Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81974056) a R.Z. e dalla National Nature Youth Foundation of China (82101808) e Science and Technology Planning Project di Guangzhou (n. 202102020196) a Z.L.

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), dove sono stati eseguiti tutti gli esperimenti sugli animali.
1. Istituzione del modello murino BA fibrotico cronico
NOTA: Tutti gli animali sono stati tenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni (SPF) nella stessa stanza e gli esperimenti sono stati condotti in un ambiente convenzionale. I topi BALB/c al giorno 12,5 di gestazione (età: 10-12 settimane; peso 35-40 g) sono stati tenuti in una stanza senza patogeni specifici a 25°C in un ciclo buio/luce di 12 ore e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua in autoclave. I topi neonatali, entro 24 ore dalla nascita (peso corporeo medio: 1,5-1,6 g), sono stati selezionati per il modello BA murino.
<ol><li>Preparare RRV come precedentemente riportato16. NOTA: A causa dello scarso stato di sopravvivenza dei topi modello, devono essere separati a 21 giorni per evitare che vengano morsi o addirittura uccisi da altri topi nella stessa gabbia.</li>
	<li>Dividere i topi neonatali in tre gruppi: il gruppo di controllo, il gruppo RRV e il gruppo RRV + anti-Ly6G. Iniettare intraperitonealmente i topi neonatali con 20 μL di RRV (titolo: 1,5 x 106 PFU / ml) (gruppo RRV) o soluzione salina (gruppo di controllo) entro 24 ore dalla nascita. Per esaurire le cellule Gr-1+ , pretrattare ciascun topo con un'iniezione intraperitoneale di 5 μg di anticorpo anti-Ly6G 4 ore prima dell'iniezione RRV. NOTA: La soluzione anticorpale anti-Ly6G viene conservata a 2-8 °C e non deve essere congelata. Estrarre l'anticorpo prima dell'uso e metterlo a temperatura ambiente per 30 minuti per riscaldare.</li>
	<li>Iniettare 10 μg di anticorpi anti-Ly6G nell'addome del topo ogni 3 giorni fino al giorno 12 dopo l'iniezione di RRV (Figura 1A).</li>
	<li>Controlla e registra l'aspetto, il peso e la sopravvivenza di tutti i topi ogni giorno.</li>
</ol>2. Iniezione intraperitoneale dei topi
<ol><li>Rimuovere i topi appena nati dalla gabbia. Utilizzare una siringa da insulina da 1 mL per iniettare 20 μL di soluzione RRV o 50 μL di soluzione anticorpale anti-Ly6G. Pizzica la pelle del collo del giovane topo con l'indice e il pollice di una mano e tieni delicatamente le zampe posteriori del mouse con l'anulare e la coda per esporre l'addome.</li>
	<li>Sollevare l'ago in una pendenza verso l'alto. Inserire l'ago nella parte centrale della coscia posteriore destra del topo con un angolo di 15° rispetto alla pelle. Dopo essersi spostato lungo il percorso sottocutaneo fino a quando l'ago raggiunge il bordo costale destro del topo, dirigere l'ago verso il basso nella cavità addominale. Quindi, iniettare il liquido sotto il fegato del topo. NOTA: I topi appena nati hanno lo stomaco e la milza nell'addome sinistro. Se un ago viene inserito sul lato sinistro, è facile perforare lo stomaco o causare emorragia splenica.</li>
	<li>Estragga l'ago immediatamente dopo l'iniezione e osservi la presenza di sanguinamento o perdite nel sito di iniezione. Se ce n'è, pulirlo con un cotone autoclavato. Riporta il topo nella gabbia di sua madre. NOTA: Al fine di ridurre l'influenza della perdita di liquido durante l'iniezione sui risultati sperimentali, assicurarsi che l'azione di iniezione sia delicata, rimuovere lentamente l'ago e premere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per 30 s.</li>
</ol>3. Raccolta del tessuto campione
<ol><li>Il giorno 12, anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano al 4% e sezionarli al microscopio. Inserire una siringa da insulina da 1 mL nel ventricolo sinistro del cuore per raccogliere il sangue. Dopo la raccolta del sangue, eutanasia i topi per inalazione di isoflurano al 4% per 10 minuti. Centrifugare il sangue a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e separare il siero per le misurazioni della funzionalità epatica. NOTA: La raccolta del sangue deve essere eseguita mentre i topi sono vivi. Se i topi muoiono, il sangue verrà trattenuto nei vasi sanguigni e non potrà essere raccolto.</li>
	<li>Fotografa l'aspetto generale del fegato e del dotto biliare. Successivamente, sezionare il fegato del topo e la milza dai tessuti circostanti con forbici e pinzette. NOTA: Il fegato e altri tessuti vengono raccolti e riservati a -80°C per l'estrazione di RNA e proteine o immersi in formalina al 10% per la preparazione di campioni istologici.</li>
</ol>4. Fluorangiografia del dotto biliare extraepatico
<ol><li>Dopo l'eutanasia del topo, esporre completamente il fegato, la cistifellea e i dotti biliari extraepatici con forbici e tamponi di cotone.</li>
	<li>Osservare al microscopio posturale, iniettare 5-10 μL del colorante fluorescente rodamina 123 (20 mg/ml) nella cistifellea con una siringa da insulina da 1 mL e scattare foto. Questo processo è lo stesso di quello riportato in un precedente16. NOTA: Topi diversi nello stesso gruppo vengono utilizzati per la raccolta del tessuto campione e l'angiografia a fluorescenza.</li>
</ol>5. Colorazione H & E
<ol><li>Immergere il tessuto epatico di topo fresco in formalina al 10% per 24 ore.</li>
	<li>Dopo aver incorporato il tessuto in paraffina, utilizzare un microtomo di paraffina per tagliare il blocco di paraffina in sezioni con uno spessore di 4 μm e posizionare due sezioni consecutive sullo stesso vetrino. Il personale esperto è tenuto a standardizzare l'operazione per evitare tagli alle dita17.</li>
	<li>Mettere le fette in una griglia, decerarle in xilene, idratarle successivamente in etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata e immergere in ciascuna per 5 minuti.</li>
	<li>Macchiare le sezioni con una soluzione di ematossilina per 5 minuti e immergerle in acido cloridrico all'1% e alcool al 75% per 5 s. Risciacquare le sezioni con acqua pulita e colorare con la soluzione di eosina per 1 minuto.</li>
</ol>6. Colorazione immunoistochimica CK19 e F4/80
<ol><li>I primi tre passaggi sono gli stessi passaggi di incorporamento, sezionamento e deceratura del tessuto nella sezione di colorazione H & E.</li>
	<li>Eseguire la riparazione dell'antigene con tampone Tris-EDTA (10 mmol/L Tris base, 1 mmol/L EDTA soluzione, pH 9,0), riscaldare le sezioni in un forno a microonde a 95°C per 10 minuti, quindi rimuoverle e raffreddarle naturalmente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare le sezioni di tessuto in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per rimuovere la perossidasi endogena.</li>
	<li>Trattare le fette con siero di capra al 5% per bloccare il legame non specifico.</li>
	<li>Aggiungere alle sezioni la citocheratina 19 primaria anti-topo di ratto o l'anticorpo monoclonale F4/80 antitopo di ratto e incubare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Incubare le sezioni con anticorpi secondari appropriati per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzare la 3,3'-diaminobenzidina (DAB) come agente cromogenico per osservare la reazione cromogenica al microscopio.</li>
	<li>Osservare le fette al microscopio 40x per ottenere immagini e analizzarle secondo necessità.</li>
</ol>7. Colorazione rosso Sirio
<ol><li>Eseguire le prime tre fasi di incorporamento, sezionamento e deceratura del tessuto come descritto nella sezione di colorazione H & E.</li>
	<li>Dopo che le sezioni di tessuto sono state controcolorate con ematossilina, coprire ciascun tessuto con 50 μL di soluzione di colorante Sirius Red a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Asciugare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per 4 ore, aggiungere una goccia di gomma neutra a ciascun vetrino e utilizzare un coprivetrino per coprire lentamente il tessuto per evitare bolle. Lasciare i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore per solidificare la gomma neutra.</li>
	<li>Utilizzare una microscopia a luce a contrasto polarizzata per osservare i dettagli della deposizione di collagene; Selezionare un campo visivo chiaro e adatto e regolare la luminosità e il bilanciamento del bianco del campo visivo del microscopio. Ottieni immagini e analizzale secondo necessità con un microscopio 40x.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Nel nostro studio, abbiamo utilizzato l'anticorpo anti-Ly6G per eliminare o diminuire le cellule Gr-1 + in un modello murino di atresia biliare infetto da RRV per migliorare la sindrome acuta BA, prolungare il tasso di sopravvivenza e consentire ai topi BA di entrare nella fase cronica. La riduzione della dose di anticorpi può portare a BA cronica con fibrosi epatica, il che indica che il numero di cellule Gr-1+ cambia il risultato di BA nelle fasi acuta e cronica. Nel nostro studio precedente, le cellule Gr-1+ sono state ridotte dopo la somministrazione di anticorpi anti-Ly6G e lo stato di sopravvivenza globale dei topi BA è stato migliorato15. Allo stesso tempo, è stato riportato che i macrofagi Gr-1+ 19, i neutrofili Gr-1+ 20, le cellule mieloidi Gr-1+21 e i granulocitiGr-1+ possono aumentare la fibrosi in alcuni modelli animali22. Tuttavia, in questo studio, le cellule Gr-1+ nei topi erano parzialmente impoverite con basse dosi di anticorpi anti-Ly6G e i depositi di collagene rimanevano. Di conseguenza, potrebbe essere necessario più tempo per affrontare la malattia in modo più approfondito.
L'applicazione dell'anticorpo anti-Ly6G ha ridotto l'infiammazione, preservato parzialmente i dotti biliari e prevenuto la morte acuta indotta da BA nei topi. Tuttavia, solo dal 20% al 30% dei topi è entrato nella fase cronica di BA; questo può essere correlato al punto temporale e al numero di iniezioni di anticorpi anti-Ly6G. Dobbiamo esplorare ulteriormente questo punto chiave per migliorare il tasso di successo. Inoltre, riteniamo che non solo le cellule Gr-1+ , ma anche altre cellule immunitarie possano svolgere ruoli importanti, come le cellule NK, le cellule T, le cellule B e i macrofagi.
Per quanto riguarda il protocollo, alcuni dettagli devono essere annotati. (i) Al fine di evitare la fuoriuscita di farmaci iniettati, utilizziamo una siringa da insulina da 1 mL con un ago di 0,33 mm di diametro, perché il diametro dell'ago è piccolo e il foro dell'ago nella siringa è piccolo, il che favorisce la riduzione della possibilità di perdite di farmaco. (ii) Prima dell'iniezione, il topo deve essere fissato per impedirne il movimento, evitare perdite di farmaco e, quindi, garantire ulteriormente l'effetto sperimentale. (iii) Durante l'iniezione del farmaco, abbiamo iniettato il farmaco nella superficie o nel margine inferiore del fegato di topo il più lontano possibile in modo che il farmaco entrasse nell'addome e contattasse completamente il fegato per avere effetto. (iv) L'iniezione viene solitamente effettuata dalla parte superiore della coscia destra del topo, perché lo stomaco e la milza del topo appena nato si trovano nell'addome sinistro e lo stomaco è pieno di latte. Se l'ago viene inserito dal lato sinistro, può facilmente perforare lo stomaco, causando il flusso di latte nell'addome o perforare la milza, causando sanguinamento.
CD177 è un omologo di Ly6G ed è stata studiata l'espressione di CD177 nei pazienti con BA. CD177 può essere utilizzato come marker per la diagnosi precoce di BA nei bambini, indicando che le cellule CD177+ svolgono un ruolo significativo nel corso di BA23. Analizzando i dati di sequenziamento dell'RNA, il nostro team ha scoperto che le cellule CD177 erano la popolazione dominante di cellule Gr-1+ ; nel frattempo, i topi Cd177−/− BALB/ c vaccinati con RRV hanno mostrato un inizio ritardato di BA e una ridotta morbilità e mortalità18. Pertanto, il nostro modello murino BA cronico presenta evidenti vantaggi per lo studio della patogenesi e della progressione della malattia di BA; fornisce inoltre un modello animale adatto per lo studio di potenziali trattamenti per BA.

L'atresia biliare (BA) è una grave malattia epatobiliare che si verifica spesso nei neonati e nei bambini piccoli; In particolare, si presenta come una colangiopatia obliterante con ittero neonatale e feci pallide1. Le sue caratteristiche cliniche sono la distruzione infiammatoria dei dotti biliari intraepatici ed extraepatici e la fibrosi progressiva, che alla fine si sviluppa in insufficienza epatica2. Secondo le statistiche, l'incidenza di BA nei paesi asiatici è superiore a quella dei paesi europei e americani e l'incidenza di BA nei paesi asiatici è di 1/8.000. L'eziologia di BA comprende infezione virale, sviluppo anormale del dotto biliare, disturbi immunitari e variazioni genetiche3. La chirurgia Kasai è il metodo più comunemente usato per migliorare la colestasi nei bambini con BA, ma in definitiva, questo non può prevenire la progressione della fibrosi4. L'attuale trattamento per BA si basa principalmente sul trapianto di fegato, che è limitato dalla mancanza di fonti epatiche. Uno studio approfondito della patogenesi del BA è il mezzo più diretto per risolvere le sfide di questa malattia. Tuttavia, gli studi sulla patogenesi del BA si basano principalmente su modelli animali di BA ed è fondamentale selezionare un modello animale appropriato.
La maggior parte degli studi istopatologici di BA hanno dimostrato che l'iperplasia del dotto biliare (BDP), la trombosi biliare e la fibrosi della vena porta sono le caratteristiche patologiche più importanti di BA, e altre caratteristiche patologiche di diversi gradi esistono allo stesso tempo, come l'infiltrazione di cellule infiammatorie portale e il gonfiore degli epatociti 5,6. Allo stato attuale, ci sono una varietà di modelli murini che imitano BA, come il modello murino cronico alimentato con 3,5-die-idrossicarbonil-1,4-diidrocollidina (DDC) con ostruzione segmentale del dotto biliare e pericolingite che coinvolge i dotti biliari extraepatici7 e il modello murino di fibrosi epatica con un'iniezione intraperitoneale di tetracloruro di carbonio8. Il modello di legatura del dotto biliare (BDL) è caratterizzato da ittero e fibrosi rapida della vena porta9. Il modello murino alimentato con alfa-naftilisotiocianato (ANIT) presenta colangite confinata al dotto biliare intraepatico e lesioni epatocitarie10. Un modello murino con ittero prolungato è indotto dall'inoculazione ritardata del rotavirus rhesus (RRV)11. Sebbene ci sia una varietà di modelli animali, in particolare modelli murini, ogni modello ha i suoi limiti. Possono simulare solo una parte delle caratteristiche della malattia di BA, come l'infiammazione acuta o la fibrosi epatica nel processo di atresia biliare, e non esiste un modello che sia altamente coerente con il processo della malattia e le caratteristiche patologiche di BA.
Il classico modello di topo BA è indotto da RRV e questo modello è il modello più simile a BA negli esseri umani. Tuttavia, mentre i topi modello BA indotti da RRV mostrano sintomi clinici e caratteristiche patologiche simili ad alcuni di quelli dell'atresia biliare extraepatica, questo modello manca di fibrosi epatica, che limita notevolmente lo studio approfondito dei meccanismi BA e lo sviluppo di nuovi trattamenti12. Pertanto, questo studio ha sviluppato un nuovo modello murino BA di fibrosi epatica cronica. L'anticorpo anti-Ly6G è stato iniettato per via intraperitoneale prima dell'inoculazione RRV il giorno della nascita. Quindi, 5-10 μg di anticorpo anti-Ly6G sono stati iniettati quattro volte, con intervalli di 2 giorni tra ogni iniezione. I sintomi BA dei topi sono migliorati, il tempo di sopravvivenza è stato prolungato e i topi sono entrati nella fase di fibrosi cronica. Questo modello non solo simula la risposta di fase acuta di BA, ma imita anche i processi del fegato e della fibrosi progressiva. Pertanto, è un modello animale più adatto per lo studio meccanicistico del BA, e potrebbe fornire una base teorica per lo sviluppo di trattamenti futuri per BA.
La molecola Gr-1 è un marcatore di superficie cellulare derivato dalla mieloide originariamente espresso nei neutrofili13. L'esaurimento degli anticorpi anti-Ly6G riduce i neutrofili circolanti di oltre il 90% e altera la risposta attivata da altre cellule immunitarie. Le funzioni delle popolazioni cellulari Gr-1+ sono state riportate in vari studi utilizzando anticorpi scavenging specifici, con effetti variabili identificati sulle citochine e sulla protezione immunitaria mediata14. Abbiamo studiato la funzione delle cellule Gr-1+ in modelli murini BA inoculati con RRV. Tuttavia, poiché la molecola Gr-1 non è stata trovata espressa nell'uomo, una molecola simile, CD177, è stata studiata nei pazienti BA15. I nostri dati dimostrano l'importanza delle popolazioni di cellule Gr-1+ , in particolare nella fase fibrotica cronica della malattia, e forniscono un modello animale adatto per studiare potenziali terapie BA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

L'atresia biliare (BA) è una malattia fatale che coinvolge l'ittero ostruttivo ed è l'indicazione più comune per il trapianto di fegato nei bambini. A causa della complessa eziologia e della patogenesi sconosciuta, non ci sono ancora trattamenti farmacologici efficaci. Allo stato attuale, il classico modello murino BA indotto dal rotavirus rhesus (RRV) è il modello più comunemente usato per studiare la patogenesi del BA. Questo modello è caratterizzato da ritardo della crescita, ittero della pelle e delle mucose, feci di argilla e urine giallo scuro. L'istopatologia mostra una grave infiammazione del fegato e l'ostruzione dei dotti biliari intraepatici ed extraepatici, che sono simili ai sintomi della BA umana. Tuttavia, i fegati dei topi allo stadio terminale in questo modello mancano di fibrosi e non possono simulare completamente le caratteristiche della fibrosi epatica nella BA clinica. Lo studio presentato ha sviluppato un nuovo modello murino BA di fibrosi epatica cronica iniettando 5-10 μg di anticorpo anti-Ly6G quattro volte, con intervalli di 2 giorni dopo ogni iniezione. I risultati hanno mostrato che alcuni dei topi hanno formato con successo BA cronica con fibrosi tipica dopo il lasso di tempo, il che significa che questi topi rappresentano un modello animale adatto per lo studio meccanicistico della fibrosi epatica indotto dal virus di BA e una piattaforma per lo sviluppo di futuri trattamenti BA.

I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 5 μg di anticorpo anti-Ly6G entro 24 ore dalla nascita e poi iniettati per via intraperitoneale con 20 μL di RRV 4 ore dopo. Quindi, 10 μg di anticorpo anti-Ly6G sono stati iniettati ogni 3 giorni fino al giorno 12 (Figura 1A). Il tempo mediano di sopravvivenza nel gruppo RRV è stato di 13 giorni. Al contrario, la maggior parte dei topi trattati con l'anticorpo ha sviluppato un lieve ittero e non è stata osservata alcuna perdita di peso (Figura 1C). Circa il 20% -30% dei topi aveva la sindrome BA con ittero a lungo termine e basso peso corporeo, ma sopravvisse per più di 42 giorni. Dopo il trattamento con anticorpi anti-Ly6G, il numero di cellule Gr-1+ è diminuito di15 e i topi sono entrati nella fase di fibrosi cronica, definita BA cronica. I campioni sono stati raccolti il giorno 12 e il giorno 42 e le fette di tessuto colorate con Sirius Red hanno mostrato un graduale aumento della fibrosi epatica. I topi BA cronici sopravvissuti per 42 giorni sono stati utilizzati per analisi dettagliate. Oltre alle piccole dimensioni, le orecchie, i piedi e la pelle della coda mostravano un marcato ittero (frecce blu nella Figura 1E). Il giorno 6 dopo l'iniezione di RRV, il colore delle feci dei topi è diventato più chiaro e il colore delle urine è diventato più scuro; questo è diventato significativamente diverso dal gruppo di controllo il giorno 12, quando i topi del gruppo RRV hanno mostrato feci bianche e urina giallo scuro. Il giorno 42, l'urina e le feci dei topi BA cronici hanno anche mostrato evidenti caratteristiche di ittero (Figura 1D, E). I fegati dei topi BA sono stati rimossi e confrontati con quelli dei controlli. I fegati erano più piccoli (Figura 2B), le lesioni necrotiche erano visibili ad occhio nudo (Figura 2A, triangolo nero) e un segmento di atresia del dotto biliare è stato osservato anche extraepaticamente (Figura 2A, asterischi bianchi).
L'analisi della sezione del tessuto epatico ha mostrato che la terapia anti-Ly6G a basso dosaggio ha ridotto l'infiammazione della vena porta. Tuttavia, l'accumulo di cellule infiammatorie è stato ancora osservato nelle fette di tessuto epatico al giorno 42 (Figura 3A). La colorazione Sirius Red ha mostrato un piccolo aumento della deposizione di collagene nella regione portale il giorno 12 dopo l'iniezione di RRV. Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti significativi nell'espressione del collagene dopo il trattamento con l'anticorpo anti-Ly6g, ma l'espressione di collagene nei campioni di tessuto BA al giorno 42 era significativamente aumentata (Figura 3B). Quando esaminato al microscopio ottico polarizzato, è stato osservato che le fibre di collagene si erano accumulate nel tessuto epatico adiacente. Una sostanziale deposizione di collagene, prevalentemente verde, è stata osservata nei campioni di tessuto BA al giorno 42 (Figura 3C) e la deposizione di collagene è aumentata ulteriormente nei topi sopravvissuti per 42 giorni senza aumento di peso. Con la riduzione dell'infiammazione portale, le cellule del dotto biliare CK19+ sono state osservate il giorno 12. Il giorno 42, tuttavia, i dotti biliari maturi erano difficilmente rilevabili, anche se è stato osservato un aumento delle cellule del dotto biliare CK19+ (Figura 4A, le frecce rosse indicano le cellule epiteliali del dotto biliare). Nel caso di dotti biliari extraepatici in topi con BA cronica, la dissezione seriale della regione portale dei topi ha rivelato che i dotti biliari extraepatici erano bloccati e avevano infiltrati infiammatori di macrofagi (Figura 4B, frecce nere indicano macrofagi).
Rispetto al solo RRV, il trattamento con una bassa dose di anticorpi anti-Ly6G ha ridotto il danno epatico in termini di livelli di enzimi epatici il giorno 12 dopo l'inoculazione RRV. I livelli di alanina aminotransferasi e fosfatasi alcalina nel fegato erano più alti nel gruppo BA cronico rispetto al gruppo di controllo normale. I cambiamenti più pronunciati sono stati riscontrati nei livelli di bilirubina, con topi RRV + anti-Ly6G che hanno mostrato livelli ridotti di TBIL, DBIL e IBIL nel BA acuto rispetto al solo RRV. Nei topi con BA cronica, i livelli di TBIL, DBIL e IBIL sono aumentati (Figura 5), indicando che la funzionalità epatica era significativamente ridotta nella fase di fibrosi cronica di BA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> Figura 1: Gli effetti del trattamento con anticorpi anti-Ly6G in un modello murino di atresia biliare infetto da RRV . (A) Illustrazione schematica di basse dosi di anticorpi per indurre BA di fase acuta e cronica nei topi con frecce che indicano il tempo di iniezione dell'anticorpo e RRV. (B) Curve di sopravvivenza dei topi nel gruppo di controllo normale (Cont.), nel gruppo rotavirus rhesus (RRV) e nel gruppo anticorpo RRV + anti-Ly6G. (C) Curve del peso corporeo dei topi in ciascun gruppo. (D) Immagini rappresentative dei topi e delle loro feci e urine in ciascun gruppo il giorno 12. (E) Immagini rappresentative dei topi e delle loro feci e urine in ciascun gruppo il giorno 42. Le frecce blu indicano le orecchie e la coda gialle. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> Figura 2: Gli effetti del trattamento con anticorpi anti-Ly6G sul fegato in un modello murino di atresia biliare infetto da RRV . (A) Confronto tra anatomia epatica e angiografia a fluorescenza del dotto biliare extraepatico tra topi BA cronici (a destra) e topi normali al giorno 42. (B) Confronto delle dimensioni del fegato tra topi BA cronici e topi normali. Il triangolo nero indica necrosi epatica nei topi con BA cronica. L'asterisco bianco indica atresia biliare extraepatica. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> Figura 3: Fette di tessuto epatico dei topi nel gruppo di controllo normale (Cont.), nel gruppo rotavirus rhesus (RRV) e nel gruppo anticorpo RRV + anti-Ly6G il giorno 12 e il giorno 42. (A) Immagini di sezioni di tessuto epatico colorate con ematossilina ed eosina (H & E). (B) La colorazione Sirius Red ha mostrato deposizione di collagene (PSR). (C) Ulteriore osservazione delle fette mediante microscopia a luce polarizzata (Pol. Light). Abbreviazione: PV = vena porta. Barra di scala = 50 μm. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> Figura 4: Colorazione immunoistochimica di fette di tessuto epatico dal gruppo di controllo normale (Cont.), dal gruppo rotavirus rhesus (RRV) e dal gruppo anticorpo RRV + anti-Ly6G al giorno 12 e al giorno 42 . (A) L'espressione del marcatore delle cellule epiteliali del dotto biliare (CK19) in diversi gruppi di trattamento. (B) L'infiltrazione di cellule infiammatorie dei macrofagi è stata dimostrata in diversi gruppi di trattamento. Abbreviazione: PV = vena porta. La freccia rossa indica le cellule epiteliali del dotto biliare. La freccia nera indica i macrofagi. Barra di scala = 50 μm. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> Figura 5: Confronto della funzionalità epatica nei topi in diversi gruppi di trattamento. Il sangue di topo è stato raccolto dopo l'esperimento e testato nel reparto di laboratorio dell'ospedale. Ogni gruppo conteneva da tre a cinque topi. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abbreviazioni: ALT = alanina aminotransferasi; AST = aspartato aminotransferasi; ALP = fosfatasi alcalina; TBIL = bilirubina totale; DBIL = bilirubina diretta; IBIL = bilirubina indiretta. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Abbiamo stabilito un modello murino di fibrosi epatica cronica, che fornisce un modello animale adatto per lo studio meccanicistico della fibrosi epatica indotta da virus dell'atresia biliare (BA) e una piattaforma per futuri trattamenti BA.

Un modello murino di fibrosi epatica cronica per lo studio dell'atresia biliare

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per creare un modello murino più coerente con i cambiamenti patologici dell'atresia biliare. Questa tecnica può simulare i sintomi dell'atresia biliare acuta e cronica, che è utile per la futura ricerca sui meccanismi della malattia. Dopo l'uso di anticorpi, il tempo di sopravvivenza dei topi è stato prolungato e i sintomi sono stati alleviati, suggerendo l'effetto terapeutico degli anticorpi sull'atresia biliare.Dopo aver diviso i topi neonatali in diversi gruppi, come descritto nel manoscritto, pretrattare ciascun topo con un'iniezione intraperitoneale di cinque microgrammi di anticorpo anti-Ly6G quattro ore prima del rotavirus rhesus o dell'iniezione di RRV per esaurire le cellule Gr1-positive. Entro 24 ore dalla nascita, iniettare per via intraperitoneale il topo neonatale con 20 microlitri di rotavirus rhesus o soluzione salina. Dopo l'iniezione RRV, somministrare 20 microgrammi di anticorpi anti-Ly6G nell'addome del topo.Controlla e registra l'aspetto, il peso e la sopravvivenza di tutti i topi ogni giorno. Per l'iniezione intraperitoneale, esporre l'addome del topo giovane pizzicando la pelle del collo con l'indice e il pollice di una mano e tenendo delicatamente le zampe posteriori del topo con l'anulare e la coda. Sollevare l'ago della siringa con un'inclinazione verso l'alto e inserire l'ago nella coscia centrale della zampa posteriore destra del topo con un angolo di 15 gradi con la pelle.Mentre si muove l'ago lungo il percorso sottocutaneo fino a raggiungere il bordo costale destro del topo, dirigere l'ago verso il basso nella cavità addominale e iniettare il liquido sotto il fegato del topo. Tiri fuori l'ago immediatamente dopo l'iniezione. Osservare per sanguinamento o perdite nel sito di iniezione.Dopo aver anestetizzato il topo il 12 ° giorno, sezionarlo al microscopio. Inserire una siringa da insulina da un millilitro nel ventricolo sinistro del cuore per raccogliere il sangue. Centrifugare il sangue a 400 g per cinque minuti a temperatura ambiente e separare il siero per le misurazioni della funzionalità epatica.Sezionare il fegato di topo e la milza dai tessuti circostanti usando forbici e pinzette. Fotografa l'aspetto generale del fegato e del dotto biliare. Dopo l'anestesia per inalazione, esporre il fegato, la cistifellea e i dotti biliari extraepatici con forbici e tamponi di cotone.Sotto un microscopio posturale, iniettare da cinque a 10 microlitri del colorante fluorescente Rhodamine 123 nella cistifellea con una siringa da insulina da un millilitro e scattare foto. Immergere il tessuto epatico di topo fresco in formalina al 10% per 24 ore. Una volta che il tessuto è incorporato nella paraffina, utilizzare un microtomo di paraffina per tagliare il blocco di paraffina in sezioni con uno spessore di quattro micrometri e posizionare due sezioni consecutive sullo stesso vetrino.Quindi mettere le fette in una griglia, decerarle in xilene e idratarle successivamente in etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata per cinque minuti ciascuna. Macchiare le sezioni con una soluzione di ematossilina per cinque minuti e immergerle in acido cloridrico all'1% e alcool al 75% per cinque secondi. Dopo aver risciacquato le sezioni con acqua pulita, colorarle con la soluzione di eosina per un minuto.Preparare le sezioni di tessuto per la colorazione, come dimostrato in precedenza, ed eseguire la riparazione dell'antigene con il tampone Tris-EDTA. Riscaldare le sezioni in un forno a microonde a 95 gradi Celsius per 10 minuti, quindi rimuoverle e raffreddarle naturalmente a temperatura ambiente. Per rimuovere la perossidasi endogena, posizionare le sezioni di tessuto in perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti e trattare le fette con il 5% di siero di capra per bloccare il legame non specifico.Quindi, aggiungere alle sezioni la citocheratina 19 anti-topo primaria del ratto o l'anticorpo monoclonale F4/80 del ratto anti-topo e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Incubare le sezioni con anticorpi secondari appropriati per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare 3, 3-prime-diaminobenzidina come agente cromogenico per osservare la reazione cromogenica al microscopio.Osservare le fette al microscopio 40x per ottenere immagini e analizzarle secondo necessità. Una volta che le sezioni di tessuto sono state preparate e controcolorate con ematossilina, coprire ogni tessuto con 50 microlitri di soluzione di colorante rosso sirius a temperatura ambiente per un'ora. Asciugare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per quattro ore, aggiungere una goccia di gomma neutra a ciascun vetrino e utilizzare un vetrino di copertura per coprire il tessuto per evitare bolle.Lasciare i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore per solidificare la gomma neutra. Osservare i dettagli della deposizione di collagene utilizzando la microscopia a luce a contrasto polarizzata. Selezionare un campo visivo chiaro e adatto e regolare la luminosità e il bilanciamento del bianco del campo visivo del microscopio.Ottieni immagini e analizzale secondo necessità con un microscopio 40x. Dopo l'iniezione di RRV, il tempo mediano di sopravvivenza nel gruppo RRV è stato di 13 giorni. La maggior parte dei topi trattati con l'anticorpo ha sviluppato ittero lieve e non è stata osservata alcuna perdita di peso.I fegati dei topi BA mostravano lesioni necrotiche e un segmento extraepatico di atresia del dotto biliare. La dimensione del fegato è più piccola dei controlli. L'analisi istologica ha mostrato che la terapia anti-Ly6G a basso dosaggio ha ridotto l'infiammazione della vena porta.L'accumulo di cellule infiammatorie è stato ancora osservato nelle fette di tessuto epatico il giorno 42. Il giorno 12, c'è stato un leggero aumento della deposizione di collagene nella regione portale. Il giorno 42, l'espressione del collagene è stata significativamente aumentata e si è osservata una sostanziale deposizione di collagene nel tessuto BA.Le cellule CK19-positive sono state osservate il giorno 12. Il giorno 42, le cellule CK19-positive sono aumentate, ma c'erano pochi dotti biliari maturi. Il dotto biliare extraepatico nei topi BA cronici era bloccato e aveva infiltrati infiammatori di microfagi.I livelli di ALT e ALP nel fegato erano più alti nel gruppo BA cronico rispetto al gruppo di controllo normale. I livelli di bilirubina totale, bilirubina diretta e bilirubina indiretta sono aumentati, indicando che la funzionalità epatica era significativamente ridotta nella fase di fibrosi cronica di BA. L'iniezione deve essere fatta con cautela per non perforare il fegato del topo. Dopo l'iniezione, dovremmo impiegare circa 10 secondi per osservare lo stato del topo e pulire il sangue dalla ferita.

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