Name: standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis
Uploaded: 2023-03-17T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי תוכנית הכישרונות Xinglin של אוניברסיטת צ'נגדו של TCM (מס '030058191), קרן מדעי הטבע של סצ'ואן (2022NSFSC1470), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204765).

1. הכנת מדגם
<ol><li>במדויק לשקול 1 גרם של מדגם AMS, ומניחים אותו בקבוק חרוטי עם 30 מ"ל של 80% מתנול. מעבירים את התערובת לסוניק אמבט אולטרסאונד למשך 30 דקות מיצוי ב-25°C. צנטריפוגה את הדגימה ב 14,000 x גרם במשך 5 דקות. הערה: התדר של סוניק אמבטיה אולטרסאונד הוא 40 KHz.</li>
	<li>הכינו מזרק הזרקה ומסנן...

<ol>
	<li>Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+with+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry+for+qualitative+analysis+of+herbal+medicines.">Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematically+investigating+the+pharmacological+mechanism+of+Dazhu+Hongjingtian+in+the+prevention+and+treatment+of+acute+mountain+sickness+by+integrating+UPLC/Q-TOF-MS/MS+analysis+and+network+pharmacology.">Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).</li><li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+using+accurate+mass+MS/MS+search.">Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search.</a> Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-faceted+mass+spectrometric+investigation+of+neuropeptides+in+Callinectes+sapidus.">Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).</li><li>Seetaloo, N., Phillips, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+hydrogen/deuterium-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+alpha-synuclein+structural+dynamics+under+physiological+conditions.">Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).</li><li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+uptake+of+platinum-and+ruthenium-based+compound+exposure+in+zebrafish+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+with+broader+applications.">Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).</li><li>Chang, H. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uracil-DNA+glycosylase+assay+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+analysis.">Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+and+identification+of+major+constituents+in+Jitai+tablets+by+high-performance+liquid+chromatography/diode-array+detection+coupled+with+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).</li><li>Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+and+features+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+the+analysis+of+traditional+Chinese+medicine.">The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).</li><li>Ichou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+activation+time+effects+and+the+internal+energy+distributions+for+the+CID,+PQD+and+HCD+excitation+modes.">Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+oligomer+formation+in+glucose+dehydration+by+CO2+and+tetrahydrofuran.">Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran.</a> Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+effects+on+degradative+condensation+side+reactions+of+fructose+in+its+initial+conversion+to+5-Hydroxymethylfurfural.">Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural.</a> ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).</li><li>Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+research+of+Tibetan+medicine.">Modern research of Tibetan medicine.</a> World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).</li><li>Shang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethno-veterinary+survey+of+medicinal+plants+in+Ruoergai+region,+Sichuan+province,+China.">Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China.</a> Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).</li><li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalcone+derivatives+from+Abelmoschus+manihot+seeds+restrain+NLRP3+inflammasome+assembly+by+inhibiting+ASC+oligomerization.">Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+the+reaction+network+of+humin+formation+at+the+initial+stage+of+fructose+dehydration+in+water.">Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water.</a> Green Energy &amp; Environment. , (2022).</li><li>Hua, Y., Jenke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+sensitivity+of+an+LC-MS+method+for+screening+material+extracts+for+organic+extractables+via+mobile+phase+optimization.">Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization.</a> Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).</li><li>Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+characterization+and+distribution+of+monoterpene+indole+alkaloids+in+Rauwolfia+species+by+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer.">Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).</li><li>Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+Ion+activation+in+tandem+mass+spectrometry+using+ultra-high+resolution+instrumentation.">Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).</li><li>Wu, S. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+determination+of+disulfide+linkages+in+recombinant+therapeutic+proteins+using+online+LC&#8722;MS+with+electron-transfer+dissociation.">Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC&#8722;MS with electron-transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).</li><li>Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+as+a+potential+tool+to+assign+disulfide+bonds+arrangements+in+peptides+with+multiple+disulfide+bridges.">Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges.</a> Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).</li></ol>

IT-MS וטכנולוגיית MSn שלה מציעות גישה חדשה לזיהוי המבנה של תרכובות TCM עקבות. בניגוד ל-Q-TOF-MS, שלא הצליח לזהות לעומק את יוני הפרגמנט, IT-MS עם טכנולוגיית MSn מצטיין ביכולתו לבודד ולצבור יונים. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי תרכובות קורט ברפואה הטיבטית באמצעות טכניקת IT-MS ו-MSn . השיטה משתמשת ב...

הניתוח האיכותני של יסודות קורט ברפואה הסינית המסורתית (TCM) הפך לנושא מכריע במחקר. בשל המספר הגבוה של תרכובות ב- TCM, קשה לבודד אותן לניתוח ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או דיפרקטומטר קרני רנטגן (XRD), מה שהופך שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS) הדורשות רק נפחי דגימה נמוכים לפופולריות יותר ויותר. בנוסף, כרומטוגרפיה נוזלית (LC) בשילוב עם טרשת נפוצה נמצאת בשימוש נרחב במחקר TCM בשנים האחרונות לשיפור ההפרדה של דגימות מורכבות וניתוח איכותי של תרכובות כימיות1. שיטה נפוצה אחת היא כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS), אשר נמצאת בשימוש נרחב במחקר איכותני על רפואה טיבטית2. בשיטה זו, רכיבים מורכבים מועשרים ומופרדים בטור LC, ויחס המסה למטען (m/z) של יוני האדוקט נצפה באמצעות גלאי MS. חיפוש במסדי נתונים טנדם MS (MS/MS או MS2) הוא כיום הגישה המהירה ביותר עבור ביאורים מורכבים בטוחים בניתוח מולקולות קטנות באמצעות זמן טיסה מרובע (Q-TOF) MS ו- Orbitrap MS3. עם זאת, האיכות הירודה של מסדי נתונים ונוכחותם של איזומרים שונים מעכבים זיהוי של תרכובות לא ידועות. בנוסף, המידע המסופק על ידי מסד הנתונים MS/MS מוגבל 4,5,6,7. חשוב לחקור את התרכובות הכימיות בכל TCM באמצעות פרוטוקול כללי שניתן ליישם באופן נרחב על TCM אחרים.
IT-MS לוכד מגוון רחב של יונים על ידי הפעלת מתחי תדר רדיו (RF) שונים על אלקטרודות טבעת8. IT-MS יכול לבצע סריקות MS מרובות שלבים מסדרות זמן בסדר כרונולוגי מגוון, ולספק פיצול מרובה שלבים של MS (MS n), כאשרn הוא מספר שלבי יוני המוצר9. IT-MS ליניארי נחשב הטוב ביותר לזיהוי מבנה מכיוון שניתן להשתמש בו לניסויים רציפיםשל MS n 10. ניתן לבודד יונים ממוקדים ולהצטבר ב-IT-MS1 ליניארי. MS n (n ≥ 3) ב- IT-MS מספק יותר מידע מקטע מאשר MS/MS ב- Q-TOF-MS. מכיוון ש- IT-MS אינו יכול לנעול את יון המטרה ואת יוני השבר שלו, זהו כלי רב עוצמה להבהרת מבנה של תרכובות לא ידועות, כולל איזומרים1. טכנולוגייתMS n יושמה באופן נרחב בניתוח מבני של חלבונים, פפטידים ורב-סוכרים לא ידועים11,12. רמת השפע של יוני פרגמנט ב-MSn מספקת יותר מידע על פרגמנטים מולקולריים על תרכובות ממוקדות בדגימות מורכבות מאשר MS/MS ב-Q-TOF-MS. לפיכך, יישום טכנולוגיית MSn לזיהוי מבני ב- TCM הוא חיוני.
הרפואה הטיבטית היא מרכיב משמעותי של TCM13, ותרופות אלה מופקות בעיקר מבעלי חיים, צמחים ומינרלים הנמצאים באזור הרמה14. התרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds (AMS) היא זרע של Abelmoschus manihot (פשתן) רפואי. AMS היא צמחי מרפא מסורתיים המשמשים לטיפול במצבים כגון אטופיק דרמטיטיס, שיגרון וצרעת. הוא מכיל כלקון, בעל השפעות אנטיבקטריאליות, אנטי פטרייתיות, אנטי סרטניות, נוגדות חמצון ואנטי דלקתיות15. במחקר הנוכחי שופרו הליכי MS n, ופותחה שיטה מפורטת לזיהוי מבנים מורכבים ברפואה הטיבטית AMS באמצעות IT-MSו-MS n. פרמטרים מסוימים של MS, כולל מצב היונים, טווח הסריקה ומצב ההתנגשות, עברו אופטימיזציה כדי להתגבר על בעיות בזיהוי תרכובות עקבות. מחקר זה נועד לקדם את זיהוי המבנה הסטנדרטי של תרכובות קורט ב- TCM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 75-05-8</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Knowles</td>
			<td>CAS 64-18-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Tune</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.8.0</td>
			<td>MS control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 67-56-1</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 7732-18-5</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.0</td>
			<td>LC-IT-MS operational software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis

תרופות טיבטיות הן מורכבות ומכילות תרכובות לא ידועות רבות, מה שהופך מחקר מעמיק על המבנים המולקולריים שלהן לחיוני. כרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרוספריי יינון זמן טיסה ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-TOF-MS) משמשת בדרך כלל לחילוץ רפואה טיבטית; עם זאת, תרכובות בלתי ידועות בלתי צפויות רבות נשארות לאחר השימוש במסד הנתונים ספקטרום. המאמר הנוכחי פיתח שיטה אוניברסלית לזיהוי רכיבים ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים (IT-MS). השיטה כוללת פרוטוקולים סטנדרטיים ומתוכנתים להכנת דגימה, הגדרת MS, ריצת LC, הקמת שיטה, רכישת MS, הפעלת MS מרובת שלבים וניתוח נתונים ידני. שתי תרכובות מייצגות בתרופה הטיבטית Abelmoschus manihot seeds זוהו באמצעות פיצול רב-שלבי, עם ניתוח מפורט של מבנים מורכבים טיפוסיים. בנוסף, המאמר דן בהיבטים כגון בחירת מצב יונים, התאמת פאזה ניידת, אופטימיזציה של טווח הסריקה, בקרת אנרגיית התנגשות, החלפת מצב התנגשות, גורמי פיצול ומגבלות השיטה. שיטת הניתוח הסטנדרטית שפותחה היא אוניברסלית וניתן ליישם אותה על תרכובות לא ידועות ברפואה הטיבטית.

Cellobiose שימש כמודל כדי לאמת את ההיתכנות של MSn במצב יונים חיוביים. כפי שניתן לראות באיור 2A, ESI-MS (מצב יונים חיוביים) של צלוליוז [C 12 H22O11]+ ייצר את המולקולה הפרוטונית [M+H]+ ב-m/z 365. סריקת יוני המוצר (CID-MS/MS) של [M+H]+ ב-m/z 365 הביאה ליון המקטע השני ב-m/z 30...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis at JoVE.com

Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי ועיצוב שניתן ליישם כדי לזהות כמויות זעירות ומרכיבים קטנים בפורמולציות המוצר הטבעי המורכב (מטריצות) ברפואה הטיבטית.

זיהוי סטנדרטי של מבנה מורכב ברפואה הטיבטית באמצעות ספקטרומטריית מסה של מלכודת יונים וניתוח פיצול רב-שלבי

Tibetan medicines are complex and contain numerous unknown compounds, making in-depth research on their molecular structures crucial. Liquid ...

שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לנתח את המבנים של תרכובות הרפואה הטיבטית, במיוחד את מרכיבי העץ. זה יכול לספק תובנה למחקר איכותני של תוכן התרכובת ברפואה הטבעית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הדיוק של המבנה המורכב המתקבל במקרה זה גבוה מזה של מסד הנתונים.טכניקה זו יכולה לשמש בניתוח המבנה של מתווכים מטבוליים בשלפוחית השתן או בשתן. כדי להתחיל, התרופה הטיבטית Abelmoschus manihot של זרעים הדגימה הכנה. שקלו במדויק גרם אחד של AMS והניחו אותו בבקבוק חרוטי המכיל 30 מיליליטר של 80% מתנול.באמצעות סולקטור אמבטיה אולטרסאונד ב 40 קילוהרץ, לבצע מיצוי על התערובת במשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 14, 000g במשך חמש דקות. מכינים מזרק הזרקה ומסנן קרום מיקרו-נקבובי אורגני של 0.22 מיקרון, ומסננים את הסופרנאטנט לבקבוק דגימה של שני מיליליטר.לאחר הפעלת המתג של משאבת הוואקום, פתח את השסתום הראשי של גליל הארגון יחד עם שסתום הלחץ החלקי והתאם את הלחץ לכ -0.3 מגה-פסקל. לאחר מכן, פתח את שסתום החנקן. הפעל את ספקטרומטריית המסות, או MS, תוכנת בקרה.לחץ על מקור ESI מחומם בלוח התוכנה והגדר את הפרמטרים של MS, כולל טמפרטורת המחמם, קצבי זרימת גז, מתח ריסוס למצבים חיוביים ושליליים וטמפרטורת נימים. לחץ על כפתור החל כדי להפעיל את מקור היונים לכרומטוגרפיה נוזלית או LC.Prepare Mobile phases A ו- B באמצעות 0.1% חומצה פורמית בתמיסה מימית באצטוניטריל טהור בהתאמה. דגה אותם בסולקטור אמבט אולטרסאונד ב 40 קילוהרץ למשך 15 דקות לפחות לפני חיבור התמיסות למעברי נוזל A ו- B בהתאמה.הכינו תמיסת מתנול מים ביחס של 1:9 לפי נפח, ולאחר מכן מלאו אותה ידנית בבקבוקי הנוזלים הנקיים של המשאבה והמזרק. לאחר הפעלת תוכנת הבקרה LC-MS, לחץ על Direct Control כדי לפתוח את לוח הבקרה של LC. פתח את שסתום הטיהור נגד כיוון השעון במודול המשאבה.לחץ על אפשרות נוספת כדי לפתוח את הגדרת המשאבה ולהגדיר את פרמטרי הטיהור על חמישה מיליליטר לדקה למשך שלוש דקות. לחץ על טיהור כדי להתחיל בהסרת הבועה. לאחר שתסיים, סגור את שסתום הטיהור.לאחר מכן, לחץ על מזרק Prime כדי לשטוף את המזרק במשך שלושה מחזורים, Wash Buffer Loop כדי לשטוף את הלולאה במשך מחזור אחד, ועל Wash Needle Externally כדי לשטוף את המחט במשך מחזור אחד. הניחו את בקבוק הדגימה בדוגם. לחץ על Instrument Setup כדי לפתוח את Method Editing Window ולחץ על New כדי ליצור שיטת מכשיר LC-MS חדשה.קבע זמן ריצה כולל עבור השיטה והגדר את מגבלת הלחץ. קצב זרימה כולל, שיפוע זרימה, טמפרטורת דגימה, טמפרטורת עמודה ודלתא של טמפרטורה מוכנה בחלון עריכת שיטות. עבור שיטת MS, בחר את סוג הניסוי MS כללי או MSN.הזן ערכים של זמן הרכישה, קוטביות, טווח מסה, מספר ערך הסטה ומשך. לחץ על שמור כדי להגדיר את ההגדרות כשיטת מכשיר. לחץ על הגדרת רצף כדי לפתוח את טבלת הרצפים, שבה הזן את המידע על סוג הדגימה, קובץ, שם, נתיב, מזהה דגימה, שיטת מכשיר, מיקום ונפח הזרקה.הקלט את טבלת הרצף על ידי לחיצה על שמור, ולאחר מכן יישם את ההגדרות והתחל את רכישת MS. כדי לטעון את נתוני MS לתוכנת עיבוד הנתונים, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer. בכרומטוגרמה של שיא הבסיס BPI, בחר את האזור המרבי מתחת לעקומה או AUC על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר.ספקטרום MS המתאים יוצג באותו חלון. בחר יון יעד לניתוח MS/MS הבא. פתח מחדש את החלון עריכת שיטות, ובטבלת ההגדרות MSn, הגדר את m/z של יון היעד למקום עשרוני אחד בעמודה מסת אב.לאחר מכן, בחר מצב התנגשות והזן את אנרגיית ההתנגשות, או ערך CE. הגדר את טווח הסריקה של MS/MS. לחץ על שמור כדי להקליט את שיטת MS ולהזין שם קובץ חדש בטבלת הרצף.לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את רכישת MS/MS. לאחר השלמת הרכישה, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי ב- Explorer כדי לטעון את הקובץ הגולמי MS/MS לתוכנת עיבוד הנתונים. זהה את יון המקטע החזק ביותר בספקטרום והזן את ערך m/z שלו ברשימת שיטות MSn.בטבלת ההגדרות של MSn, הגדר את פרמטרי MS3, כולל מצב התנגשות, ערך CE וטווח סריקה. שוב, לחץ להציל כדי להקליט את שיטת MS ולהזין שם קובץ חדש בטבלת הרצף. לחץ על התחל כדי להתחיל את רכישת MS3.כפי שהודגם בעבר, לחץ פעמיים על הקובץ הגולמי בסייר כדי לטעון את קובץ MS3 raw לתוכנת עיבוד הנתונים, וחזור על השלבים כדי להשיג את ספקטרום MS4. כדי לנתח את הנתונים, לחץ פעמיים על הקבצים הגולמיים כדי לפתוח את כל ספקטרום המסה מ- MS ל- MSn. חשב ידנית את ערכי ההפרש m/z בין יוני היון לבין יוני המקטע המתאימים.לאחר מכן, צייר ידנית את מבנה הליבה בהתאם לתוצאות MS4 וגזור את המבנה המקורי באמצעות קבוצות פונקציונליות או מקטעים מולקולריים בהתבסס על ערך ההפרש m/z. צייר ידנית את נתיבי המחשוף המולקולרי בהתאם לכל מבנה מולקולרי ב- MSn. ה- ESI-MS של מודל הצלוליוז של פחמימות ייצר את המולקולה החלבונית M H ב- m/z 365 במצב חיובי.סריקת יוני המוצר, או CID MS/MS הביאה ליון שבר שני ב- m/z 305. יתר על כן, ניתוח MS3 ו- MS4 הביא ברצף את יוני השבר השלישי והרביעי ב- m/z 254 ו- m/z 185, בהתאמה. ניתוח MS/MS חשף את רצף פיצולי היונים, כלומר הידרוליזה של פתיחת טבעת, מחשוף CC והתייבשות.לכן, שיטה זו נמצאה מתאימה לפחמימות. הניתוח האיכותני הראשוני של AMS באמצעות LC Q-TOF MS חשף את נוכחותן של תרכובות לא ידועות רבות. ניתוח MSN שלילי של יון M H ב- m/z 617 הפיק יון שבר שני ב- m/z 571.ניתוח MS3 של יון שבר זה יצר יון שבר שלישי ב- m/z 525 על ידי אובדן הידרוקסיאתיל כמתנול המתאים ל- 32 דלתון והידרוקסיל כמים, שהוא 18 דלטון. ניתוח MS4 הפיק יוני פרגמנט רביעי ב-m/z 344 ו-273. זיהוי ידני של מבנה הליבה חשף את המבנה המולקולרי של התרכובת ב-m/z 617 ואת נתיבי המחשוף שלה ב-MSn.בוצעה סריקת יוני תוצר של יון M H של תרכובת לא ידועה אחרת, וכן נחשפו המבנה המולקולרי ומנגנון המחשוף שלו. לאחר הפעלת משאבת הוואקום, המתינו לפחות חמש שעות כדי להבטיח מידת ואקום מספקת לתנאי הניסוי. ניתוח סטטיסטי יכול לשמש כדי לאסוף את השברים בעלי יחס מסה למטען זהה או דומה.עם הגדלת פתרון ספקטרומטריית המסות, טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים להשיג תרכובות חדשות יותר בתרופות טבעיות.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

ניתוח של תרכובות נדיפות רגישות וחמצון באמצעות מערכת קרה מפרצון ואלקטרוני השפעה המוני ספקטרומטריית

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

אפיון, כימות מתחם ספציפי ניתוח איזוטופי של Pyrogenic פחמן שימוש בנזן Polycarboxylic חומצות (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

סינתזה וניתוח ספקטרומטר מסה של Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

הדמיה קורוזיה בממשק צבע מתכת באמצעות המסה של זמן טיסה משני המוני ספקטרומטריה

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides