1.4K Views
•
08:37 min
•
June 23rd, 2023
DOI :
June 23rd, 2023
•0:05
Introduction
0:48
STEM Setup
4:37
Placing the Specimen and Recording an Image
6:58
Recording an Image
7:23
Results: Visualization of the Organelles
8:03
Conclusion
Transcript
TEM-tomografi er mye brukt til avbildning av celler, men det er svært begrenset når det gjelder prøvetykkelse. FIB SEM og myk røntgentomografi kan brukes til større prøver, om enn med lavere oppløsning. STEM-tomografi fyller dette gapet perfekt.
STEM-tomografi gir en titt på mikron tykke prøver med en oppløsning på noen få nanometer. Kombinasjonen med kryogen preparering lar oss se på biologiske prøver og seksjoner i 3D. Gå gjennom det grunnleggende innen STEM-optikk for å forstå bildedannelse og sikre at serviceteknikeren har justert stem- og Lomax-stemmodusene godt, og at kalibreringstrinnene ser ut som de i videoen.
For å begynne, last inn kolonnejusteringsfilen og åpne kolonneverdiene. Hvis du bruker en sideinngangskryoholder, åpner du kryoskjoldet og starter i TEM-modus. Strålen skal vises på skjermen.
Senk forstørrelsen hvis strålen ikke vises. Bring mikroskopet til eusentrisk fokus ved å trykke på knappen på kontrollpanelet. Sett punktstørrelsen til en praktisk verdi for å visualisere fluorescerende skjerm direkte, eller med det innebygde kameraet.
Sett mikroskopet i STEM-modus og kontroller at fokuset bruker kondensatorlinsene i stedet for objektivet. Sett eusentrisk fokus på panelet og gå ut av diffraksjonsmodus for innledende justeringer. Forsikre deg om at strålen ikke er tom og reduser forstørrelsen til strålen vises på skjermen.
Juster stråleskiftet til midten og øk forstørrelsen i trinn opp til 70 000, mens du holder strålen i midten. Sett deretter inn ønsket kondensatoråpning, vanligvis 50 mikrometer for mikrosondemodus, og kontroller blenderåpningssentreringen. Mens du vrir fokusknappen frem og tilbake, skal stedet utvide seg og trekke seg sammen, men forbli på plass, som om et fly kutter et imaginært vertikalt timeglass.
Hvis blenderåpningen ikke er sentrert, vil belysningen skifte sideveis som om timeglasset var vippet. Bring strålen i fokus, trykk intensitetslistefokus i justeringsfanen, eller gå tilbake til eusentrisk fokus. Juster stråleposisjonen til midten og juster rotasjonssenteret.
Vri nå fokustrinnhjulet til et minimum, eller ett trinn over, slik at strålen pulserer forsiktig og sørger for at den står stille når fokuset beveger seg opp og ned. Velg pivotpunktene og bring de to punktene sammen med X- og Y-justeringer. Juster kondensatorstigmatorene for å gjøre strålen rund.
Gå opp og ned gjennom fokus for å optimalisere. Det bør ikke være noen tendens til å strekke seg i den ene eller den andre retningen når du går gjennom fokus. Normaliser linsene, og øk deretter forstørrelsen gradvis til ca. 240 000, mens du bruker stråleskiftet for å holde punktet sentrert og gjenta rotasjonssenteret og dreiepunktjusteringene.
Gå tilbake til diffraksjonsmodus. På dette stadiet skal strålen vises som en jevn plate på fluorescerende skjerm. Kameralengden styrer nå effektivt den optiske avstanden til detektoren som en røntgenkrystallografi.
Bytt den og se på når platen trekker seg sammen og forstørres som om skjermplasseringen vil bevege seg mot eller bort fra prøven. Denne kjeglen representerer lysfeltbelysningen. For å aktivere STEM-modus ved høy forstørrelse, start med lysfeltstammedetektoren og juster diffraksjonsjusteringen for å sentrere strålen med ønsket kameralengde.
Slå på brightfield-markeringen på skjermen, reduser kameralengden til 330, løft skjermen og sett inn detektorene. Start en skanning i mikroskopprogramvaren. Bruk omfangsvisningen til å hjelpe deg mens du justerer innstillingene for lysstyrke og kontrast som beskrevet i manuskriptet.
Gjenta justeringen flere ganger. Returner mikroskopet til en relativt lav forstørrelse i registeret med høy forstørrelse, uten å gå inn i modus for lav forstørrelse. Sett inn fluorescerende skjerm og noter skjermen gjeldende for referanse.
Som i TEM kan strømmen endres med pistollinsen og punktstørrelsesinnstillingene med økende tall som tilsvarer redusert strøm. På dette tidspunktet lagrer du et FEG-register for å lette en retur til standardverdier. Gå til LMTEM-modus for å se prøven.
Sett inn prøven. Ta prøven til eucentrisk høyde. Det er flere metoder for å gjøre dette.
Du kan for eksempel bruke scenewobbleren til å vippe rutenettet mens du flytter prøvehøyden langs Z-aksen til bildet slutter å skifte sideveis. Alternativt kan du merke noen funksjoner på skjermen og vippe scenen til 10 til 30 grader. Funksjonen vil bevege seg sideveis.
Juster prøvehøyden for å få den tilbake til sin opprinnelige posisjon. Øk forstørrelsen eller trinnhellingen for å finjustere og flytte hellingen til null grader. Gå nå tilbake til STEM-modus og sett inn STEM-detektoren.
Forsikre deg om at aktiver LM-skanning ikke er merket av. Gå til laveste høye forstørrelsesmodus. Still kondensatoren astigmatisme ved metoden.
Med strålen over et tynt prøveområde, fokuser du på punktet der den overførte strålen blåser opp mellom skyggebilder av prøven på hver side. Juster deretter kondensatorinnstillingen for å gjøre den sentrale skiven rund. Dette krever litt øvelse, spesielt for kryogene prøver.
Gå tilbake til 50 mikrometer blenderåpning og oppdater FEG-registeret. Gå til LMSTEM-modus og fortsett å skanne for å finne et interessant område. Juster om nødvendig detektorens lysstyrke og kontrastinnstillinger omtrent på dette punktet.
Trykk på eusentrisk fokus, øk forstørrelsen og avgrens fokuset mens du skanner ved hjelp av fokussløyfen fra mikroskopet og kontroller astigmatismen på gullperler. Til nå utføres alt i nano-sondemodus. Legg merke til at innsetting av en mindre kondensatoråpning reduserer semikonvergensvinkelen, noe som er nyttig for tykke prøver.
En alternativ tilnærming med TFS-instrumenter er å bytte til mikrosondemodus, noe som fører til redusert semi-konvergensvinkel. Deretter justerer du kameralengden for å få oppsamlingsvinkelen tre ganger større enn konvergensvinkelen; dvs. e, BF-detektorområdemarkeringene på skjermen er rundt tre ganger større enn strålen.
Beregn dosen for opptak ved hjelp av en ligning. Som en tommelfingerregel, sikte fra 100 til 150 elektroner per kvadratblekkstrøm for hele tomografen. Sett scenen tilbake til en helhet og juster strålestrømmen ved hjelp av punktstørrelse og/eller pistollinseinnstillinger for å nå ønsket skjermstrøm.
Rutenettkart med full forstørrelse registrert i STEM-modus viser områdene med interessante celler. Cellene virker delvis lyse med elektroner spredt mot HAADF-detektoren. Kart med middels oppløsning tatt opp i STEM-modus viste to ankerkart med middels oppløsning.
Null graders helling av en stammetiltserie tillot visualisering av kalsiumfosfatavsetninger, cristae og gullfiducialmarkører av en mitokondrion. Volumgjengivelse av 60 nanometer og 40 nanometer tykke seksjoner vises. Kryostammetomografi, eller CSTET, gir en bro mellom strukturbiologi og cellebiologi, samt en kontekst for superoppløsningsfluorescens.
Uten behov for seksjonering eller lamellforberedelse, kan vi se hele mobilteatret i en nær innfødt tilstand.
Kryo-STEM-tomografi gir et middel til å visualisere organeller av intakte celler uten innebygging, seksjonering eller andre invasive preparater. Den oppnådde 3D-oppløsningen ligger for tiden i området noen få nanometer, med et synsfelt på flere mikrometer og en tilgjengelig tykkelse i størrelsesorden 1 μm.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved