Name: standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis
Uploaded: 2023-03-17T14:10:00
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Este trabalho foi financiado pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (No. 030058191), pela Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) e pela National Natural Science Foundation of China (82204765).

1. Preparação da amostra
<ol><li>Pesar com precisão 1 g da amostra de AMS e colocá-la num balão cónico com 30 ml de metanol a 80%. Transfira a mistura para um sonicador de banho de ultrassom por 30 min de extração a 25 °C. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 5 min. NOTA: A frequência do sonicador de banho de ultrassom é de 40 KHz.</li>
	<li>Prepare uma seringa de injeção e um filtro de membrana microporosa (0,22 μm, apenas orgânico). Filtrar o sobrenadante num frasco de a...

<ol>
	<li>Chen, X. -. F., Wu, H. -. T., Tan, G. -. G., Zhu, Z. -. Y., Chai, Y. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+with+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry+for+qualitative+analysis+of+herbal+medicines.">Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).</li><li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematically+investigating+the+pharmacological+mechanism+of+Dazhu+Hongjingtian+in+the+prevention+and+treatment+of+acute+mountain+sickness+by+integrating+UPLC/Q-TOF-MS/MS+analysis+and+network+pharmacology.">Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028 (2020).</li><li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+using+accurate+mass+MS/MS+search.">Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search.</a> Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).</li><li>Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-faceted+mass+spectrometric+investigation+of+neuropeptides+in+Callinectes+sapidus.">Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63322 (2022).</li><li>Seetaloo, N., Phillips, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+hydrogen/deuterium-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+alpha-synuclein+structural+dynamics+under+physiological+conditions.">Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64050 (2022).</li><li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+uptake+of+platinum-and+ruthenium-based+compound+exposure+in+zebrafish+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+with+broader+applications.">Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e6358 (2022).</li><li>Chang, H. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uracil-DNA+glycosylase+assay+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+analysis.">Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63089 (2022).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+and+identification+of+major+constituents+in+Jitai+tablets+by+high-performance+liquid+chromatography/diode-array+detection+coupled+with+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).</li><li>Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+and+features+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+the+analysis+of+traditional+Chinese+medicine.">The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270 (2016).</li><li>Ichou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+activation+time+effects+and+the+internal+energy+distributions+for+the+CID,+PQD+and+HCD+excitation+modes.">Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+oligomer+formation+in+glucose+dehydration+by+CO2+and+tetrahydrofuran.">Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran.</a> Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+effects+on+degradative+condensation+side+reactions+of+fructose+in+its+initial+conversion+to+5-Hydroxymethylfurfural.">Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural.</a> ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).</li><li>Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+research+of+Tibetan+medicine.">Modern research of Tibetan medicine.</a> World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).</li><li>Shang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethno-veterinary+survey+of+medicinal+plants+in+Ruoergai+region,+Sichuan+province,+China.">Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China.</a> Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), 390-400 (2012).</li><li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalcone+derivatives+from+Abelmoschus+manihot+seeds+restrain+NLRP3+inflammasome+assembly+by+inhibiting+ASC+oligomerization.">Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 932198 (2022).</li><li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+out+the+reaction+network+of+humin+formation+at+the+initial+stage+of+fructose+dehydration+in+water.">Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water.</a> Green Energy &amp; Environment. , (2022).</li><li>Hua, Y., Jenke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+sensitivity+of+an+LC-MS+method+for+screening+material+extracts+for+organic+extractables+via+mobile+phase+optimization.">Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization.</a> Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).</li><li>Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+characterization+and+distribution+of+monoterpene+indole+alkaloids+in+Rauwolfia+species+by+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer.">Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).</li><li>Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+Ion+activation+in+tandem+mass+spectrometry+using+ultra-high+resolution+instrumentation.">Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).</li><li>Wu, S. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+determination+of+disulfide+linkages+in+recombinant+therapeutic+proteins+using+online+LC&#8722;MS+with+electron-transfer+dissociation.">Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC&#8722;MS with electron-transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).</li><li>Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+as+a+potential+tool+to+assign+disulfide+bonds+arrangements+in+peptides+with+multiple+disulfide+bridges.">Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges.</a> Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).</li></ol>

IT-MS e sua tecnologia MSn oferecem uma nova abordagem para identificar a estrutura de compostos TCM traço. Ao contrário do Q-TOF-MS, que não conseguiu identificar profundamente os íons fragmentados, o IT-MS com tecnologia MSn se destaca devido à sua capacidade de isolar e acumular íons. Este artigo descreve um método para identificar compostos traço na medicina tibetana usando a técnica IT-MS e MSn . O método utiliza o valor de n em MSn para determinar a quantidade d...

A análise qualitativa de componentes traço na medicina tradicional chinesa (MTC) tornou-se um tópico crucial na pesquisa. Devido ao alto número de compostos na MTC, é difícil isolá-los para análise de espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN) ou difratômetro de raios X (DRX), tornando cada vez mais populares métodos baseados em espectrometria de massa (MS) que requerem apenas baixos volumes de amostras. Adicionalmente, a cromatografia líquida (CL) acoplada à EM tem sido amplamente utilizada na pesquisa em MTC nos últimos anos para a melhor separação de amostras complexas e análise qualitativa de compostosquímicos1. Um método comum é a cromatografia líquida-espectrometria de massas por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS), que é amplamente utilizada em pesquisas qualitativas em medicina tibetana2. Com este método, componentes complexos são enriquecidos e separados em uma coluna LC, e a relação massa-carga (m/z) dos íons adutos é observada usando um detector MS. A busca em bancos de dados tandem MS (MS/MS ou MS2) é atualmente a abordagem mais rápida para anotações de compostos confiáveis em análises de pequenas moléculas usando o tempo de voo quadrupolo (Q-TOF) MS e o Orbitrap MS3. No entanto, a baixa qualidade dos bancos de dados e a presença de vários isômeros dificultam a identificação de compostos desconhecidos. Além disso, as informações fornecidas pelo banco de dados do MS/MS são limitadas 4,5,6,7. É significativo investigar os compostos químicos em cada MTC usando um protocolo geral que pode ser amplamente aplicado a outros MTC.
O IT-MS captura uma ampla gama de íons aplicando diferentes tensões de radiofrequência (RF) aos eletrodos do anel8. O IT-MS pode realizar varreduras de MS de vários estágios de séries temporais em diversas ordens cronológicas, fornecendo fragmentação de MS de múltiplos estágios (MS n) de ingredientes, onden é o número de estágios de íons do produto9. O IT-MS linear é considerado o melhor para identificação de estruturas, pois pode ser utilizado para experimentos sequenciais de MSn 10. Íons alvo podem ser isolados e acumulados em IT-MSlinear 1. O MS n (n ≥ 3) em IT-MS fornece mais informações fragmentadas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Uma vez que IT-MS não pode bloquear o íon alvo e seus íons fragmentos, é uma ferramenta poderosa para a elucidação da estrutura de compostos desconhecidos, incluindo isômeros1. A tecnologia MSn tem sido amplamente aplicada na análise estrutural de proteínas, peptídeos e polissacarídeos desconhecidos11,12. O nível de abundância de íons fragmentos em MSn fornece mais informações de fragmentos moleculares sobre compostos alvo em amostras complexas do que MS/MS em Q-TOF-MS. Assim, a aplicação da tecnologia MSn na identificação estrutural na MTC é essencial.
A medicina tibetana é um componente significativo da MTC13, e esses medicamentos são principalmente derivados de animais, plantas e minerais encontrados na área do planalto14. O medicamento tibetano Abelmoschus manihot seeds (AMS) é a semente de Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS é um fitoterápico tradicional usado para tratar condições como dermatite atópica, reumatismo e hanseníase. Contém chalcona, que possui efeitos antibacterianos, antifúngicos, anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios15. No presente estudo, os procedimentos de MS n foram aprimorados, e um método detalhado foi desenvolvido para identificar estruturas compostas na medicina tibetana AMS usando IT-MS e MSn. Certos parâmetros do MS, incluindo o modo de íons, o alcance de varredura e o modo de colisão, foram otimizados para superar problemas na identificação de compostos traços. Este estudo tem como objetivo promover a identificação padronizada da estrutura de compostos traço na MTC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 75-05-8</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Knowles</td>
			<td>CAS 64-18-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>U3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ Tune</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.8.0</td>
			<td>MS control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 67-56-1</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CAS 7732-18-5</td>
			<td>LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>version 2.0</td>
			<td>LC-IT-MS operational software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis

Os medicamentos tibetanos são complexos e contêm numerosos compostos desconhecidos, tornando crucial a pesquisa aprofundada sobre suas estruturas moleculares. Cromatografia líquida-espectrometria de massa por tempo de voo por ionização por eletrospray (LC-ESI-TOF-MS) é comumente usada para extrair medicamentos tibetanos; No entanto, muitos compostos desconhecidos imprevisíveis permanecem após o uso do banco de dados Spectrum. O presente artigo desenvolveu um método universal para identificação de componentes na medicina tibetana usando espectrometria de massas com armadilha iônica (IT-MS). O método inclui protocolos padronizados e programados para preparação de amostras, configuração de EM, pré-execução de LC, estabelecimento de métodos, aquisição de EM, operação de EM em múltiplos estágios e análise manual de dados. Dois compostos representativos na medicina tibetana Abelmoschus manihot sementes foram identificados usando fragmentação de múltiplos estágios, com uma análise detalhada de estruturas compostas típicas. Além disso, o artigo discute aspectos como seleção do modo de íon, ajuste de fase móvel, otimização da faixa de varredura, controle de energia de colisão, comutação do modo de colisão, fatores de fragmentação e limitações do método. O método de análise padronizado desenvolvido é universal e pode ser aplicado a compostos desconhecidos na medicina tibetana.

A celobiose foi utilizada como modelo para verificar a viabilidade don MS no modo iônico positivo. Como mostrado na Figura 2A, o ESI-MS (modo iônico positivo) da celobiose [C 12 H22O11]+ produziu a molécula protonada [M+H]+ em m/z 365. A varredura de íons do produto (CID-MS/MS) de [M+H]+ em m/z 365 resultou no segundo íon fragmento em m/z 305 (Figura 2B), que foi posteriormente analisado usando as análises MS<...

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Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

Aqui, descrevemos um protocolo geral e um projeto que podem ser aplicados para identificar quantidades residuais e constituintes menores nas formulações complexas de produtos naturais (matrizes) na medicina tibetana.

Identificação Padronizada da Estrutura Composta na Medicina Tibetana Usando Espectrometria de Massa com Armadilha de Íons e Análise de Fragmentação em Múltiplos Estágios

Tibetan medicines are complex and contain numerous unknown compounds, making in-depth research on their molecular structures crucial. Liquid ...

Este método pode ajudar os pesquisadores a analisar as estruturas dos compostos da medicina tibetana, especialmente os componentes da árvore. Ele pode fornecer informações sobre o estudo qualitativo do conteúdo do composto na medicina natural. A principal vantagem desta técnica é que a precisão da estrutura composta obtida neste caso é superior à do banco de dados.Esta técnica pode ser utilizada na análise da estrutura de intermediários metabólicos na bexiga ou urina. Para começar, a medicina tibetana Abelmoschus manihot preparação de amostras de sementes. Pesar com precisão um grama de AMS e colocá-lo num balão cónico contendo 30 mililitros de metanol a 80%.Usando um sonicador de banho de ultrassom a 40 kilohertz, execute a extração na mistura por 30 minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, centrifugar a amostra a 14.000g por cinco minutos. Prepare uma seringa de injeção e um filtro de membrana microporosa orgânico de 0,22 mícron e filtre o sobrenadante em um frasco de amostra de dois mililitros.Depois de ligar o interruptor da bomba de vácuo, abra a válvula principal do cilindro de argônio junto com a válvula de pressão parcial e ajuste a pressão para aproximadamente 0,3 megapascals. Em seguida, abra a válvula de nitrogênio. Inicie o software de controle de espectrometria de massa, ou MS.Clique em Fonte ESI aquecida no painel do software e defina os parâmetros do MS, incluindo temperatura do aquecedor, taxas de fluxo de gás, tensão de pulverização para os modos positivo e negativo e temperatura capilar. Clique no botão Aplicar para ativar a fonte de íons para cromatografia líquida ou LC.Prepare as fases móveis A e B usando ácido fórmico a 0,1% em uma solução aquosa em acetonitrila pura, respectivamente. Desgaseifique-os em um sonicador de banho de ultrassom a 40 kilohertz por pelo menos 15 minutos antes de conectar as soluções às passagens de fluido A e B, respectivamente.Prepare uma solução de água de metanol volume a volume 1:9 e, em seguida, encha-a manualmente nas garrafas de fluido de limpeza da bomba e do injetor. Depois de iniciar o software de controle LC-MS, clique em Controle Direto para abrir o painel de controle LC. Abra a válvula de purga no sentido anti-horário no módulo da bomba.Clique em Mais opção para abrir a configuração da bomba e definir os parâmetros de purga em cinco mililitros por minuto durante três minutos. Clique em Purge para iniciar a remoção da bolha. Feito isso, feche a válvula de purga.Em seguida, clique em Seringa Prime para enxaguar a seringa por três ciclos, Wash Buffer Loop para enxaguar a alça por um ciclo e Wash Needle Externamente para lavar a agulha por um ciclo. Coloque o frasco de amostra no amostrador. Clique em Configuração do instrumento para abrir a janela de edição do método e clique em Novo para criar um novo método de instrumento LC-MS.Estabeleça um tempo de execução total para o método e defina o limite de pressão. Taxa de fluxo total, gradiente de fluxo, temperatura da amostra, temperatura da coluna e delta de temperatura pronta na janela Edição de método. Para o método MS, selecione o tipo de experimento MS ou MSn Geral.Insira valores do tempo de aquisição, polaridade, intervalo de massa, número do valor de desvio e duração. Clique em Salvar para definir as configurações como um método de instrumento. Clique em Configuração de sequência para abrir a tabela de sequência, na qual insira as informações sobre o tipo de amostra, arquivo, nome, caminho, ID da amostra, método do instrumento, posição e volume de injeção.Registre a tabela de sequência clicando em Salvar, implemente as configurações e inicie a aquisição do MS. Para carregar os dados do MS no software de processamento de dados, clique duas vezes no arquivo bruto no Explorer. No cromatograma de pico base BPI, selecione a área máxima sob a curva ou AUC clicando e arrastando o mouse.O espectro MS correspondente será exibido na mesma janela. Selecione um íon direcionado para a próxima análise do MS/MS. Reabra a janela Edição de Método e, na tabela de configuração MSn, defina o m/z do íon de destino com uma casa decimal na coluna Massa pai.Em seguida, selecione o modo de colisão e insira a energia de colisão ou o valor CE. Defina o intervalo de varredura do MS/MS. Clique em Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência.Clique no botão Iniciar para iniciar a aquisição do MS/MS. Quando a aquisição estiver concluída, clique duas vezes no arquivo raw no Explorer para carregar o arquivo raw do MS/MS no software de processamento de dados. Identifique o íon de fragmento mais forte no espectro e insira seu valor m/z na lista de métodos MSn.Na tabela de configuração MSn, defina os parâmetros MS3, incluindo modo de colisão, valor CE e intervalo de verificação. Novamente, clique em Salvar para registrar o método MS e insira um novo nome de arquivo na tabela de sequência. Clique em Iniciar para iniciar a aquisição MS3.Como demonstrado anteriormente, clique duas vezes no arquivo raw no Explorer para carregar o arquivo bruto MS3 no software de processamento de dados e repita as etapas para obter o espectro MS4. Para analisar os dados, clique duas vezes nos arquivos brutos para abrir todos os espectros de massa de MS para MSn. Calcule manualmente os valores de diferença m/z entre o íon e os íons de fragmento correspondentes.Em seguida, desenhe manualmente a estrutura central de acordo com os resultados do MS4 e derive a estrutura original usando grupos funcionais ou segmentos moleculares com base no valor da diferença m/z. Desenhar manualmente os caminhos de clivagem molecular de acordo com cada estrutura molecular no MSn. O ESI-MS da celobiose de carboidrato modelo produziu a molécula proteinada M H em m/z 365 no modo positivo.A varredura de íons do produto, ou CID MS/MS, resultou em um segundo íon fragmentado em m/z 305. Além disso, as análises MS3 e MS4 resultaram sequencialmente no terceiro e quarto fragmentos de íons em m/z 254 e m/z 185, respectivamente. A análise MS/MS revelou a sequência de fragmentações iônicas, ou seja, hidrólise da abertura do anel, clivagem de CC e desidratação.Assim, este método foi considerado adequado para carboidratos. A análise qualitativa preliminar de AMS usando LC Q-TOF MS revelou a presença de numerosos compostos desconhecidos. A análise negativa do íon M H em m/z 617 produziu um segundo íon fragmento em m/z 571.A análise MS3 deste íon fragmento produziu um terceiro íon fragmento em m/z 525 pela perda de hidroxietil como metanol correspondendo a 32 dalton e hidroxila como água, que é 18 dalton. A análise MS4 produziu íons quarto fragmento em m/z 344 e 273. A identificação manual da estrutura central revelou a estrutura molecular do composto em m/z 617 e seus caminhos de clivagem em MSn.A varredura iônica do produto do íon M H de outro composto desconhecido foi realizada, e sua estrutura molecular e mecanismo de clivagem também foram revelados. Depois que a bomba de vácuo for ligada, aguarde pelo menos cinco horas para garantir um grau de vácuo suficiente para as condições experimentais. A análise estatística pode ser usada para agrupar os fragmentos com a mesma ou semelhante relação massa-carga.Com a solução de espectrometria de massa aumentando, esta técnica poderia ajudar os pesquisadores a obter compostos mais novos em medicinas naturais.

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