-1+ הופחתו לאחר מתן נוגדן נגד Ly6G, ומצב ההישרדות הכולל של עכברי BA השתפר15. במקביל, דווח כי Gr-1+ מקרופאגים19, Gr-1+ נויטרופילים20, Gr-1+ תאים מיאלואידים 21, וגרנולוציטים Gr-1+ יכולים לשפר פיברוזיס בכמה מודלים של בעלי חיים 22. עם זאת, במחקר זה, תאי Gr-1+ בעכברים הידלדלו חלקית עם מינונים נמוכים של נוגדן נגד Ly6G, ומשקעי קולגן נשארו. כתוצאה מכך, ייתכן שיהיה צורך בזמן רב יותר כדי לטפל במחלה בצורה יסודית יותר.
השימוש בנוגדן נגד Ly6G הפחית דלקת, שמר חלקית על צינורות המרה ומנע מוות חריף כתוצאה מ-BA בעכברים. עם זאת, רק 20% עד 30% מהעכברים נכנסו לשלב הכרוני של BA; זה עשוי להיות קשור לנקודת הזמן ולמספר הזריקות של נוגדן נגד Ly6G. אנחנו צריכים להמשיך לחקור את נקודת המפתח הזאת כדי לשפר את שיעור ההצלחה. נוסף על כך, אנו לוקחים בחשבון שלא רק תאי Gr-1+ אלא גם תאי חיסון אחרים עשויים למלא תפקידים חשובים, כמו למשל תאי NK, תאי T, תאי B ומקרופאגים.
באשר לפרוטוקול, יש לציין כמה פרטים. (i) על מנת למנוע דליפה של תרופות מוזרקות, אנו משתמשים במזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט בקוטר 0.33 מ"מ, מכיוון שקוטר המחט קטן, וחור המחט לתוך המזרק קטן, מה שתורם להפחתת האפשרות לדליפת סמים. (ii) לפני ההזרקה, יש לתקן את העכבר כדי למנוע ממנו לזוז, למנוע דליפת סמים, ובכך להבטיח עוד יותר את אפקט הניסוי. (iii) במהלך הזרקת התרופה הזרקנו את התרופה לפני השטח או בשוליים התחתונים של כבד העכבר ככל האפשר, כך שהתרופה נכנסה לבטן ונכנסה למגע מלא עם הכבד כדי להיכנס לתוקף. (iv) ההזרקה נעשית בדרך כלל מהירך הימנית העליונה של העכבר, מכיוון שהקיבה והטחול של העכבר שזה עתה נולד נמצאים בבטן השמאלית, והקיבה מלאה בחלב. אם המחט מוחדרת מצד שמאל, היא יכולה בקלות לנקב את הבטן, לגרום לחלב לזרום לתוך הבטן, או לנקב את הטחול, גרימת דימום.
CD177 הוא הומולוג של Ly6G, והביטוי של CD177 בחולי BA נחקר. CD177 יכול לשמש כסמן לאבחון מוקדם של BA בילדים, מה שמצביע על כך שתאי CD177+ ממלאים תפקיד משמעותי במהלך BA23. על ידי ניתוח נתוני ריצוף הרנ"א, הצוות שלנו מצא כי תאי CD177 היו האוכלוסייה הדומיננטית של תאי Gr-1+ ; בינתיים, Cd177−/− עכברי BALB/ c שחוסנו ב-RRV הראו התפרצות מאוחרת של BA וירידה בתחלואה ותמותה18. לפיכך, למודל עכבר ה-BA הכרוני שלנו יש יתרונות ברורים לחקר הפתוגנזה והתקדמות המחלה של BA; הוא גם מספק מודל מתאים של בעלי חיים לחקר טיפולים פוטנציאליים לתואר ראשון.

אטרזיה מרה (BA) היא מחלת כבד חמורה המתרחשת לעתים קרובות אצל תינוקות וילדים צעירים; באופן ספציפי, הוא מציג כ cholangiopathy obliterative עם צהבת יילודים וצואה חיוורת1. המאפיינים הקליניים שלה הם הרס דלקתי של צינורות המרה intrahepatic ו extrahepatic פיברוזיס פרוגרסיבי, אשר בסופו של דבר מתפתח לאי ספיקת כבד2. על פי הסטטיסטיקה, התחלואה בתואר ראשון במדינות אסיה גבוהה יותר מאשר במדינות אירופה ואמריקה, והתחלואה בתואר ראשון במדינות אסיה היא 1/8,000. האטיולוגיה של BA כוללת זיהום ויראלי, התפתחות לא תקינה של דרכי המרה, הפרעות חיסוניות ווריאציות גנטיות3. ניתוח קאסאי הוא השיטה הנפוצה ביותר לשיפור cholestasis אצל ילדים עם BA, אבל בסופו של דבר, זה לא יכול למנוע את התקדמות פיברוזיס4. הטיפול הנוכחי בתואר ראשון מסתמך בעיקר על השתלת כבד, המוגבלת בשל היעדר מקורות כבד. מחקר מעמיק של הפתוגנזה של BA הוא האמצעי הישיר ביותר כדי לפתור את האתגרים של מחלה זו. עם זאת, מחקרים על הפתוגנזה של BA מסתמכים בעיקר על מודלים של בעלי חיים BA, וחשוב לבחור מודל מתאים של בעלי חיים.
רוב המחקרים ההיסטופתולוגיים של BA הראו כי היפרפלזיה של דרכי המרה (BDP), פקקת מרה ופיברוזיס של ורידים פורטליים הם המאפיינים הפתולוגיים החשובים ביותר של BA, ומאפיינים פתולוגיים אחרים בדרגות שונות קיימים בו זמנית, כגון הסננת תאים דלקתיים פורטליים ונפיחות הפטוציטים 5,6. כיום, ישנם מגוון מודלים של עכברים המחקים BA, כגון מודל העכבר הכרוני 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) הניזון עם חסימת צינור המרה סגמנטאלי ו pericholangitis מעורב צינורות המרה extrahepatic צינור7 ואת מודל העכבר של פיברוזיס הכבד עם הזרקה intraperitoneal של פחמן tetrachloride8. מודל קשירת צינור המרה (BDL) מאופיין בצהבת ופיברוזיס מהיר של ורידים פורטליים9. מודל עכבר אלפא-naphthylisothiocyanate (ANIT) הניזון מציג עם cholangitis מוגבל צינור המרה intrahepatic ופגיעה hepatocyte10. מודל עכבר עם צהבת ממושכת נגרם על ידי חיסון מושהה של rhesus rotavirus (RRV)11. למרות שיש מגוון רחב של מודלים של בעלי חיים, במיוחד מודלים עכברים, לכל מודל יש מגבלות משלו. הם יכולים לדמות רק חלק ממאפייני המחלה של BA, כגון דלקת חריפה או פיברוזיס בכבד בתהליך של אטרזיה מרה, ואין מודל התואם מאוד את תהליך המחלה ואת המאפיינים הפתולוגיים של BA.
מודל עכבר BA קלאסי מושרה על ידי RRV, ומודל זה הוא המודל הדומה ביותר ל- BA בבני אדם. עם זאת, בעוד עכברי מודל BA המושרה על ידי RRV מראים תסמינים קליניים דומים ומאפיינים פתולוגיים לחלק מאלה של אטרזיה מרה חוץ-כבדית, מודל זה חסר פיברוזיס בכבד, מה שמגביל מאוד את המחקר המעמיק של מנגנוני BA ופיתוח טיפולים חדשים12. לכן, מחקר זה פיתח מודל עכברי BA חדשני של פיברוזיס כרוני בכבד. נוגדן Anti-Ly6G הוזרק תוך צפקית לפני חיסון RRV ביום הלידה. לאחר מכן, 5-10 מיקרוגרם של נוגדן נגד Ly6G הוזרק ארבע פעמים, עם רווחים של יומיים בין כל זריקה. תסמיני BA בעכברים השתפרו, זמן ההישרדות התארך והעכברים נכנסו לשלב פיברוזיס כרוני. מודל זה לא רק מדמה את תגובת הפאזה החריפה של BA, אלא גם מחקה את תהליכי הכבד והפיברוזיס המתקדם. לפיכך, זהו מודל חייתי מתאים יותר למחקר המכניסטי של BA, והוא יכול לספק בסיס תיאורטי לפיתוח טיפולים עתידיים לתואר ראשון.
מולקולת Gr-1 היא סמן פני תא שמקורו במיאלואיד שנמצא במקור מבוטא בנויטרופילים13. דלדול נוגדנים נגד Ly6G מפחית נויטרופילים במחזור ביותר מ -90% ומשנה את התגובה המופעלת על ידי תאים חיסוניים אחרים. התפקודים של אוכלוסיות תאי Gr-1+ דווחו במחקרים שונים באמצעות נוגדנים ספציפיים לנבלות, עם השפעות משתנות שזוהו על ציטוקינים והגנה חיסונית מתווכת14. חקרנו את תפקודם של תאי Gr-1+ במודלים של עכברי BA שחוסנו ל-RRV. עם זאת, מכיוון שמולקולת Gr-1 לא נמצאה מתבטאת בבני אדם, מולקולה דומה, CD177, נחקרה בחולי BA15. הנתונים שלנו מוכיחים את המשמעות של אוכלוסיות תאי Gr-1+ , במיוחד בשלב הפיברוטי הכרוני של המחלה, ומספקים מודל מתאים לבעלי חיים כדי לחקור טיפולים אפשריים בתואר ראשון.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

אטרזיה מרה (BA) היא מחלה קטלנית הכוללת צהבת חסימתית, והיא ההתוויה הנפוצה ביותר להשתלת כבד בילדים. בשל האטיולוגיה המורכבת והפתוגנזה הלא ידועה, עדיין אין טיפולים תרופתיים יעילים. כיום, מודל עכבר BA קלאסי המושרה על ידי rhesus rotavirus (RRV) הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר הפתוגנזה של BA. מודל זה מאופיין בפיגור גדילה, צהבת של העור והרירית, צואה מחימר ושתן צהוב כהה. ההיסטופתולוגיה מראה דלקת כבד חמורה וחסימה של צינורות המרה intrahepatic ו extrahepatic, אשר דומים הסימפטומים של BA אנושי. עם זאת, הכבדים של עכברים סופניים במודל זה חסרים פיברוזיס ואינם יכולים לדמות באופן מלא את המאפיינים של פיברוזיס בכבד בתואר ראשון קליני. המחקר המוצג פיתח מודל עכבר BA חדשני של פיברוזיס כרוני בכבד על ידי הזרקת 5-10 מיקרוגרם של נוגדן נגד Ly6G ארבע פעמים, עם רווחים של יומיים לאחר כל זריקה. התוצאות הראו כי חלק מהעכברים יצרו בהצלחה BA כרוני עם פיברוזיס טיפוסי לאחר חלוף הזמן, כלומר עכברים אלה מייצגים מודל חייתי מתאים למחקר המכניסטי של BA המושרה על ידי וירוס פיברוזיס בכבד ופלטפורמה לפיתוח טיפולים עתידיים בתואר ראשון.

העכברים הוזרקו תוך צפקית עם 5 מיקרוגרם של נוגדן נגד Ly6G תוך 24 שעות מהלידה ולאחר מכן הוזרקו תוך צפקית עם 20 μL של RRV 4 שעות מאוחר יותר. לאחר מכן, 10 מיקרוגרם של נוגדן נגד Ly6G הוזרק כל 3 ימים עד היום ה-12 (איור 1A). זמן ההישרדות החציוני בקבוצת RRV היה 13 ימים. להיפך, רוב העכברים שטופלו בנוגדן פיתחו צהבת קלה, ולא נצפתה ירידה במשקל (איור 1C). כ-20%-30% מהעכברים סבלו מתסמונת BA עם צהבת ארוכת טווח ומשקל גוף נמוך, אך שרדו יותר מ-42 יום. לאחר טיפול נוגדנים נגד Ly6G, מספר תאי Gr-1+ ירדב-15, והעכברים נכנסו לשלב של פיברוזיס כרוני, המכונה BA כרוני. דגימות נאספו ביום ה-12 וביום ה-42, ופרוסות רקמה מוכתמות באדום סיריוס הראו עלייה הדרגתית בפיברוזיס בכבד. עכברי BA כרוניים ששרדו במשך 42 יום שימשו לניתוחים מפורטים. בנוסף לגודל הקטן, האוזניים, כפות הרגליים ועור הזנב הראו צהבת ניכרת (חיצים כחולים באיור 1E). ביום 6 לאחר הזרקת RRV, צבע הצואה של העכברים נעשה בהיר יותר, וצבע השתן נעשה כהה יותר; זה נעשה שונה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת ביום ה-12, כאשר עכברי קבוצת RRV הראו צואה לבנה ושתן צהוב כהה. ביום ה-42, השתן והצואה של עכברי BA כרוניים הראו גם מאפיינים ברורים של צהבת (איור 1D,E). הכבדים של עכברי BA הוסרו והושוו לאלה של קבוצת הביקורת. הכבדים היו קטנים יותר (איור 2B), נגעים נמקיים נראו לעין בלתי (איור 2A, משולש שחור), וגם קטע של אטרזיה של צינור המרה נצפה באופן אקסטרה-הפטי (איור 2A, כוכביות לבנות).
ניתוח מקטע רקמת הכבד הראה כי טיפול במינון נמוך נגד Ly6G הפחית את דלקת הוורידים הפורטליים. אולם הצטברות תאים דלקתיים עדיין נצפתה בפרוסות רקמת הכבד ביום ה-42 (איור 3A). צביעה אדומה של סיריוס הראתה עלייה קטנה בתצהיר הקולגן באזור הפורטל ביום ה-12 לאחר זריקת ה-RRV. יתר על כן, לא נצפו שינויים משמעותיים בביטוי הקולגן לאחר הטיפול בנוגדן נגד Ly6g, אך ביטוי הקולגן בדגימות רקמת BA ביום 42 היה מוגבר באופן משמעותי (איור 3B). כאשר נבדק תחת מיקרוסקופ אור מקוטב, נצפה כי סיבי קולגן הצטברו ברקמת הכבד הסמוכה. שקיעה משמעותית של קולגן, בעיקר ירוק, נצפתה בדגימות רקמת BA ביום ה-42 (איור 3C), ושקיעת הקולגן גדלה עוד יותר בעכברים ששרדו 42 יום ללא עלייה במשקל. עם הפחתת דלקת הפורטל, תאי צינור המרה CK19+ נצפו ביום ה -12. אולם ביום ה-42 כמעט ולא ניתן היה לזהות צינורות מרה בוגרים, אף על פי שנצפתה עלייה בתאי צינור המרה CK19+ (איור 4A, חיצים אדומים מציינים תאי אפיתל של צינור המרה). במקרה של צינורות מרה חוץ-כבדיים בעכברים עם BA כרוני, דיסקציה סדרתית של האזור הפורטלי של עכברים גילתה שצינורות המרה החוץ-כבדיים היו חסומים והיו להם חדירות דלקתיות של מקרופאגים (איור 4B, חיצים שחורים מציינים מקרופאגים).
בהשוואה ל-RRV בלבד, טיפול במינון נמוך של נוגדן נגד Ly6G הפחית את הפגיעה בכבד במונחים של רמות אנזימי כבד ביום ה-12 לאחר החיסון נגד RRV. רמות אלנין אמינוטרנספראז ופוספטאז אלקליין בכבד היו גבוהות יותר בקבוצת BA כרונית מאשר בקבוצת הביקורת הרגילה. השינויים הבולטים ביותר נמצאו ברמות הבילירובין, כאשר עכברי RRV + anti-Ly6G הראו רמות נמוכות יותר של TBIL, DBIL ו-IBIL ב-BA חריף לעומת RRV בלבד. בעכברים עם BA כרוני רמות TBIL, DBIL ו-IBIL עלו (איור 5), מה שמצביע על כך שתפקוד הכבד ירד משמעותית בשלב הפיברוזיס הכרוני של BA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> איור 1: ההשפעות של טיפול בנוגדנים נגד Ly6G במודל עכברי של אטרזיה מרה נגועה ב-RRV. (A) המחשה סכמטית של מינונים נמוכים של נוגדנים כדי לגרום לשלב BA חריף וכרוני בעכברים עם חצים המציינים את זמן ההזרקה של הנוגדן ו-RRV. (B) עקומות הישרדות של עכברים בקבוצת הבקרה הנורמלית (Cont.), בקבוצת rhesus rotavirus (RRV) ובקבוצת נוגדנים RRV + anti-Ly6G. (C) עקומות משקל הגוף של העכברים בכל קבוצה. (D) תמונות מייצגות של העכברים והצואה והשתן שלהם בכל קבוצה ביום ה-12. (E) תמונות מייצגות של העכברים והצואה והשתן שלהם בכל קבוצה ביום ה-42. החיצים הכחולים מציינים את האוזניים והזנב הצהובים. נתון זה הודפס מחדש באישור Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> איור 2: ההשפעות של טיפול בנוגדנים נגד Ly6G על הכבד במודל עכברי של אטרזיה מרה נגועה ב-RRV . (A) השוואה בין אנטומיה של הכבד לאנגיוגרפיה פלואורסצנטית של צינור המרה החוץ-כבד בין עכברי BA כרוניים (מימין) לעכברים רגילים ביום ה-42. (B) השוואת גודל הכבד בין עכברי BA כרוניים לעכברים רגילים. המשולש השחור מצביע על נמק כבד בעכברים עם BA כרוני. הכוכבית הלבנה מצביעה על אטרזיה מרה חוץ-כבדית. נתון זה הודפס מחדש באישור Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> איור 3: פרוסות רקמת כבד של עכברים בקבוצת הבקרה הרגילה (Cont.), בקבוצת rhesus rotavirus (RRV) ובקבוצת נוגדנים RRV + anti-Ly6G ביום ה-12 וביום ה-42. (A) תמונות של חלקי רקמת כבד מוכתמים בהמטוקסילין ובאאוזין (H&E). (B) צביעה אדומה של סיריוס הראתה שקיעת קולגן (PSR). (C) תצפית נוספת על הפרוסות באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב (Pol. Light). קיצור: PV = וריד פורטל. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מג'אנג ואחרים 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> איור 4: צביעה אימונוהיסטוכימית של פרוסות רקמת כבד מקבוצת הבקרה הרגילה (Cont.), קבוצת rhesus rotavirus (RRV) וקבוצת נוגדנים RRV + anti-Ly6G ביום ה-12 וביום ה-42 . (A) ביטוי סמן תאי אפיתל בצינור המרה (CK19) בקבוצות טיפול שונות. (B) הודגמה חדירת תאי דלקת של מקרופאגים בקבוצות טיפול שונות. קיצור: PV = וריד פורטל. החץ האדום מציין תאי אפיתל של צינור המרה. החץ השחור מציין מקרופאגים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מג'אנג ואחרים 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> איור 5: השוואה של תפקודי כבד בעכברים בקבוצות טיפול שונות. דם עכברים נאסף לאחר הניסוי ונבדק במחלקת המעבדה של בית החולים. כל קבוצה הכילה שלושה עד חמישה עכברים. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. קיצורים: ALT = alanine aminotransferase; AST = aminotransferase aspartate; ALP = phosphatase אלקליין; TBIL = סך כל הבילירובין; DBIL = בילירובין ישיר; IBIL = בילירובין עקיף. נתון זה שונה מג'אנג ואחרים 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia at JoVE.com

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

הקמנו מודל עכברי של פיברוזיס כרוני בכבד, המספק מודל חייתי מתאים למחקר המכניסטי של אפיברוזיס כבד המושרה על ידי וירוסים של אטרזיה מרה (BA) ופלטפורמה לטיפולי BA עתידיים.

מודל עכברי של פיברוזיס כרוני בכבד לחקר אטרזיה של המרה

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי ליצור מודל עכבר עקבי יותר עם השינויים הפתולוגיים של אטרזיה המרה. טכניקה זו יכולה לדמות את הסימפטומים של אטרזיה מרה חריפה וכרונית, אשר מועילה למחקר עתידי של מנגנוני המחלה. לאחר השימוש בנוגדנים, זמן ההישרדות של העכברים התארך והתסמינים הוקלו, מה שמרמז על ההשפעה הטיפולית של נוגדנים על אטרזיה של המרה.לאחר חלוקת עכברי היילודים לקבוצות שונות, כמתואר בכתב היד, יש לטפל בכל עכבר בזריקה תוך-צפקית של חמישה מיקרוגרם נוגדנים נגד Ly6G ארבע שעות לפני הזרקת rhesus rotavirus או RRV כדי לרוקן תאים חיוביים ל-Gr1. בתוך 24 שעות לאחר הלידה, intraperitoneally להזריק את העכבר יילוד עם 20 מיקרוליטר של rhesus rotavirus או מלוחים. לאחר הזרקת RRV, לנהל 20 מיקרוגרם של נוגדן anti-Ly6G לתוך הבטן של העכבר.בדוק ותעד את המראה, המשקל וההישרדות של כל העכברים מדי יום. להזרקה intraperitoneal, לחשוף את הבטן של העכבר הצעיר על ידי צביטת עור הצוואר עם האצבע המורה ואת האגודל של יד אחת בעדינות מחזיק את הרגליים האחוריות של העכבר עם אצבע הטבעת ואת אצבע הזנב. הרימו את מחט המזרק בשיפוע כלפי מעלה והכניסו את המחט לירך האמצעית של רגל ימין אחורית של העכבר בזווית של 15 מעלות עם העור.תוך כדי הזזת המחט לאורך השביל התת עורי עד שהיא מגיעה לקצה הקוסטלי הימני של העכבר, כוונו את המחט מטה לתוך חלל הבטן והזריקו את הנוזל מתחת לכבד של העכבר. משוך את המחט החוצה מיד לאחר ההזרקה. יש לצפות לדימום או דליפה באתר ההזרקה.לאחר הרדמת העכבר ביום ה -12, לנתח אותו תחת מיקרוסקופ. הכנס מזרק אינסולין של מיליליטר לחדר השמאלי של הלב כדי לאסוף דם. צנטריפוגו את הדם ב-400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והפרידו את הסרום למדידות תפקודי כבד.נתחו את כבד העכבר והטחול מהרקמות הסובבות אותו באמצעות מספריים ופינצטה. צלם את המראה הכללי של הכבד וצינור המרה. לאחר הרדמה בשאיפה, יש לחשוף את הכבד, כיס המרה וצינורות המרה החוץ-כבדיים בעזרת מספריים וצמר גפן.תחת מיקרוסקופ יציבה, הזריקו חמישה עד 10 מיקרוליטרים של הצבע הפלואורסצנטי רודאמין 123 לכיס המרה עם מזרק אינסולין של מיליליטר וצלמו. טבלו רקמת כבד עכבר טרי ב-10% פורמלין למשך 24 שעות. לאחר שהרקמה מוטמעת בפרפין, השתמשו במיקרוטום פרפין כדי לחתוך את גוש הפרפין למקטעים בעובי של ארבעה מיקרומטרים, והניחו שני מקטעים עוקבים על אותה שקופית.לאחר מכן הכניסו את הפרוסות למדף חיתוך, הסירו את השעווה מקסילן, והלחינו אותן ברצף באתנול מוחלט, 95% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים במשך חמש דקות כל אחת. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך חמש דקות, ומשרים אותם בחומצה הידרוכלורית 1% ו-75% אלכוהול למשך חמש שניות. לאחר שטיפת החלקים במים נקיים, הכתימו אותם בתמיסת אאוסין למשך דקה.הכינו את חלקי הרקמה לצביעה, כפי שהודגם קודם לכן, ובצעו תיקון אנטיגן עם חיץ Tris-EDTA. מחממים את החלקים במיקרוגל ב-95 מעלות למשך 10 דקות, ואז מוציאים ומקררים אותם באופן טבעי לטמפרטורת החדר. כדי להסיר פרוקסידז אנדוגני, הניחו את חלקי הרקמה במי חמצן 3% למשך 10 דקות, וטפלו בפרוסות עם סרום עיזים 5% כדי לחסום קשירה לא ספציפית.לאחר מכן, הוסיפו נוגדן חד-שבטי ראשוני נגד עכבר Cytokeratin 19 או נוגדן חד-שבטי F4/80 נגד עכבר לחלקים, ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לדגור על החלקים עם נוגדנים משניים מתאימים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש 3, 3-prime-diaminobenzidine כסוכן כרומוגני כדי לבחון את התגובה הכרומוגנית תחת המיקרוסקופ.התבוננו בפרוסות תחת מיקרוסקופ 40x כדי לקבל תמונות ולנתח אותן לפי הצורך. לאחר הכנת חלקי הרקמה ומוכתמים בהמטוקסילין, כסו כל רקמה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת צבע אדום סיריוס בטמפרטורת החדר למשך שעה. יבשו את המגלשות באופן טבעי בטמפרטורת החדר במשך ארבע שעות, הוסיפו טיפת מסטיק ניטרלי לכל מגלשה, והשתמשו בהחלקת כיסוי כדי לכסות את הרקמה כדי למנוע בועות.השאירו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי למצק את המסטיק הניטרלי. התבונן בפרטי שקיעת הקולגן באמצעות מיקרוסקופ אור ניגודיות מקוטב. בחרו שדה ראייה ברור ומתאים, והתאימו את הבהירות והאיזון הלבן של שדה הראייה של המיקרוסקופ.קבל תמונות ונתח אותן לפי הצורך תחת מיקרוסקופ 40x. לאחר הזרקת RRV, זמן ההישרדות החציוני בקבוצת RRV היה 13 ימים. רוב העכברים שטופלו בנוגדן פיתחו צהבת קלה ולא נצפתה ירידה במשקל.הכבדים של עכברי BA הראו נגעים נמקיים ומקטע חוץ-כבד של אטרזיה של צינור המרה. גודל הכבד קטן יותר מהביקורת. ניתוח היסטולוגי הראה כי טיפול במינון נמוך נגד Ly6G הפחית את דלקת הוורידים הפורטליים.הצטברות תאים דלקתיים עדיין נצפתה בפרוסות רקמת הכבד ביום 42. ביום ה-12 נצפתה עלייה קלה בשקיעת הקולגן באזור הפורטל. ביום ה-42 ביטוי הקולגן עלה משמעותית, ונצפתה שקיעת קולגן משמעותית ברקמת BA.התאים החיוביים ל-CK19 נצפו ביום ה-12. ביום ה-42, מספר התאים החיוביים ל-CK19 עלה, אך היו מעט צינורות מרה בוגרים. צינור המרה החוץ-כבד בעכברי BA כרוניים היה חסום והיו לו חדירות דלקתיות של מיקרופאגים.רמות ALT ו-ALP בכבד היו גבוהות יותר בקבוצת BA כרונית מאשר בקבוצת הביקורת הרגילה. רמות הבילירובין הכולל, הבילירובין הישיר והבילירובין העקיף עלו, מה שמצביע על כך שתפקוד הכבד הופחת משמעותית בשלב הפיברוזיס הכרוני של BA. הזריקה צריכה להיעשות בזהירות כדי לא לנקב את כבד העכבר. לאחר ההזרקה, אנחנו צריכים לקחת בערך 10 שניות כדי לבחון את מצב העכבר ולנקות את הדם מן הפצע.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

שיטת ננו-חלקיק כסף Ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת בעכברים

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...