Name: standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis
Uploaded: 2023-03-17T14:10:00
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Diese Arbeit wurde durch das Xinglin Talent Program der Chengdu University of TCM (Nr. 030058191), die Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) und die National Natural Science Foundation of China (82204765) finanziert.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Wiegen Sie 1 g der AMS-Probe genau ab und geben Sie sie in einen Erlenmeyerkolben mit 30 ml 80%igem Methanol. Das Gemisch wird für 30 Minuten bei 25 °C in ein Ultraschallgerät überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 x g für 5 Minuten. Anmerkungen: Die Frequenz des Ultraschall-Bad-Ultraschallgeräts beträgt 40 KHz.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen mikroporösen Membranfilter (0,22 μm, nur organisch) vor. Filtern Sie den...

<ol>
	<li>Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+with+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry+for+qualitative+analysis+of+herbal+medicines.">Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematically+investigating+the+pharmacological+mechanism+of+Dazhu+Hongjingtian+in+the+prevention+and+treatment+of+acute+mountain+sickness+by+integrating+UPLC/Q-TOF-MS/MS+analysis+and+network+pharmacology.">Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).</li><li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+using+accurate+mass+MS/MS+search.">Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search.</a> Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-faceted+mass+spectrometric+investigation+of+neuropeptides+in+Callinectes+sapidus.">Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).</li><li>Seetaloo, N., Phillips, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+hydrogen/deuterium-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+alpha-synuclein+structural+dynamics+under+physiological+conditions.">Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).</li><li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+uptake+of+platinum-and+ruthenium-based+compound+exposure+in+zebrafish+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+with+broader+applications.">Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).</li><li>Chang, H. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uracil-DNA+glycosylase+assay+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+analysis.">Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+and+identification+of+major+constituents+in+Jitai+tablets+by+high-performance+liquid+chromatography/diode-array+detection+coupled+with+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).</li><li>Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+and+features+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+the+analysis+of+traditional+Chinese+medicine.">The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).</li><li>Ichou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+activation+time+effects+and+the+internal+energy+distributions+for+the+CID,+PQD+and+HCD+excitation+modes.">Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+oligomer+formation+in+glucose+dehydration+by+CO2+and+tetrahydrofuran.">Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran.</a> Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+effects+on+degradative+condensation+side+reactions+of+fructose+in+its+initial+conversion+to+5-Hydroxymethylfurfural.">Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural.</a> ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).</li><li>Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+research+of+Tibetan+medicine.">Modern research of Tibetan medicine.</a> World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).</li><li>Shang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethno-veterinary+survey+of+medicinal+plants+in+Ruoergai+region,+Sichuan+province,+China.">Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China.</a> Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).</li><li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalcone+derivatives+from+Abelmoschus+manihot+seeds+restrain+NLRP3+inflammasome+assembly+by+inhibiting+ASC+oligomerization.">Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+the+reaction+network+of+humin+formation+at+the+initial+stage+of+fructose+dehydration+in+water.">Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water.</a> Green Energy &amp; Environment. , (2022).</li><li>Hua, Y., Jenke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+sensitivity+of+an+LC-MS+method+for+screening+material+extracts+for+organic+extractables+via+mobile+phase+optimization.">Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization.</a> Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).</li><li>Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+characterization+and+distribution+of+monoterpene+indole+alkaloids+in+Rauwolfia+species+by+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer.">Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).</li><li>Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+Ion+activation+in+tandem+mass+spectrometry+using+ultra-high+resolution+instrumentation.">Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).</li><li>Wu, S. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+determination+of+disulfide+linkages+in+recombinant+therapeutic+proteins+using+online+LC&#8722;MS+with+electron-transfer+dissociation.">Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC&#8722;MS with electron-transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).</li><li>Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+as+a+potential+tool+to+assign+disulfide+bonds+arrangements+in+peptides+with+multiple+disulfide+bridges.">Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges.</a> Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).</li></ol>

IT-MS und seineMS-n-Technologie bieten einen neuen Ansatz zur Identifizierung der Struktur von TCM-Spurenverbindungen. Im Gegensatz zu Q-TOF-MS, das die Fragmentionen nicht tief identifizieren konnte, zeichnet sich die IT-MS mit MSn-Technologie durch ihre Fähigkeit aus, Ionen zu isolieren und zu akkumulieren. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung von Spurenstoffen in der tibetischen Medizin mit Hilfe der IT-MS- undMS-n-Technik . Die Methode verwendet den n-Wert in MS...

Die qualitative Analyse von Spurenelementen in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) ist zu einem entscheidenden Thema in der Forschung geworden. Aufgrund der hohen Anzahl von Verbindungen in der TCM ist es schwierig, sie für die Analyse von Kernspinresonanzspektrometern (NMR) oder Röntgendiffraktometern (XRD) zu isolieren, wodurch massenspektrometrische (MS) basierte Methoden, die nur geringe Probenvolumina erfordern, immer beliebter werden. Darüber hinaus wurde die Flüssigchromatographie (LC) gekoppelt mit MS in den letzten Jahren in der TCM-Forschung zur verbesserten Trennung komplexer Proben und zur qualitativen Analyse chemischer Verbindungen eingesetzt1. Eine gängige Methode ist die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die in der qualitativen Forschung zur tibetischen Medizin weit verbreitet ist2. Bei dieser Methode werden komplexe Komponenten in einer LC-Säule angereichert und separiert, und das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) der Addukt-Ionen wird mit einem MS-Detektor beobachtet. Die Suche in Tandem-MS-DATENBANKEN (MS/MS oder MS2) ist derzeit der schnellste Ansatz für zuverlässige Verbindungsannotationen in der Analyse kleiner Moleküle unter Verwendung von Quadrupol-Flugzeit-MS (Q-TOF) MS und Orbitrap MS3. Die schlechte Qualität der Datenbanken und das Vorhandensein verschiedener Isomere erschweren jedoch die Identifizierung unbekannter Verbindungen. Darüber hinaus sind die von der MS/MS-Datenbank bereitgestellten Informationen begrenzt 4,5,6,7. Es ist wichtig, die chemischen Verbindungen in jeder TCM unter Verwendung eines allgemeinen Protokolls zu untersuchen, das auf andere TCM angewendet werden kann.
IT-MS fängt eine breite Palette von Ionen ein, indem unterschiedliche Hochfrequenzspannungen (HF) an die Ringelektroden8 angelegt werden. IT-MS kann mehrstufige MS-Scans in verschiedenen zeitlichen Reihenfolgen in Zeitreihen durchführen und eine mehrstufige MS (MS n)-Fragmentierung der Inhaltsstoffe ermöglichen, wobein die Anzahl der Produktionenstufen9 ist. Die lineare IT-MS gilt als die beste für die Strukturidentifikation, da sie für sequentielleMS-n-Experimente verwendet werden kann10. Gezielte Ionen können isoliert und in linearer IT-MS1 akkumuliert werden. Das MS n (n ≥ 3) in IT-MS liefert mehr Fragmentinformationen als MS/MS in Q-TOF-MS. Da IT-MS das Zielion und seine Fragmentionen nicht binden kann, ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen, einschließlich Isomeren1. DieMSN-Technologie wird in großem Umfang zur Strukturanalyse unbekannter Proteine, Peptide und Polysaccharide eingesetzt11,12. Die Häufigkeit von Fragmentionen in MSn liefert mehr molekulare Fragmentinformationen über Zielverbindungen in komplexen Proben als MS/MS in Q-TOF-MS. Daher ist die Anwendung derMSN-Technologie auf die Strukturidentifikation in der TCM unerlässlich.
Die tibetische Medizin ist ein bedeutender Bestandteil der TCM13, und diese Arzneimittel werden hauptsächlich aus Tieren, Pflanzen und Mineralien gewonnen, die im Plateaugebiet14 vorkommen. Die tibetische Medizin Abelmoschus manihot Samen (AMS) ist der Samen von Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS ist ein traditionelles pflanzliches Arzneimittel, das zur Behandlung von Erkrankungen wie Neurodermitis, Rheuma und Lepra eingesetzt wird. Es enthält Chalkon, das antibakterielle, antimykotische, krebshemmende, antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen besitzt15. In der vorliegenden Arbeit wurden dieMS-n-Verfahren verbessert und eine detaillierte Methode zur Identifizierung von Substanzstrukturen in der tibetischen Medizin AMS mittels IT-MS und MSn entwickelt. Bestimmte MS-Parameter, einschließlich des Ionenmodus, der Scanreichweite und des Kollisionsmodus, wurden optimiert, um Probleme bei der Identifizierung von Spurenverbindungen zu überwinden. Ziel dieser Studie ist es, die standardisierte Strukturidentifikation von Spurenstoffen in der TCM zu fördern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 75-05-8</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Knowles</td>
			<td>CAS 64-18-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Tune</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.8.0</td>
			<td>MS control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 67-56-1</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 7732-18-5</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.0</td>
			<td>LC-IT-MS operational software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis

Tibetische Arzneimittel sind komplex und enthalten zahlreiche unbekannte Verbindungen, so dass eine eingehende Erforschung ihrer molekularen Strukturen von entscheidender Bedeutung ist. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wird häufig zur Extraktion tibetischer Medizin verwendet. Viele unvorhersehbare unbekannte Verbindungen bleiben jedoch nach der Verwendung der Spectrum-Datenbank zurück. In der vorliegenden Arbeit wurde eine universelle Methode zur Identifizierung von Komponenten in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie (IT-MS) entwickelt. Die Methode umfasst standardisierte und programmierte Protokolle für die Probenvorbereitung, die MS-Einstellung, den LC-Prerun, die Methodenetablierung, die MS-Erfassung, den mehrstufigen MS-Betrieb und die manuelle Datenanalyse. Zwei repräsentative Verbindungen in den Samen der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot wurden mittels mehrstufiger Fragmentierung identifiziert, wobei typische Substanzstrukturen detailliert analysiert wurden. Darüber hinaus werden Aspekte wie die Auswahl des Ionenmodus, die mobile Phaseneinstellung, die Optimierung des Scanbereichs, die Kontrolle der Kollisionsenergie, die Umschaltung des Kollisionsmodus, die Fragmentierungsfaktoren und die Grenzen der Methode erörtert. Die entwickelte standardisierte Analysemethode ist universell einsetzbar und kann auf unbekannte Verbindungen in der tibetischen Medizin angewendet werden.

Cellobiose wurde als Modell verwendet, um die Machbarkeit von MSn im positiven Ionenmodus zu überprüfen. Wie in Abbildung 2A gezeigt, erzeugte die ESI-MS (positiver Ionenmodus) der Cellobiose [C 12 H22O11]+ das protonierte Molekül [M+H]+ bei m/z 365. Der Produktionenscan (CID-MS/MS) von [M+H]+ bei m/z 365 ergab das zweite Fragmention bei m/z 305 (Abbildung 2B), das mit MS3 und MS4 Analysen w...

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Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll und Design, das angewendet werden könnte, um Spuren und Nebenbestandteile in den komplexen Naturstoffformulierungen (Matrixen) in der tibetischen Medizin zu identifizieren.

Standardisierte Identifizierung der Substanzstruktur in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie und mehrstufiger Fragmentierungsanalyse

Tibetan medicines are complex and contain numerous unknown compounds, making in-depth research on their molecular structures crucial. Liquid ...

Diese Methode kann Forschern helfen, die Strukturen tibetischer Medizinverbindungen, insbesondere der Bestandteile des Baumes, zu analysieren. Es kann einen Einblick in die qualitative Untersuchung des Gehalts an Verbindungen in der Naturmedizin geben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Genauigkeit der in diesem Fall erhaltenen Verbindungsstruktur höher ist als die der Datenbank.Diese Technik kann bei der Strukturanalyse von Stoffwechselzwischenprodukten in Blase oder Urin eingesetzt werden. Zu Beginn die Samenprobenvorbereitung der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot. Wiegen Sie ein Gramm AMS genau ab und geben Sie es in einen Erlenmeyerkolben mit 30 Millilitern 80%igem Methanol.Mit einem Ultraschall-Bad-Ultraschallgerät bei 40 Kilohertz wird das Gemisch 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius extrahiert. Dann zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 14.000 g. Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen mikroporösen organischen 0,22-Mikron-Membranfilter vor und filtrieren Sie den Überstand in eine Zwei-Milliliter-Probenflasche.Öffnen Sie nach dem Einschalten des Schalters der Vakuumpumpe das Hauptventil des Argonzylinders zusammen mit dem Partialdruckventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 Megapascal ein. Öffnen Sie dann das Stickstoffventil. Starten Sie die Massenspektrometrie-Steuerungssoftware (MS).Klicken Sie im Software-Panel auf Beheizte ESI-Quelle und stellen Sie die MS-Parameter ein, einschließlich Heiztemperatur, Gasdurchflussraten, Sprühspannung für positive und negative Modi und Kapillartemperatur. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden, um die Ionenquelle für die Flüssigkeitschromatographie oder LC zu aktivieren.Bereiten Sie die mobilen Phasen A und B mit 0,1%iger Ameisensäure in einer wässrigen Lösung in reinem Acetonitril vor. Entgasen Sie sie mindestens 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät mit 40 Kilohertz, bevor Sie die Lösungen an die Flüssigkeitskanäle A bzw. B anschließen.Bereiten Sie eine Methanol-Wasserlösung im Verhältnis 1:9 vor und füllen Sie sie dann manuell in die Reinigungsflüssigkeitsflaschen der Pumpe und des Injektors. Klicken Sie nach dem Start der LC-MS-Steuerungssoftware auf Direct Control, um das LC-Bedienfeld zu öffnen. Öffnen Sie das Spülventil gegen den Uhrzeigersinn am Pumpenmodul.Klicken Sie auf Mehr Option, um die Pumpeneinstellung zu öffnen und die Spülparameter drei Minuten lang auf fünf Milliliter pro Minute einzustellen. Klicken Sie auf Bereinigen, um die Entfernung der Blase zu starten. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie das Spülventil.Klicken Sie dann auf Spritze grundieren, um die Spritze drei Zyklen lang zu spülen, auf Pufferschleife waschen, um die Schleife für einen Zyklus zu spülen, und auf Nadel extern waschen, um die Nadel für einen Zyklus zu waschen. Stellen Sie die Probenflasche in den Probenehmer. Klicken Sie auf Geräte-Setup, um das Fenster zur Methodenbearbeitung zu öffnen, und klicken Sie auf Neu, um eine neue LC-MS-Gerätemethode zu erstellen.Legen Sie eine Gesamtlaufzeit für die Methode fest und legen Sie die Druckgrenze fest. Gesamtdurchflussrate, Durchflussgradient, Probentemperatur, Säulentemperatur und Bereitschaftstemperaturdelta im Methodenbearbeitungsfenster. Wählen Sie für die MS-Methode den Experimenttyp Allgemeines MS oder MSn aus.Geben Sie Werte für die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Umlenkwerte und die Dauer ein. Klicken Sie auf Speichern, um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren. Klicken Sie auf Sequenzeinrichtung, um die Sequenztabelle zu öffnen, in der Sie die Informationen zu Probentyp, Datei, Name, Pfad, Proben-ID, Gerätemethode, Position und Injektionsvolumen eingeben.Zeichnen Sie die Sequenztabelle auf, indem Sie auf Speichern klicken, implementieren Sie dann die Einstellungen und starten Sie die MS-Erfassung. Um die MS-Daten in die Datenverarbeitungssoftware zu laden, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei. Wählen Sie im Basis-Peak-Chromatogramm BPI die maximale Fläche unter der Kurve oder AUC aus, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen.Das entsprechende MS-Spektrum wird im selben Fenster angezeigt. Wählen Sie ein Zielion für die nächste MS/MS-Analyse aus. Öffnen Sie das Fenster zum Bearbeiten der Methode erneut, und legen Sie in der MSn-Einstellungstabelle das m/z des Zielions auf eine Dezimalstelle in der Spalte Übergeordnete Masse fest.Wählen Sie als Nächstes den Kollisionsmodus und geben Sie die Kollisionsenergie oder den CE-Wert ein. Stellen Sie den MS/MS-Scanbereich ein. Klicken Sie auf Speichern, um die MS-Methode aufzuzeichnen und einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle einzugeben.Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die MS/MS-Erfassung zu starten. Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS/MS-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Identifizieren Sie das stärkste Fragmention im Spektrum und geben Sie seinen m/z-Wert in die MSn-Methodenliste ein.Legen Sie in der MSn-Einstellungstabelle die MS3-Parameter fest, einschließlich Kollisionsmodus, CE-Wert und Scanbereich. Klicken Sie erneut auf Speichern, um die MS-Methode aufzuzeichnen und einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle einzugeben. Klicken Sie auf Start, um die MS3-Erfassung zu starten.Wie bereits gezeigt, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS3-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden, und wiederholen Sie die Schritte, um das MS4-Spektrum zu erhalten. Um die Daten zu analysieren, doppelklicken Sie auf die Rohdateien, um alle Massenspektren von MS bis MSn zu öffnen. Berechnen Sie manuell die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion und den entsprechenden Fragmentionen.Zeichnen Sie dann manuell die Kernstruktur gemäß den MS4-Ergebnissen und leiten Sie die ursprüngliche Struktur mithilfe von funktionellen Gruppen oder Molekülsegmenten basierend auf dem m/z-Differenzwert ab. Zeichnen Sie die molekularen Spaltungspfade entsprechend jeder Molekülstruktur in MSn manuell. Die ESI-MS der Modell-Kohlenhydrat-Cellobiose produzierte das proteinatisierte Molekül M H bei m/z 365 im positiven Modus.Der Produktionenscan oder CID MS/MS ergab ein zweites Fragmention bei m/z 305. Darüber hinaus ergab die MS3- und MS4-Analyse nacheinander das dritte und vierte Fragmention bei m/z 254 bzw. m/z 185. Die MS/MS-Analyse zeigte die Abfolge der Ionenfragmentierungen, nämlich Ringöffnungshydrolyse, CC-Spaltung und Dehydratisierung.Diese Methode wurde also für Kohlenhydrate als geeignet befunden. Die vorläufige qualitative Analyse von AMS mittels LC Q-TOF MS ergab das Vorhandensein zahlreicher unbekannter Verbindungen. Die negative MSn-Analyse des M-H-Ions bei m/z 617 ergab ein zweites Fragmention bei m/z 571.Die MS3-Analyse dieses Fragmentions ergab ein drittes Fragmention bei m/z 525 durch den Verlust von Hydroxyethyl als Methanol entsprechend 32 Dalton und Hydroxyl als Wasser, was 18 Dalton entspricht. Die MS4-Analyse ergab vierte Fragmentionen bei m/z 344 und 273. Die manuelle Identifizierung der Kernstruktur ergab die molekulare Struktur der Verbindung bei m/z 617 und ihre Spaltwege in MSn.Der Produktionenscan des M H-Ions einer anderen unbekannten Verbindung wurde durchgeführt, und seine molekulare Struktur und sein Spaltmechanismus wurden ebenfalls aufgedeckt. Warten Sie nach dem Einschalten der Vakuumpumpe mindestens fünf Stunden, um einen ausreichenden Vakuumgrad für die Versuchsbedingungen sicherzustellen. Die statistische Analyse kann verwendet werden, um die Fragmente mit dem gleichen oder einem ähnlichen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis zusammenzustellen.Mit der zunehmenden Verbreitung von Massenspektrometrielösungen könnte diese Technik Forschern helfen, neuere Verbindungen in Naturheilmitteln zu gewinnen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Forschung

Chemie

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

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Charakterisierung, Quantifizierung und substanzspezifische Isotopenanalyse von Pyrogene Kohle Benzolpolycarbonsäuren (BPCA)

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We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Bildkorrosion an der Metal-Paint-Schnittstelle mit zeitweiliger Ionenmassenspektrometrie

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie-Techniken zur Bestimmung der Struktur und Mechanismen der Metallionenerkennung und Redox-Aktivität von Metallbindungsoligopeptiden