Name: a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00
Duration: 9 min 12 s
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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81974056) para R.Z. e da National Nature Youth Foundation of China (82101808) e Projeto de Planejamento de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (No. 202102020196) para Z.L.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), onde todos os experimentos com animais foram realizados.
1. Estabelecimento do modelo crônico de camundongos BA fibróticos
OBS: Todos os animais foram mantidos em ambiente específico livre de patógenos (FPS) na mesma sala, e os experimentos foram conduzidos em ambiente convencional. Camundongos BALB/c no dia 12,5 de gestação (idade: 10-12 semanas; peso 35-40 g) foram mantidos em uma sala sem patógenos específicos a 25°C sob um ciclo escuro/claro de 12 h e receberam acesso livre a água e ração autoclavada. Camundongos neonatais, dentro de 24 h após o nascimento (peso corporal médio: 1,5-1,6 g), foram selecionados para o modelo de BA de camundongos.
<ol><li>Preparar RRV conforme relatado anteriormente16. NOTA: Devido ao mau estado de sobrevivência dos ratos modelo, eles precisam ser separados aos 21 dias de idade para evitar que sejam mordidos ou mesmo mortos por outros camundongos na mesma gaiola.</li>
	<li>Divida os camundongos neonatais em três grupos: grupo controle, grupo RRV e grupo RRV + anti-Ly6G. Injetar intraperitonealmente os camundongos neonatais com 20 μL de RRV (título: 1,5 x 106 UFP/mL) (grupo RRV) ou solução salina (grupo controle) dentro de 24 h após o nascimento. Para esgotar as células Gr-1+ , pré-trate cada camundongo com uma injeção intraperitoneal de 5 μg de anticorpo anti-Ly6G 4 h antes da injeção de RRV. NOTA: A solução de anticorpos anti-Ly6G é armazenada a 2-8 °C e não deve ser congelada. Retire o anticorpo antes de usar e coloque-o em temperatura ambiente por 30 minutos para aquecer.</li>
	<li>Injetar 10 μg de anticorpo anti-Ly6G no abdome do camundongo a cada 3 dias até o dia 12 após a injeção de RRV (Figura 1A).</li>
	<li>Verifique e registre a aparência, peso e sobrevivência de todos os ratos diariamente.</li>
</ol>2. Injeção intraperitoneal dos camundongos
<ol><li>Remova ratos recém-nascidos da gaiola. Use uma seringa de insulina de 1 mL para injetar 20 μL de solução de RRV ou 50 μL de solução de anticorpo anti-Ly6G. Aperte a pele do pescoço do rato jovem com o dedo indicador e polegar de uma mão, e segure suavemente as patas traseiras do rato com o dedo anelar e o dedo da cauda para expor o abdómen.</li>
	<li>Levante a agulha em uma inclinação para cima. Introduza a agulha na coxa média da perna traseira direita do rato num ângulo de 15° com a pele. Depois de mover-se ao longo do trajeto subcutâneo até que a agulha atinja a borda costal direita do camundongo, direcione a agulha para baixo na cavidade abdominal. Em seguida, injete o líquido sob o fígado do rato. NOTA: Ratos recém-nascidos têm seu estômago e baço no abdômen esquerdo. Se uma agulha é inserida no lado esquerdo, é fácil perfurar o estômago ou causar hemorragia esplênica.</li>
	<li>Puxe a agulha imediatamente após a injeção e observe se há sangramento ou vazamento no local da injeção. Se houver, limpe-o com um algodão autoclavado. Devolva o rato à gaiola da mãe. NOTA: Para reduzir a influência do vazamento de líquido durante a injeção nos resultados experimentais, certifique-se de que a ação da injeção seja suave, remova lentamente a agulha e pressione o local da injeção com um cotonete por 30 s.</li>
</ol>3. Coleta de amostra de tecido
<ol><li>No 12º dia, anestesiar os camundongos com inalação de isoflurano a 4% e dissecá-los ao microscópio. Insira uma seringa de insulina de 1 mL no ventrículo esquerdo do coração para coletar sangue. Após a coleta de sangue, eutanasiar os camundongos por inalação de isoflurano a 4% por 10 min. Centrifugar o sangue a 400 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente e separar o soro para medições da função hepática. NOTA: A coleta de sangue deve ser realizada enquanto os camundongos estiverem vivos. Se os ratos morrerem, o sangue ficará retido nos vasos sanguíneos e não poderá ser coletado.</li>
	<li>Fotografe a aparência geral do fígado e do ducto biliar. Posteriormente, dissecar o fígado e o baço de camundongos dos tecidos circundantes com tesouras e pinças. NOTA: O fígado e outros tecidos são coletados e reservados a −80°C para extração de RNA e proteína ou embebidos em formalina a 10% para a preparação de espécimes histológicos.</li>
</ol>4. Angiofluoresceinografia do ducto biliar extra-hepático
<ol><li>Após a eutanásia do rato, exponha totalmente o fígado, a vesícula biliar e os ductos biliares extra-hepáticos com tesouras e cotonetes.</li>
	<li>Observe sob um microscópio de postura, injete 5-10 μL do corante fluorescente rodamina 123 (20 mg/mL) na vesícula biliar com uma seringa de insulina de 1 mL e tire fotos. Esse processo é o mesmo relatado em um estudo anterior16. NOTA: Camundongos diferentes no mesmo grupo são usados para a coleta de tecido de amostra e angiografia de fluorescência.</li>
</ol>5. Coloração H&E
<ol><li>Imergir tecido hepático fresco de camundongo em formalina a 10% por 24 horas.</li>
	<li>Após a incorporação do tecido em parafina, utilizar micrótomo de parafina para cortar o bloco de parafina em cortes com espessura de 4 μm e colocar dois cortes consecutivos na mesma lâmina. Pessoal experiente é necessário para padronizar a operação para evitar cortes nos dedos17.</li>
	<li>Coloque as fatias em uma prateleira de fatiamento, desencrefe-as em xileno, hidrate-as sucessivamente em etanol absoluto, etanol 95%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada e deixe de molho em cada uma delas por 5 min.</li>
	<li>Manchar os cortes com solução de hematoxilina por 5 min e mergulhá-los em ácido clorídrico a 1% e álcool a 75% por 5 s. Enxaguar as seções com água limpa e manchar com solução de eosina por 1 min.</li>
</ol>6. Coloração imunoistoquímica da CK19 e F4/80
<ol><li>Os três primeiros passos são os mesmos que os passos de incorporação, secção e desparafinação do tecido na seção de coloração H&E.</li>
	<li>Realizar o reparo do antígeno com tampão Tris-EDTA (10 mmol/L Tris base, 1 mmol/L solução de EDTA, pH 9,0), aquecer as seções em um forno de micro-ondas a 95°C por 10 min e, em seguida, removê-las e resfriá-las naturalmente à temperatura ambiente.</li>
	<li>Colocar os cortes teciduais em solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min para remover a peroxidase endógena.</li>
	<li>Tratar as fatias com 5% de soro de cabra para bloquear a ligação inespecífica.</li>
	<li>Adicionar citoqueratina 19 anti-rato primário ou anticorpo monoclonal F4/80 anti-rato às secções e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Incubar as secções com anticorpos secundários apropriados durante 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizar 3,3'-diaminobenzidina (DAB) como agente cromogênico para observar a reação cromogênica ao microscópio.</li>
	<li>Observe os cortes em microscópio de 40x para obter imagens e analisá-las conforme necessário.</li>
</ol>7. Coloração Sirius Red
<ol><li>Execute as três primeiras etapas de incorporação, secção e desparafinação de tecidos, conforme descrito na seção de coloração H&E.</li>
	<li>Após os cortes teciduais serem contracorados com hematoxilina, cobrir cada tecido com 50 μL de solução corante Sirius Red à temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Seque as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por 4 h, adicione uma gota de goma neutra a cada lâmina e use uma lamínula para cobrir lentamente o tecido para evitar bolhas. Deixe as lâminas em temperatura ambiente por 24 h para solidificar a goma neutra.</li>
	<li>Utilizar microscopia de contraste polarizado para observar os detalhes da deposição de colágeno; Selecione um campo de visão claro e adequado e ajuste o brilho e o equilíbrio de branco do campo visual do microscópio. Obtenha imagens e analise-as conforme necessário em um microscópio de 40x.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Em nosso estudo, usamos o anticorpo anti-Ly6G para eliminar ou diminuir células Gr-1+ em um modelo de camundongo de atresia biliar infectado com RRV para melhorar a síndrome BA aguda, prolongar a taxa de sobrevida e permitir que camundongos BA entrem na fase crônica. A redução da dose de anticorpos pode levar à AB crônica com fibrose hepática, o que indica que o número de células Gr-1+ altera o resultado da AB nas fases aguda e crônica. Em nosso estudo anterior, as células Gr-1+ foram reduzidas após a administração do anticorpo anti-Ly6G, e o status de sobrevida global dos camundongos BA foi melhorado15. Ao mesmo tempo, tem sido relatado que macrófagos Gr-1+ 19, neutrófilos Gr-1+ 20, células mieloides Gr-1+21 e granulócitos Gr-1+ podem aumentar a fibrose em alguns modelos animais 22. No entanto, neste estudo, as células Gr-1+ em camundongos foram parcialmente esgotadas com baixas doses de anticorpo anti-Ly6G, e os depósitos de colágeno permaneceram. Como resultado, mais tempo pode ser necessário para abordar a doença mais profundamente.
A aplicação do anticorpo anti-Ly6G diminuiu a inflamação, preservou parcialmente os ductos biliares e preveniu a morte aguda induzida pela AB em camundongos. No entanto, apenas 20% a 30% dos camundongos entraram na fase crônica da AB; isso pode estar relacionado ao momento e ao número de injeções do anticorpo anti-Ly6G. Precisamos explorar mais esse ponto-chave para melhorar a taxa de sucesso. Além disso, consideramos que não apenas as células Gr-1+ , mas também outras células imunes podem desempenhar papéis importantes, como células NK, células T, células B e macrófagos.
Quanto ao protocolo, alguns detalhes precisam ser observados. (i) Para evitar o vazamento de drogas injetáveis, utilizamos uma seringa de insulina de 1 mL com agulha de 0,33 mm de diâmetro, pois o diâmetro da agulha é pequeno e o orifício da agulha na seringa é pequeno, o que favorece a redução da possibilidade de vazamento da droga. (ii) Antes da injeção, o camundongo deve ser fixado para evitar que ele se mova, evitar o vazamento da droga e, assim, garantir ainda mais o efeito experimental. (iii) Durante a injeção da droga, injetamos a droga na superfície ou na margem inferior do fígado do camundongo, tanto quanto possível, para que a droga entrasse no abdômen e entrasse em contato com o fígado para fazer efeito. (iv) A injeção geralmente é feita a partir da parte superior da coxa direita do camundongo, porque o estômago e o baço do camundongo recém-nascido estão no abdômen esquerdo, e o estômago está cheio de leite. Se a agulha for inserida do lado esquerdo, ela pode facilmente perfurar o estômago, fazendo com que o leite flua para o abdômen, ou perfurar o baço, causando sangramento.
CD177 é um homólogo do Ly6G, e a expressão de CD177 em pacientes com AB tem sido investigada. CD177 pode ser usado como um marcador para o diagnóstico precoce de AB em crianças, indicando que as células CD177+ desempenham um papel significativo no curso daAB23. Ao analisar os dados de sequenciamento de RNA, nossa equipe descobriu que as células CD177 eram a população dominante de células Gr-1+ ; enquanto isso, camundongos Cd177−/− BALB/ c vacinados com RRV mostraram um início tardio de AB e redução da morbidade e mortalidade18. Assim, nosso modelo crônico de AB em camundongos tem vantagens óbvias para estudar a patogênese e a progressão da doença da AB; também fornece um modelo animal adequado para estudar potenciais tratamentos para BA.

A atresia biliar (AB) é uma doença hepatobiliar grave que ocorre frequentemente em lactentes e crianças pequenas; Especificamente, apresenta-se como colangiopatia obliterante com icterícia neonatal e fezes pálidas1. Suas características clínicas são destruição inflamatória dos ductos biliares intra e extra-hepáticos e fibrose progressiva, que eventualmente evolui para insuficiênciahepática2. De acordo com as estatísticas, a incidência de AB em países asiáticos é maior do que em países europeus e americanos, e a incidência de AB em países asiáticos é de 1/8.000. A etiologia da AB inclui infecção viral, desenvolvimento anormal das vias biliares, distúrbios imunológicos e variaçõesgenéticas 3. A cirurgia de Kasai é o método mais comumente utilizado para melhorar a colestase em crianças com AB, mas, em última análise, não pode impedir a progressão dafibrose4. O tratamento atual da AB depende principalmente do transplante hepático, que é limitado pela falta de fontes hepáticas. Um estudo aprofundado da patogênese da AB é o meio mais direto para resolver os desafios dessa doença. No entanto, os estudos sobre a patogênese da AB baseiam-se principalmente em modelos animais de AB, sendo crucial a seleção de um modelo animal apropriado.
A maioria dos estudos histopatológicos da AB tem demonstrado que a hiperplasia das vias biliares (PDB), a trombose biliar e a fibrose da veia porta são as características patológicas mais importantes da AB, e outras características patológicas de diferentes graus existem ao mesmo tempo, como infiltração de células inflamatórias portais e edema de hepatócitos5,6. Atualmente, há uma variedade de modelos de camundongos que mimetizam a AB, como o modelo crônico decamundongos alimentados com 3,5-die-thoxicarbonil-1,4-diidrocolidina (DDC) com obstrução segmentar do ducto biliar e pericolangite envolvendo os ductos biliares extra-hepáticos7 e o modelo de fibrose hepática em camundongos com injeção intraperitoneal de tetracloreto de carbono8. O modelo de ligadura das vias biliares (BDL) é caracterizado por icterícia e fibrose rápida da veiaporta9. O modelo de camundongos alimentados com alfa-naftilisotiocianato (ANIT) apresenta colangite confinada ao ducto biliar intra-hepático e lesão de hepatócitos10. Um modelo de camundongo com icterícia prolongada é induzido pela inoculação tardia do rotavírus rhesus (RRV)11. Embora haja uma variedade de modelos animais, especialmente modelos de camundongos, cada modelo tem suas próprias limitações. Eles podem simular apenas parte das características da doença da AB, como inflamação aguda ou fibrose hepática no processo de atresia biliar, e não há um modelo que seja altamente consistente com o processo da doença e as características patológicas da AB.
O modelo clássico de AB em camundongos é induzido por RRV, sendo este o modelo mais semelhante ao BA em humanos. No entanto, enquanto camundongos modelo de AB induzidos por RRV apresentam características clínicas e patológicas semelhantes a alguns daqueles de atresia biliar extra-hepática, esse modelo carece de fibrose hepática, o que limita sobremaneira o estudo aprofundado dos mecanismos de AB e o desenvolvimento de novostratamentos12. Portanto, este estudo desenvolveu um novo modelo de fibrose hepática crônica em camundongos BA. O anticorpo anti-Ly6G foi injetado intraperitonealmente antes da inoculação de RRV no dia do nascimento. Em seguida, 5-10 μg do anticorpo anti-Ly6G foram injetados quatro vezes, com intervalos de 2 dias entre cada injeção. Os sintomas de BA dos camundongos melhoraram, o tempo de sobrevivência foi prolongado e os camundongos entraram no estágio de fibrose crônica. Esse modelo não apenas simula a resposta de fase aguda da AB, mas também mimetiza os processos hepáticos e de fibrose progressiva. Assim, é um modelo animal mais adequado para o estudo mecanístico da AB, podendo fornecer uma base teórica para o desenvolvimento de futuros tratamentos para a AB.
A molécula Gr-1 é um marcador de superfície celular derivado do mielóide originalmente expresso em neutrófilos13. A depleção de anticorpos anti-Ly6G reduz os neutrófilos circulantes em mais de 90% e altera a resposta ativada por outras células imunes. As funções das populações de células Gr-1+ têm sido relatadas em vários estudos utilizando anticorpos sequestradores específicos, com efeitos variados identificados sobre as citocinas e a proteção imunológica mediada14. Estudamos a função de células Gr-1+ em modelos de camundongos BA inoculados com RRV. No entanto, como a molécula Gr-1 não foi encontrada para ser expressa em humanos, uma molécula semelhante, CD177, foi estudada em pacientes com AB15. Nossos dados comprovam a importância das populações de células Gr-1+ , particularmente na fase fibrótica crônica da doença, e fornecem um modelo animal adequado para investigar potenciais terapias de AB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balb/c mouse</td>
			<td>Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>20221000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse Ly6G</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>clone 1A8</td>
			<td>West Lebanon, NH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse cytokeratin 19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>clone TROMA III</td>
			<td>Iowa City, IA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-mouse F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB5580</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRV strain&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>MMU 18006</td>
			<td>Manassas, VA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica light microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica DMI8+DFC7000T</td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Pre-Analytical Process Automation System</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>7600 Clinical Analyzer</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane anesthetic</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sirius red dye</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DC0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral gum</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of chronic liver fibrosis for the study of biliary atresia

A atresia biliar (AB) é uma doença fatal que envolve icterícia obstrutiva, sendo a indicação mais comum de transplante hepático em crianças. Devido à etiologia complexa e patogênese desconhecida, ainda não existem tratamentos medicamentosos eficazes. Atualmente, o modelo clássico de camundongos BA induzidos por rotavírus rhesus (RRV) é o modelo mais comumente utilizado para estudar a patogênese da AB. Esse modelo é caracterizado por retardo de crescimento, icterícia da pele e mucosas, fezes argilosas e urina amarelo-escura. A histopatologia mostra inflamação hepática grave e obstrução dos ductos biliares intra e extra-hepáticos, que são semelhantes aos sintomas da AB humana. No entanto, os fígados de camundongos em estágio terminal neste modelo não possuem fibrose e não podem simular completamente as características da fibrose hepática na AB clínica. O presente estudo desenvolveu um novo modelo de fibrose hepática crônica em camundongos BA, injetando 5-10 μg de anticorpo anti-Ly6G quatro vezes, com intervalos de 2 dias após cada injeção. Os resultados mostraram que alguns dos camundongos formaram com sucesso a AB crônica com fibrose típica após o lapso de tempo, o que significa que esses camundongos representam um modelo animal adequado para o estudo mecanístico da BA induzida por vírus e uma plataforma para o desenvolvimento de futuros tratamentos de AB.

Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 5 μg de anticorpo anti-Ly6G dentro de 24 h após o nascimento e, em seguida, injetados intraperitonealmente com 20 μL de RRV 4 h depois. Em seguida, 10 μg de anticorpo anti-Ly6G foram injetados a cada 3 dias até o 12º dia (Figura 1A). A mediana do tempo de sobrevida no grupo VRS foi de 13 dias. Ao contrário, a maioria dos camundongos tratados com o anticorpo desenvolveu icterícia leve, e nenhuma perda de peso foi observada (Figura 1C). Cerca de 20%-30% dos camundongos tinham síndrome BA com icterícia de longo prazo e baixo peso corporal, mas sobreviveram por mais de 42 dias. Após o tratamento com anticorpos anti-Ly6G, o número de células Gr-1+ diminuiu15, e os camundongos entraram no estágio de fibrose crônica, denominado BA crônica. Os espécimes foram coletados no dia 12 e no dia 42, e os cortes de tecido corados com Sirius Red mostraram um aumento gradual da fibrose hepática. Os camundongos BA crônicos que sobreviveram por 42 dias foram usados para análises detalhadas. Além do tamanho pequeno, as orelhas, os pés e a pele da cauda apresentavam icterícia acentuada (setas azuis na Figura 1E). No dia 6 após a injeção de RRV, a cor das fezes dos camundongos tornou-se mais clara, e a cor da urina tornou-se mais escura; isso se tornou significativamente diferente do grupo controle no dia 12, quando os camundongos do grupo RRV apresentaram fezes brancas e urina amarelo-escura. No 42º dia, a urina e as fezes dos camundongos BA crônicos também mostraram características óbvias de icterícia (Figura 1D,E). Os fígados dos camundongos BA foram removidos e comparados com os dos controles. Os fígados eram menores (Figura 2B), lesões necróticas visíveis a olho nu (Figura 2A, triângulo negro) e um segmento de atresia de ductos biliares também foi observado extra-hepaticamente (Figura 2A, asteriscos brancos).
A análise do tecido hepático mostrou que a terapia com baixas doses de anti-Ly6G diminuiu a inflamação da veia porta. Entretanto, ainda foi observado acúmulo de células inflamatórias nos cortes de tecido hepático aos 42 dias (Figura 3A). A coloração Sirius Red mostrou um pequeno aumento na deposição de colágeno na região portal no 12º dia após a injeção do RRV. Além disso, não foram observadas alterações significativas na expressão de colágeno após o tratamento com o anticorpo anti-Ly6g, mas a expressão de colágeno nas amostras de tecido BA no 42º dia aumentou significativamente (Figura 3B). Quando examinado ao microscópio de luz polarizada, observou-se que as fibras colágenas se acumularam no tecido hepático adjacente. Uma deposição substancial de colágeno, predominantemente verde, foi observada nos espécimes de tecido BA no dia 42 (Figura 3C), e a deposição de colágeno aumentou ainda mais em camundongos que sobreviveram por 42 dias sem ganho de peso. Com a redução da inflamação portal, células do ducto biliar CK19+ foram observadas no 12º dia. No 42º dia, entretanto, os ductos biliares maduros eram pouco detectáveis, embora tenha sido observado aumento das células do ducto biliar da CK19+ (Figura 4A, setas vermelhas indicam células epiteliais do ducto biliar). No caso de ductos biliares extra-hepáticos em camundongos com AB crônica, a dissecção seriada da região porta de camundongos revelou que os ductos biliares extra-hepáticos estavam bloqueados e apresentavam infiltrado inflamatório de macrófagos (Figura 4B, setas pretas indicam macrófagos).
Em comparação com RRV isoladamente, o tratamento com uma dose baixa de anticorpo anti-Ly6G diminuiu a lesão hepática em termos de níveis de enzimas hepáticas no dia 12 após a inoculação de RRV. Os níveis de alanina aminotransferase e fosfatase alcalina no fígado foram maiores no grupo BA crônica do que no grupo controle normal. As alterações mais pronunciadas foram encontradas nos níveis de bilirrubina, com camundongos RRV + anti-Ly6G mostrando níveis reduzidos de TBIL, DBIL e IBIL na AB aguda em contraste com RRV isoladamente. Em camundongos com AB crônica, os níveis de TBIL, DBIL e IBIL estavam aumentados (Figura 5), indicando que a função hepática estava significativamente reduzida no estágio de fibrose crônica da AB.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg"> Figura 1: Efeitos do tratamento com anticorpos anti-Ly6G em um modelo de atresia biliar em camundongos infectados com RRV. (A) Ilustração esquemática de baixas doses de anticorpos para induzir AB de fase aguda e crônica em camundongos com setas indicando o tempo de injeção do anticorpo e RRV. (B) Curvas de sobrevida dos camundongos do grupo controle normal (Cont.), grupo rotavírus rhesus (RRV) e grupo de anticorpos RRV + anti-Ly6G. (C) Curvas de peso corporal dos camundongos de cada grupo. (D) Imagens representativas dos camundongos e suas fezes e urina em cada grupo no dia 12. (E) Imagens representativas dos camundongos e suas fezes e urina em cada grupo no dia 42. As setas azuis indicam as orelhas e a cauda amarelas. Essa figura foi reimpressa com permissão de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg"> Figura 2: Efeitos do tratamento com anticorpos anti-Ly6G no fígado em um modelo de atresia biliar de camundongos infectados com RRV . (A) Comparação da anatomia hepática e angiografia por fluorescência do ducto biliar extra-hepático entre camundongos BA crônicos (à direita) e camundongos normais no dia 42. (B) Comparação do tamanho do fígado entre camundongos BA crônicos e camundongos normais. O triângulo preto indica necrose hepática em camundongos com AB crônica. O asterisco branco indica atresia das vias biliares extra-hepáticas. Essa figura foi reimpressa com permissão de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg"> Figura 3: Cortes de tecido hepático dos camundongos do grupo controle normal (Cont.), grupo rotavírus rhesus (RRV) e grupo de anticorpos RRV + anti-Ly6G nos dias 12 e 42. (A) Imagens de cortes de tecido hepático corados com hematoxilina e eosina (H&E). (B) A coloração Sirius Red mostrou deposição de colágeno (PSR). (C) Observação adicional dos cortes por microscopia de luz polarizada (Pol. Light). Abreviação: PV = veia porta. Barra de escala = 50 μm. Esse valor foi modificado de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg"> Figura 4: Coloração imunoistoquímica dos cortes de tecido hepático do grupo controle normal (Cont.), grupo rotavírus rhesus (RRV) e grupo de anticorpos RRV + anti-Ly6G nos dias 12 e 42 . (A) A expressão do marcador de células epiteliais do ducto biliar (CK19) em diferentes grupos de tratamento. (B) Infiltração de células inflamatórias de macrófagos foi demonstrada em diferentes grupos de tratamento. Abreviação: PV = veia porta. A seta vermelha indica células epiteliais do ducto biliar. A seta preta indica macrófagos. Barra de escala = 50 μm. Esse valor foi modificado de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg"> Figura 5: Comparação da função hepática em camundongos nos diferentes grupos de tratamento. Sangue de camundongos foi coletado após o experimento e testado no laboratório do hospital. Cada grupo continha de três a cinco camundongos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abreviações: ALT = alanina aminotransferase; AST = aspartato aminotransferase; FA = fosfatase alcalina; TBIL = bilirrubina total; DBIL = bilirrubina direta; IBIL = bilirrubina indireta. Esse valor foi modificado de Zhang et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Estabelecemos um modelo murino de fibrose hepática crônica, que fornece um modelo animal adequado para o estudo mecanístico da atresia biliar (AB) induzida por vírus e uma plataforma para futuros tratamentos de AB.

Um Modelo Murino de Fibrose Hepática Crônica para o Estudo da Atresia Biliar

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Usamos com sucesso este método para criar um modelo de camundongo que seja mais consistente com as alterações patológicas da atresia biliar. Esta técnica pode simular os sintomas de atresia biliar aguda e crônica, o que é útil para futuras pesquisas sobre o mecanismo da doença. Após o uso do anticorpo, o tempo de sobrevida dos camundongos foi prolongado e os sintomas foram aliviados, sugerindo o efeito terapêutico do anticorpo na atresia biliar.Depois de dividir os camundongos neonatais em diferentes grupos, conforme descrito no manuscrito, pré-trate cada camundongo com uma injeção intraperitoneal de cinco microgramas de anticorpo anti-Ly6G quatro horas antes da injeção de rotavírus rhesus ou RRV para esgotar as células Gr1-positivas. Dentro de 24 horas após o nascimento, injetar intraperitonealmente o camundongo neonatal com 20 microlitros de rotavírus rhesus ou soro fisiológico. Após a injeção de RRV, administrar 20 microgramas de anticorpo anti-Ly6G no abdómen do rato.Verifique e registre a aparência, peso e sobrevivência de todos os ratos diariamente. Para injeção intraperitoneal, exponha o abdômen do rato jovem beliscando a pele do pescoço com o dedo indicador e polegar de uma mão e segurando suavemente as patas traseiras do rato com o dedo anelar e o dedo da cauda. Levante a agulha da seringa numa inclinação ascendente e introduza a agulha na coxa média da perna traseira direita do rato num ângulo de 15 graus com a pele.Ao mover a agulha ao longo do trajeto subcutâneo até atingir a borda costal direita do camundongo, direcione a agulha para baixo na cavidade abdominal e injete o líquido sob o fígado do camundongo. Puxe a agulha imediatamente após a injeção. Observe se há sangramento ou vazamento no local da injeção.Após anestesiar o camundongo no 12º dia, dissecá-lo ao microscópio. Insira uma seringa de insulina de um mililitro no ventrículo esquerdo do coração para coletar sangue. Centrifugar o sangue a 400 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e separar o soro para medições da função hepática.Disseque o fígado e o baço de camundongo dos tecidos circundantes usando tesoura e pinça. Fotografe a aparência geral do fígado e do ducto biliar. Após a anestesia inalatória, expor o fígado, a vesícula biliar e os ductos biliares extra-hepáticos com tesoura e cotonetes.Sob um microscópio de postura, injete cinco a 10 microlitros do corante fluorescente Rodamina 123 na vesícula biliar com uma seringa de insulina de um mililitro e tire fotos. Mergulhe o tecido hepático fresco de camundongos em formalina a 10% por 24 horas. Uma vez que o tecido está incluído em parafina, use um micrótomo de parafina para cortar o bloco de parafina em cortes com uma espessura de quatro micrômetros e coloque dois cortes consecutivos na mesma lâmina.Em seguida, coloque as fatias em uma prateleira de fatiamento, desencrefe-as em xileno e hidrate-as sucessivamente em etanol absoluto, etanol 95%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada por cinco minutos cada. Manchar os cortes com solução de hematoxilina por cinco minutos e embeber-os em ácido clorídrico a 1% e álcool a 75% por cinco segundos. Depois de enxaguar as seções com água limpa, manche-as com solução de eosina por um minuto.Preparar os cortes de tecido para coloração, como demonstrado anteriormente, e realizar o reparo do antígeno com tampão Tris-EDTA. Aqueça as seções em um forno de micro-ondas a 95 graus Celsius por 10 minutos, depois retire-as e resfrie-as naturalmente à temperatura ambiente. Para remover a peroxidase endógena, colocar os cortes de tecido em peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos e tratar as fatias com soro de cabra a 5% para bloquear a ligação inespecífica.Em seguida, adicione citoqueratina 19 primária de rato anti-rato ou anticorpo monoclonal F4/80 anti-rato às secções e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Incubar as secções com anticorpos secundários apropriados durante 30 minutos à temperatura ambiente. Use 3,3-prime-diaminobenzidina como agente cromogênico para observar a reação cromogênica ao microscópio.Observe os cortes em microscópio de 40x para obter imagens e analisá-las conforme necessário. Uma vez preparados os cortes teciduais e contracorados com hematoxilina, cubra cada tecido com 50 microlitros de solução corante vermelho sirius à temperatura ambiente por uma hora. Seque as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por quatro horas, adicione uma gota de goma neutra a cada lâmina e use uma tampa para cobrir o tecido para evitar bolhas.Deixe as lâminas em temperatura ambiente por 24 horas para solidificar a goma neutra. Observe os detalhes da deposição de colágeno usando microscopia de luz de contraste polarizado. Selecione um campo de visão claro e adequado e ajuste o brilho e o equilíbrio de branco do campo visual do microscópio.Obter imagens e analisá-las conforme necessário em um microscópio de 40x. Após a injeção de RRV, a mediana do tempo de sobrevida no grupo RRV foi de 13 dias. A maioria dos camundongos tratados com o anticorpo desenvolveu icterícia leve e nenhuma perda de peso foi observada.Os fígados de camundongos BA apresentaram lesões necróticas e um segmento extra-hepático de atresia de ductos biliares. O tamanho do fígado é menor do que os controles. A análise histológica mostrou que a terapia com baixas doses de anti-Ly6G diminuiu a inflamação da veia porta.Acúmulo de células inflamatórias ainda foi observado nos cortes de tecido hepático no 42º dia. No 12º dia, houve discreto aumento da deposição de colágeno na região portal. No 42º dia, a expressão de colágeno aumentou significativamente, e deposição substancial de colágeno foi observada no tecido BA.As células positivas para CK19 foram observadas no 12º dia. No 42º dia, as células positivas para CK19 aumentaram, mas havia poucos ductos biliares maduros. O ducto biliar extra-hepático em camundongos BA crônicos estava bloqueado e apresentava infiltrados inflamatórios de micrófagos.Os níveis de ALT e FA no fígado foram maiores no grupo BA crônica do que no grupo controle normal. Os níveis de bilirrubina total, bilirrubina direta e bilirrubina indireta estavam aumentados, indicando que a função hepática estava significativamente reduzida na fase de fibrose crônica da AB. A injeção deve ser feita com cautela para não perfurar o fígado de camundongo. Após a injeção, devemos levar cerca de 10 segundos para observar o estado do rato e limpar o sangue da ferida.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Um modelo de mouse transiente Transientized IL-8 para o<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoramento de Longo Prazo de Respostas Inflamatórias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Um método de nanopartículas prata para atenuar a síndrome de Atresia biliar em ratos

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...