Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
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이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (81974056)에서 R.Z.로, 중국 국립 자연 청소년 재단 (82101808)과 광저우 과학 기술 기획 프로젝트 (No. 202102020196)에서 Z.L.에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

이 연구는 모든 동물 실험이 수행된 Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center(IACUC-AEWC-F2208020)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 만성 섬유화 BA 마우스 모델 확립
참고: 모든 동물을 같은 방에서 특정 병원체가 없는(SPF) 환경에 보관하고 실험은 기존 환경에서 수행했습니다. 임신 12.5일째(생후: 10-12주, 체중 35-40g)의 BALB/c 마우스를 12시간의 암/빛 주기 하에 25°C에서 특정 병원체가 없는 방에 보관하고 오토클레이브된 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 출생 후 24시간 이내에 신생아 마우스(평균 체중: 1.5-1.6g)를 마우스 BA 모델로 선택했습니다.
<ol><li>이전에 보고된 대로 RRV를 준비합니다16. 참고: 모델 마우스의 생존 상태가 좋지 않기 때문에 같은 케이지에 있는 다른 마우스에게 물리거나 죽지 않도록 생후 21일에 분리해야 합니다.</li>
	<li>신생아 마우스를 대조군, RRV 그룹 및 RRV + 항 -Ly6G 그룹의 세 그룹으로 나눕니다. 신생아 마우스에 출생 후 24시간 이내에 20μL의 RRV(역가: 1.5 x 106 PFU/mL)(RRV 그룹) 또는 식염수(대조군)를 복강 주사합니다. Gr-1+ 세포를 고갈시키려면 RRV 주사 4시간 전에 항-Ly6G 항체 5μg을 복강내 주사하여 각 마우스를 전처리하십시오. 참고: 항-Ly6G 항체 용액은 2-8°C에서 보관되며 얼지 않아야 합니다. 사용하기 전에 항체를 꺼내 실온에서 30분 동안 두어 예열합니다.</li>
	<li>RRV 주사 후 12일까지 3일마다 10μg의 항-Ly6G 항체를 마우스의 복부에 주입합니다(그림 1A).</li>
	<li>매일 모든 생쥐의 외모, 체중 및 생존을 확인하고 기록하십시오.</li>
</ol>2. 생쥐의 복강 주사
<ol><li>새장에서 신생아 마우스를 제거하십시오. 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 RRV 용액 20μL 또는 항-Ly6G 항체 용액 50μL를 주입합니다. 한 손의 검지와 엄지 손가락으로 어린 쥐의 목 피부를 꼬집고 약지와 꼬리 손가락으로 쥐의 뒷다리를 부드럽게 잡고 복부를 노출시킵니다.</li>
	<li>바늘을 위쪽으로 들어 올립니다. 마우스의 오른쪽 뒷다리 허벅지 중간에 피부와 15° 각도로 바늘을 삽입합니다. 바늘이 마우스의 오른쪽 늑골 가장자리에 도달 할 때까지 피하 경로를 따라 이동 한 후 바늘을 복강 내로 아래쪽으로 향하게합니다. 그런 다음 마우스의 간 아래에 액체를 주입하십시오. 참고: 갓 태어난 쥐는 왼쪽 복부에 위와 비장이 있습니다. 왼쪽에 바늘을 꽂으면 위를 뚫거나 비장 출혈을 일으키기 쉽습니다.</li>
	<li>주사 직후 바늘을 빼내고 주사 부위의 출혈이나 누출을 관찰하십시오. 있는 경우 고압 멸균 면으로 닦으십시오. 마우스를 어미 케이지로 되돌립니다. 알림: 주사 중 유체 누출이 실험 결과에 미치는 영향을 줄이기 위해 주입 작용이 부드럽는지 확인하고 바늘을 천천히 제거하고 면봉으로 주사 부위를 30초 동안 누릅니다.</li>
</ol>3. 검체 조직 채취
<ol><li>12 일째에, 마우스를 4 % 이소 플루 란 흡입으로 마취시키고, 현미경으로 해부한다. 1mL 인슐린 주사기를 심장의 좌심실에 삽입하여 혈액을 수집합니다. 채혈 후, 10분 동안 4% 이소플루란을 흡입하여 마우스를 안락사시킨다. 혈액을 400 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 간 기능 측정을 위해 혈청을 분리한다. 참고: 생쥐가 살아 있는 동안 채혈을 수행해야 합니다. 생쥐가 죽으면 혈액이 혈관에 남아 수집 할 수 없습니다.</li>
	<li>간과 담관의 일반적인 모습을 촬영하십시오. 그 후, 가위와 핀셋으로 주변 조직에서 마우스 간과 비장을 해부합니다. 참고: 간 및 기타 조직은 RNA 및 단백질 추출을 위해 -80°C에서 수집 및 보존하거나 조직학적 표본 준비를 위해 10% 포르말린에 담급니다.</li>
</ol>4. 간외 담관의 플루오레세인 혈관 조영술
<ol><li>마우스를 안락사시킨 후 가위와 면봉으로 간, 담낭 및 간외 담관을 완전히 노출시킵니다.</li>
	<li>자세현미경으로 관찰하고 형광염료 로다민 123(20mg/mL) 5-10μL를 인슐린 주사기로 담낭에 주입하고 사진을 찍습니다. 이 프로세스는 이전16에서 보고된 것과 동일합니다. 참고: 동일한 그룹의 다른 마우스가 샘플 조직 수집 및 형광 혈관 조영술에 사용됩니다.</li>
</ol>5. H&E 염색
<ol><li>신선한 마우스 간 조직을 10 % 포르말린에 24 시간 동안 담그십시오.</li>
	<li>파라핀에 조직을 포매한 후 파라핀 마이크로톰을 이용하여 파라핀 블록을 두께 4μm의 절편으로 절단하고 동일한 슬라이드에 두 개의 절편을 연속적으로 배치합니다. 숙련 된 인력은 손가락 절단을 피하기 위해 작업을 표준화해야합니다17.</li>
	<li>슬라이스를 슬라이싱 랙에 넣고 자일렌으로 왁스를 제거하고 무수 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 및 증류수에 연속적으로 수화시킨 다음 각각 5분 동안 담가둡니다.</li>
	<li>헤마톡실린 용액으로 절편을 5분 동안 염색하고 1% 염산과 75% 알코올에 5초 동안 담근다. 깨끗한 물로 섹션을 헹구고 에오신 용액으로 1 분 동안 얼룩지게하십시오.</li>
</ol>6. CK19 및 F4/80 면역조직화학적 염색
<ol><li>처음 세 단계는 H & E 염색 섹션에서 조직 포매, 절편 및 왁스 제거 단계와 동일합니다.</li>
	<li>Tris-EDTA 완충액(10mmol/L Tris 염기, 1mmol/L EDTA 용액, pH 9.0)으로 항원 복구를 수행하고 95°C의 전자레인지에서 10분 동안 절편을 가열한 다음 제거하고 실온으로 자연 냉각합니다.</li>
	<li>조직 절편을 3% 과산화수소 용액에 10분 동안 넣어 내인성 과산화효소를 제거합니다.</li>
	<li>슬라이스를 5% 염소 혈청으로 처리하여 비특이적 결합을 차단합니다.</li>
	<li>1차 래트 항-마우스 사이토케라틴 19 또는 래트 항-마우스 F4/80 모노클로날 항체를 절편에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.</li>
	<li>적절한 2차 항체가 있는 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 발색제로 사용하여 현미경으로 발색 반응을 관찰합니다.</li>
	<li>40x 현미경으로 슬라이스를 관찰하여 사진을 얻고 필요에 따라 분석합니다.</li>
</ol>7. 시리우스 레드 염색
<ol><li>H & E 염색 섹션에 설명 된대로 조직 임베딩, 절편 및 탈랍의 처음 세 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>조직 절편을 헤마톡실린으로 대조염색한 후 실온에서 1시간 동안 50μL의 시리우스 레드 염료 용액으로 각 조직을 덮습니다.</li>
	<li>슬라이드를 실온에서 4시간 동안 자연 건조시키고 각 슬라이드에 중성 껌 한 방울을 떨어뜨린 다음 커버슬립을 사용하여 기포를 피하기 위해 조직을 천천히 덮습니다. 슬라이드를 실온에서 24시간 동안 방치하여 중성 검을 응고시킵니다.</li>
	<li>편광 조영광 현미경을 사용하여 콜라겐 침착의 세부 사항을 관찰합니다. 선명하고 적합한 시야를 선택하고 현미경 시야의 밝기와 화이트 밸런스를 조정합니다. 이미지를 획득하고 필요에 따라 40x 현미경으로 분석합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

본 연구에서는 항-Ly6G 항체를 사용하여 RRV에 감염된 담도 폐쇄증 마우스 모델에서 Gr-1+ 세포를 제거하거나 감소시켜 급성 BA 증후군을 개선하고 생존율을 연장하며 BA 마우스가 만성기에 진입할 수 있도록 했습니다. 항체 용량을 줄이면 간 섬유증을 동반한 만성 BA가 발생할 수 있으며, 이는 Gr-1+ 세포의 수가 급성 및 만성 단계에서 BA의 결과를 변화시킨다는 것을 나타냅니다. 이전 연구에서 Gr-1+ 세포는 항-Ly6G 항체 투여 후 감소했으며 BA 마우스의 전체 생존 상태는 개선되었습니다15. 동시에, Gr-1+ 대식세포19, Gr-1+ 호중구20, Gr-1+ 골수 세포 21 및 Gr-1+ 과립구가 일부 동물 모델에서 섬유증을 향상시킬 수 있다고 보고되었습니다 22. 그러나 이 연구에서 마우스의 Gr-1+ 세포는 저용량의 항-Ly6G 항체로 부분적으로 고갈되었고 콜라겐 침착물은 남아 있었습니다. 결과적으로 질병을 보다 철저하게 해결하는 데 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다.
항-Ly6G 항체의 적용은 염증을 감소시키고 담관을 부분적으로 보존하며 마우스의 급성 BA 유발 사망을 예방했습니다. 그러나 마우스의 20 %에서 30 %만이 BA의 만성 단계에 들어갔다. 이는 항-Ly6G 항체의 시점 및 주사 횟수와 관련이 있을 수 있습니다. 성공률을 높이려면 이 핵심 사항을 더 자세히 탐색해야 합니다. 또한 Gr-1+ 세포뿐만 아니라 NK 세포, T 세포, B 세포, 대식세포 등 다른 면역 세포도 중요한 역할을 할 수 있다고 생각합니다.
프로토콜에 관해서는 몇 가지 세부 사항을 기록해야 합니다. (i) 주사 약물의 누출을 방지하기 위해 바늘 직경이 작고 주사기에 들어가는 바늘 구멍이 작기 때문에 직경 0.33mm의 바늘이 있는 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 약물 누출 가능성을 줄이는 데 도움이 됩니다. (ii) 주사 전에 마우스가 움직이지 않도록 고정하고 약물 누출을 방지하여 실험 효과를 더욱 보장해야 합니다. (iii) 약물 주입 시 마우스 간의 표면 또는 아래쪽 가장자리에 약물을 최대한 주입하여 약물이 복부에 들어가 간에 완전히 접촉하여 효과가 나타나도록 하였다. (iv) 주사는 신생아 마우스의 위와 비장이 왼쪽 복부에 있고 위가 우유로 가득 차 있기 때문에 일반적으로 마우스의 오른쪽 허벅지에서 이루어집니다. 바늘을 왼쪽에서 꽂으면 쉽게 위를 뚫어 우유가 복부로 흘러 들어가거나 비장을 찔러 출혈을 일으킬 수 있습니다.
CD177은 Ly6G의 상동체이며 BA 환자에서 CD177의 발현이 조사되었습니다. CD177은 소아에서 BA의 조기 진단을 위한 마커로 사용될 수 있으며, 이는 CD177+ 세포가 BA23 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. RNA 시퀀싱 데이터를 분석함으로써 우리 팀은 CD177 세포가 Gr-1+ 세포의 지배적인 집단임을 발견했습니다. 한편, RRV를 접종한 Cd177-/- BALB/ c 마우스는 BA의 발병이 지연되고 이환율과 사망률이 감소한 것으로 나타났다18. 따라서 우리의 만성 BA 마우스 모델은 BA의 발병기전 및 질병 진행을 연구하는 데 분명한 이점이 있습니다. 또한 BA에 대한 잠재적 치료법을 연구하기에 적합한 동물 모델을 제공합니다.

담도 폐쇄증(BA)은 영유아에서 자주 발생하는 심각한 간담도 질환입니다. 특히, 신생아 황달과 창백한 변을 동반한 폐쇄성 담관병증으로 나타난다1. 이 병의 임상적 특징은 간내 및 간외 담관의 염증성 파괴와 진행성 섬유증이며, 이는 결국 간부전으로 발전한다2. 통계에 따르면 아시아 국가의 BA 발병률은 유럽 및 미국 국가보다 높으며 아시아 국가의 BA 발병률은 1/8,000입니다. BA의 병인에는 바이러스 감염, 비정상적인 담관 발달, 면역 질환 및 유전적 변이가 포함된다3. 카사이 수술은 BA 소아의 담즙정체를 개선하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만, 궁극적으로 섬유증의 진행을 예방할 수는 없다4. BA에 대한 현재 치료법은 주로 간 이식에 의존하며, 이는 간 공급원의 부족으로 인해 제한됩니다. BA의 발병기전에 대한 심층 연구는 이 질병의 문제를 해결하는 가장 직접적인 수단입니다. 그러나 BA의 발병기전에 대한 연구는 주로 BA 동물 모델에 의존하므로 적절한 동물 모델을 선택하는 것이 중요합니다.
BA에 대한 대부분의 조직병리학적 연구는 담관 증식증(BDP), 담즙 혈전증 및 문맥 섬유증이 BA의 가장 중요한 병리학적 특징이며, 문맥 염증 세포 침윤 및 간세포 부종과 같은 다른 등급의 다른 병리학적 특징이 동시에 존재한다는 것을 보여주었습니다 5,6. 현재, 간외 담관을 침범하는 분절 담관 폐쇄 및 담관주위염이 있는 만성 3,5-다이톡시카르보닐-1,4-디하이드로콜리딘(DDC) 섭식 마우스 모델(7) 및 사염화탄소를 복강내 주사한 간 섬유증의 마우스 모델(8)과 같이 BA를 모방한 다양한 마우스 모델이 있다. 담관 결찰술(bile duct ligation, BDL) 모델은 황달과 빠른 문맥 섬유증(rapid portal vein fibrosis)을 특징으로 한다9. 알파-나프틸이소티오시아네이트(ANIT)를 먹인 마우스 모델은 간내 담관에 국한된 담관염과 간세포 손상을 나타낸다10. 황달이 장기간 지속되는 마우스 모델은 지연된 붉은털 로타바이러스(rhesus rotavirus, RRV) 접종에 의해 유도된다11. 다양한 동물 모델, 특히 마우스 모델이 있지만 각 모델마다 고유한 한계가 있습니다. 그들은 담도 폐쇄증 과정에서 급성 염증이나 간 섬유증과 같은 BA의 질병 특성의 일부만 시뮬레이션할 수 있으며 BA의 질병 과정 및 병리학적 특징과 매우 일치하는 모델은 없습니다.
고전적인 BA 마우스 모델은 RRV에 의해 유도되며, 이 모델은 인간의 BA와 가장 유사한 모델입니다. 그러나 RRV 유도 BA 모델 마우스는 간외 담도 폐쇄증과 유사한 임상 증상 및 병리학적 특징을 보이지만, 이 모델은 간 섬유증이 없어 BA 메커니즘에 대한 심층 연구와 새로운 치료법 개발에 큰 제약이 있다12. 따라서 본 연구에서는 만성 간 섬유증의 새로운 BA 마우스 모델을 개발하였다. 항-Ly6G 항체는 출생 당일 RRV 접종 전에 복강 주사되었습니다. 그런 다음 5-10 μg의 항 -Ly6G 항체를 4 회 주사하고 각 주사 사이에 2 일의 간격을 두었습니다. 마우스의 BA 증상이 개선되고 생존 기간이 연장되었으며 마우스는 만성 섬유증 단계에 들어갔다. 이 모델은 BA의 급성기 반응을 시뮬레이션할 뿐만 아니라 간 및 진행성 섬유증의 과정을 모방합니다. 따라서 BA의 기계론적 연구에 더 적합한 동물 모델이며 BA에 대한 향후 치료법 개발을 위한 이론적 근거를 제공할 수 있습니다.
Gr-1 분자는 원래 호중구13에서 발현되는 것으로 밝혀진 골수 유래 세포 표면 마커입니다. 항-Ly6G 항체의 고갈은 순환 호중구를 90% 이상 감소시키고 다른 면역 세포에 의해 활성화된 반응을 변화시킵니다. Gr-1+ 세포 집단의 기능은 사이토카인과 매개 면역 보호에 대한 다양한 효과가 확인된 특정 소거 항체를 사용한 다양한 연구에서 보고되었습니다14. 우리는 RRV 접종 BA 마우스 모델에서 Gr-1+ 세포의 기능을 연구했습니다. 그러나 Gr-1 분자가 인간에서 발현되는 것으로 밝혀지지 않았기 때문에 유사한 분자인 CD177이 BA 환자에서 연구되었습니다15. 우리의 데이터는 특히 질병의 만성 섬유화 단계에서 Gr-1+ 세포 집단의 중요성을 입증하고 잠재적인 BA 치료법을 조사하기에 적합한 동물 모델을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

담도 폐쇄증(BA)은 폐쇄성 황달을 수반하는 치명적인 질병이며 소아 간 이식의 가장 흔한 적응증입니다. 복잡한 병인과 알려지지 않은 병인으로 인해 아직 효과적인 약물 치료법이 없습니다. 현재, 붉은털 로타바이러스(RRV)에 의해 유도된 고전적인 BA 마우스 모델은 BA의 발병기전을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델입니다. 이 모델은 성장 지연, 피부 및 점막의 황달, 점토 변 및 짙은 노란색 소변이 특징입니다. 조직 병리학은 심각한 간 염증 및 간내 및 간외 담관의 폐쇄를 나타내며 이는 인간 BA의 증상과 유사합니다. 그러나 이 모델에서 말기 마우스의 간은 섬유증이 없으며 임상 BA에서 간 섬유증의 특성을 완전히 시뮬레이션할 수 없습니다. 제시된 연구는 5-10μg의 항-Ly6G 항체를 4회 주사하고 각 주사 후 2일의 간격을 두고 만성 간 섬유증의 새로운 BA 마우스 모델을 개발했습니다. 그 결과 일부 마우스는 시간 경과 후 전형적인 섬유증과 함께 만성 BA를 성공적으로 형성한 것으로 나타났으며, 이는 이 마우스가 BA에 대한 바이러스 유발 간 섬유증 기계론적 연구에 적합한 동물 모델이자 향후 BA 치료제 개발을 위한 플랫폼을 나타냅니다.

생쥐는 출생 후 24시간 이내에 5μg의 항-Ly6G 항체를 복강내 주사한 다음 4시간 후에 20μL의 RRV를 복강내 주사했습니다. 그런 다음 10μg의 항-Ly6G 항체를 12일까지 3일마다 주입했습니다(그림 1A). RRV 그룹의 평균 생존 기간은 13일이었습니다. 반대로, 항체로 처리된 대부분의 마우스는 경미한 황달이 발생했고, 체중 감소는 관찰되지 않았다(도 1C). 생쥐의 약 20%-30%는 장기간 황달과 저체중을 동반한 BA 증후군을 앓았지만 42일 이상 생존했습니다. 항-Ly6G 항체 처리 후 Gr-1+ 세포 수가15개 감소하고 마우스는 만성 BA라고 하는 만성 섬유증 단계에 들어갔다. 12일째와 42일째에 검체를 채취하였고, 시리우스 레드로 염색한 조직 절편은 간 섬유증의 점진적인 증가를 보였다. 42일 동안 생존한 만성 BA 마우스를 상세한 분석에 사용했습니다. 작은 크기 외에도 귀, 발 및 꼬리 피부에는 뚜렷한 황달이 나타났습니다(그림 1E의 파란색 화살표). RRV 주사 후 6일째에 생쥐의 대변 색이 밝아지고 소변 색이 어두워졌습니다. 이것은 RRV 그룹 마우스가 흰색 대변과 짙은 노란색 소변을 보인 12일째에 대조군과 크게 달랐습니다. 42일째에 만성 BA 마우스의 소변과 대변에서도 황달의 명백한 특징이 나타났습니다(그림 1D,E). BA 마우스의 간을 제거하고 대조군의 간과 비교했습니다. 간은 더 작았고(그림 2B), 괴사성 병변은 육안으로 볼 수 있었고(그림 2A, 검은색 삼각형), 담관 폐쇄증의 한 부분도 간외로 관찰되었습니다(그림 2A, 흰색 별표).
간 조직 절편 분석에서 저용량 항-Ly6G 요법이 문맥 염증을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 그러나, 염증 세포 축적은 42일째에 간 조직 절편에서 여전히 관찰되었다(도 3A). 시리우스 레드 염색은 RRV 주사 후 12일째에 문맥 영역에서 콜라겐 침착의 작은 증가를 보여주었습니다. 또한, 항-Ly6g 항체로 처리한 후 콜라겐 발현에서 유의한 변화가 관찰되지 않았지만, 42일째에 BA 조직 샘플에서 콜라겐 발현이 유의하게 증가하였다(도 3B). 편광 현미경으로 관찰했을 때, 콜라겐 섬유가 인접한 간 조직에 축적되어 있는 것이 관찰되었다. 42일째에 BA 조직 표본에서 주로 녹색인 콜라겐의 상당한 침착이 관찰되었으며(그림 3C), 체중 증가 없이 42일 동안 생존한 마우스에서 콜라겐 침착이 추가로 증가했습니다. 문맥 염증의 감소와 함께 CK19+ 담관 세포가 12일째에 관찰되었습니다. 그러나 42일째에는 CK19+ 담관 세포의 증가가 보였음에도 불구하고 성숙한 담관이 거의 감지되지 않았습니다(그림 4A, 빨간색 화살표는 담관 상피 세포를 나타냄). 만성 BA가 있는 마우스의 간외 담관의 경우, 마우스의 문맥 영역을 연속적으로 절개한 결과 간외 담관이 막히고 대식세포의 염증성 침윤이 있는 것으로 나타났습니다(그림 4B, 검은색 화살표는 대식세포를 나타냄).
RRV 단독과 비교하여 저용량의 항-Ly6G 항체로 치료하면 RRV 접종 후 12일째에 간 효소 수치 측면에서 간 손상이 감소했습니다. 간에서 알라닌 아미노전이효소와 알칼리성 포스파타제 수치는 정상 대조군보다 만성 BA 그룹에서 더 높았다. 가장 두드러진 변화는 빌리루빈 수치에서 발견되었으며, RRV + 항-Ly6G 마우스는 RRV 단독과 대조적으로 급성 BA에서 감소된 TBIL, DBIL 및 IBIL 수치를 보였습니다. 만성 BA가 있는 마우스에서 TBIL, DBIL 및 IBIL의 수치가 증가했으며(그림 5), 이는 BA의 만성 섬유증 단계에서 간 기능이 유의하게 감소했음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> 그림 1: RRV에 감염된 담도 폐쇄증의 마우스 모델에서 항-Ly6G 항체 처리의 효과. (A) 항체 및 RRV의 주입 시간을 나타내는 화살표가 있는 마우스에서 급성 및 만성 단계 BA를 유도하는 저용량의 항체의 개략도. (B) 정상 대조군(Cont.) 그룹, 붉은털 로타바이러스(RRV) 그룹 및 RRV+ 항-Ly6G 항체 그룹에서 마우스의 생존 곡선. (C) 각 군에서 마우스의 체중 곡선. (D) 12일째에 각 그룹의 생쥐와 그들의 대변 및 소변의 대표 이미지. (E) 42일째 각 그룹의 생쥐와 대변 및 소변의 대표 이미지. 파란색 화살표는 노란색 귀와 꼬리를 나타냅니다. 이 그림은 Zhang et al.15의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> 그림 2: RRV에 감염된 담도 폐쇄증 마우스 모델에서 간에 대한 항-Ly6G 항체 처리의 효과 . (A) 42일째 만성 BA 마우스(오른쪽)와 정상 마우스 간의 간 해부학과 간외 담관 형광 혈관조영술의 비교. (B) 만성 BA 마우스와 정상 마우스의 간 크기 비교. 검은색 삼각형은 만성 BA가 있는 마우스의 간 괴사를 나타냅니다. 흰색 별표는 간외 담도 폐쇄증을 나타냅니다. 이 그림은 Zhang et al.15의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> 도 3: 12일째 및 42일째에 정상 대조군(Cont.) 그룹, 붉은털 로타바이러스(RRV) 그룹 및 RRV+ 항-Ly6G 항체 그룹의 마우스의 간 조직 절편. (A) 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색된 간 조직 절편의 이미지. (B) 시리우스 레드 염색은 콜라겐 침착(PSR)을 나타냈다. (C) 편광 현미경(Pol. Light)을 사용한 슬라이스의 추가 관찰. 약어: PV = 문맥. 스케일 바 = 50 μm. 이 수치는 Zhang et al.15에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> 도 4: 12일째 및 42일째에 정상 대조군(Cont.) 그룹, 붉은털 로타바이러스(RRV) 그룹 및 RRV+ 항-Ly6G 항체 그룹에서 간 조직 절편의 면역조직화학적 염색 . (A) 상이한 치료군에서 담관 상피 세포 마커(CK19)의 발현. (B) 대식세포의 염증 세포 침윤은 상이한 처리군에서 입증되었다. 약어: PV = 문맥. 빨간색 화살표는 담관 상피 세포를 나타냅니다. 검은색 화살표는 대식세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 수치는 Zhang et al.15에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> 그림 5: 다른 처리 그룹에서 마우스의 간 기능 비교. 실험 후 마우스 혈액을 채취하여 병원의 실험실 부서에서 테스트했습니다. 각 그룹에는 3 내지 5 마리의 마우스가 포함되었습니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 약어: ALT = 알라닌 아미노전이효소; AST = 아스파르테이트 아미노전이효소; ALP = 알칼리성 포스파타제; TBIL = 총 빌리루빈; DBIL = 직접 빌리루빈; IBIL = 간접 빌리루빈. 이 수치는 Zhang et al.15에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

우리는 담도 폐쇄증(BA)에 대한 바이러스 유발 간 섬유증 기계론적 연구에 적합한 동물 모델과 향후 BA 치료를 위한 플랫폼을 제공하는 만성 간 섬유증의 마우스 모델을 확립했습니다.

담도 폐쇄증 연구를 위한 만성 간 섬유증의 마우스 모델

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

우리는 이 방법을 성공적으로 사용하여 담도 폐쇄증의 병리학적 변화와 더 일치하는 마우스 모델을 만들었습니다. 이 기술은 급성 및 만성 담도 폐쇄증의 증상을 시뮬레이션할 수 있어 향후 질병 메커니즘 연구에 도움이 됩니다. 항체 사용 후 마우스의 생존 기간이 연장되고 증상이 완화되어 담도 폐쇄증에 대한 항체의 치료 효과를 시사합니다.원고에 설명 된대로 신생아 마우스를 여러 그룹으로 나눈 후, 붉은 털 로타 바이러스 또는 RRV 주사 4 시간 전에 5 마이크로 그램의 항 -Ly6G 항체를 복강 내 주사하여 각 마우스를 전처리하여 Gr1 양성 세포를 고갈시킵니다. 출생 후 24 시간 이내에 신생아 마우스에 20 마이크로 리터의 붉은털 로타 바이러스 또는 식염수를 복강 내 주사합니다. RRV 주사 후 20마이크로그램의 항-Ly6G 항체를 마우스의 복부에 투여합니다.매일 모든 생쥐의 외모, 체중 및 생존을 확인하고 기록하십시오. 복강 주사의 경우 한 손의 검지와 엄지 손가락으로 목 피부를 꼬집고 약지와 꼬리 손가락으로 마우스의 뒷다리를 부드럽게 잡아 어린 마우스의 복부를 노출시킵니다. 주사기 바늘을 위쪽으로 기울여 들어 올리고 마우스의 오른쪽 뒷다리 허벅지 중간에 피부와 15도 각도로 바늘을 삽입합니다.바늘이 마우스의 오른쪽 늑골 가장자리에 도달 할 때까지 피하 경로를 따라 바늘을 움직이면서 바늘을 복강 내로 향하게하고 마우스의 간 아래에 액체를 주입합니다. 주사 직후 바늘을 빼냅니다. 주사 부위의 출혈이나 누출을 관찰하십시오.12일째에 마우스를 마취한 후 현미경으로 해부한다. 1 밀리리터 인슐린 주사기를 심장의 좌심실에 삽입하여 혈액을 채취하십시오. 혈액을 400g에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 간 기능 측정을 위해 혈청을 분리한다.가위와 핀셋을 사용하여 주변 조직에서 마우스 간과 비장을 해부합니다. 간과 담관의 일반적인 모습을 촬영하십시오. 흡입 마취 후 간, 담낭 및 간외 담관을 가위와 면봉으로 노출시킵니다.자세 현미경에서 1 밀리리터 인슐린 주사기로 5-10 마이크로 리터의 형광 염료 로다 민 123을 담낭에 주입하고 사진을 찍습니다. 신선한 마우스 간 조직을 10 % 포르말린에 24 시간 동안 담그십시오. 조직이 파라핀에 묻히면 파라핀 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록을 4마이크로미터 두께의 섹션으로 자르고 동일한 슬라이드에 두 개의 연속 섹션을 배치합니다.그런 다음 슬라이스를 슬라이싱 랙에 넣고 크실렌으로 왁스를 제거한 다음 무수 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 및 증류수에서 각각 5분 동안 연속적으로 수화합니다. 헤마톡실린 용액으로 절편을 5분 동안 염색하고 1% 염산과 75% 알코올에 5초 동안 담근다. 깨끗한 물로 섹션을 헹구고 1 분 동안 에오신 용액으로 얼룩지게하십시오.앞에서 설명한 대로 염색을 위해 조직 절편을 준비하고 Tris-EDTA 완충액으로 항원 복구를 수행합니다. 전자레인지에 섭씨 95도의 10분간 가열한 후 꺼내 실온으로 자연 식힌다. 내인성 과산화효소를 제거하려면 조직 절편을 3% 과산화수소에 10분 동안 넣고 슬라이스를 5% 염소 혈청으로 처리하여 비특이적 결합을 차단합니다.다음으로, 1차 쥐 항-마우스 사이토케라틴 19 또는 쥐 항-마우스 F4/80 단클론 항체를 절편에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 적절한 2차 항체가 있는 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3,3-프라임-디아미노벤지딘을 발색제로 사용하여 현미경으로 발색 반응을 관찰합니다.40x 현미경으로 슬라이스를 관찰하여 사진을 얻고 필요에 따라 분석합니다. 조직 절편이 준비되고 헤마톡실린으로 대조염색되면 실온에서 1시간 동안 50마이크로리터의 시리우스 레드 염료 용액으로 각 조직을 덮습니다. 슬라이드를 실온에서 4시간 동안 자연 건조시키고 각 슬라이드에 중성 껌 한 방울을 떨어뜨린 다음 커버 슬립을 사용하여 기포를 피하기 위해 조직을 덮습니다.슬라이드를 실온에 24시간 동안 두어 중성 검을 응고시킵니다. 편광 조영광 현미경을 사용하여 콜라겐 증착 세부 사항을 관찰합니다. 선명하고 적합한 시야를 선택하고 현미경 시야의 밝기와 화이트 밸런스를 조정합니다.이미지를 획득하고 필요에 따라 40x 현미경으로 분석합니다. RRV 주사 후 RRV 그룹의 평균 생존 기간은 13일이었습니다. 항체로 처리된 대부분의 마우스에서 경미한 황달이 발생했으며 체중 감소는 관찰되지 않았습니다.BA 마우스의 간은 괴사성 병변과 담관 폐쇄증의 간외 부분을 보여주었습니다. 간의 크기는 대조군보다 작습니다. 조직학적 분석에서 저용량 항-Ly6G 요법이 문맥 염증을 감소시키는 것으로 나타났습니다.염증 세포 축적은 42일째에 간 조직 절편에서 여전히 관찰되었다. 12일째에는 문맥 영역에서 콜라겐 침착이 약간 증가했습니다. 42일째에, 콜라겐 발현이 유의하게 증가하였고, BA 조직에서 상당한 콜라겐 침착이 관찰되었다.CK19 양성 세포는 12일째에 관찰되었다. 42일째에 CK19 양성 세포는 증가했지만 성숙한 담관은 거의 없었습니다. 만성 BA 마우스의 간외 담관이 차단되었고 마이크로파지의 염증성 침윤이 있었습니다.간의 ALT 및 ALP 수치는 정상 대조군보다 만성 BA 그룹에서 더 높았습니다. 총 빌리루빈, 직접 빌리루빈 및 간접 빌리루빈 수치가 증가하여 BA의 만성 섬유증 단계에서 간 기능이 유의하게 감소했음을 나타냅니다. 주사는 마우스 간을 뚫지 않도록 주의해서 해야 합니다. 주사 후 약 10 초 동안 마우스의 상태를 관찰하고 상처에서 혈액을 제거해야합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

연구

면역학 및 감염병학

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

햄스터의 지느러미 피부에 피부 Leishmaniasis : Antileishmanial 약물의 상영을위한 유용한 모델

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

로컬 및 전신 사이트에서 병원체에 의한 만성 염증을위한 마우스 모델

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

쥐에서 담 즙이 폐쇄 증 증후군 장황 하는 실버 나노 방법

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...