Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المركز الوطني للعلوم ، بولندا ، رقم المنحة 2019/33 / B / NZ5 / 00647. نود أن نشكر البروفيسور توماس جوسيفسكي وأغنيسكا كراوتشيك من قسم علم الأحياء الدقيقة الطبية الجزيئية ، كلية الطب بجامعة جاجيلونيان على مساعدتهم التي لا تقدر بثمن في الكشف عن الحمض النووي البكتيري في المركبات الكهربائية.

1. إعداد أنابيب الطرد المركزي الفائقة
<ol><li>استخدم أنابيب معقمة تستخدم مرة واحدة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فأعد استخدام أنابيب الطرد المركزي الفائقة بعد غسلها بمنظف باستخدام ماصة باستور معقمة أو غيرها من أدوات التطبيق ذات الاستخدام الواحد. تذكر أن أنابيب الطرد المركزي الفائقة يجب أ?...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

في السنوات القليلة الماضية ، أصبحت طرق عزل المركبات الكهربائية المناسبة ذات أهمية متزايدة ، مما يتيح إجراء مزيد من التحليلات الموثوقة ، على سبيل المثال ، في سياق الحصول على بيانات أوميكس وبيانات وظيفية موثوقة24. بناء على الخبرة البحثية السابقة ، يبدو أنه ليس فقط نوع طريقة الع?...

الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، وفقا لتسمية MISEV 2018 ، هي مصطلح جماعي يصف أنواعا فرعية مختلفة من الحويصلات الغشائية التي تفرزها الخلايا والتي تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية 1,2. علاوة على ذلك ، تظهر المركبات الكهربائية واعدة كمؤشرات حيوية جديدة لمختلف الأمراض ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية ووسائل توصيل الأدوية. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتها الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات الفنية المتعلقة بالاستحواذ عليها3. أحد هذه التحديات هو عزل المركبات الكهربائية الخالية من السموم الداخلية ، والتي تم إهمالها في كثير من الحالات. واحدة من السموم الداخلية الأكثر شيوعا هي عديد السكاريد الدهني (LPS) ، وهو مكون رئيسي لجدران الخلايا البكتيرية سالبة الجرام ويمكن أن يسبب استجابة التهابية حادة ، بسبب إطلاق عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية بواسطة خلايا مختلفة 4,5. يحفز LPS استجابة عن طريق الارتباط ببروتين ربط LPS ، يليه التفاعل مع مركب CD14 / TLR4 / MD2 على الخلايا النخاعية. يؤدي هذا التفاعل إلى تنشيط مسارات الإشارات المعتمدة على MyD88 و TRIF ، والتي بدورها تؤدي إلى العامل النووي kappa B (NFkB). يؤدي نقل NFkB إلى النواة إلى بدء إنتاج السيتوكينات6. تعتبر الخلايا الوحيدة والبلاعم شديدة الحساسية ل LPS ، ويؤدي تعرضها ل LPS إلى إطلاق السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات (على سبيل المثال ، IL-6 و IL-12 و CXCL8 و TNF-α)7,8. يتيح هيكل CD14 ربط أنواع LPS المختلفة ذات التقارب المماثل ويعمل كمستقبل مشارك للمستقبلات الأخرى الشبيهة بالحصيلة (TLR1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 7 و 9) 6. لا يزال عدد الدراسات التي أجريت حول تأثيرات المركبات الكهربائية على الخلايا الوحيدة / الضامة يتزايد9،10،11. خاصة من منظور دراسة وظائف الخلايا الوحيدة ، ومجموعاتها الفرعية ، والخلايا المناعية الأخرى ، فإن وجود السموم الداخلية وحتى وجودها المقنع في المركبات الكهربائية له أهمية كبيرة12. قد يؤدي التلوث الذي يتم التغاضي عنه للمركبات الكهربائية بالسموم الداخلية إلى استنتاجات مضللة وإخفاء نشاطها البيولوجي الحقيقي. وبعبارة أخرى ، فإن العمل مع الخلايا الوحيدة يتطلب الثقة في غياب تلوث السموم الداخلية13. يمكن أن تكون المصادر المحتملة للسموم الداخلية هي الماء ، والوسائط والأمصال التي تم الحصول عليها تجاريا ، ومكونات الوسائط والمواد المضافة ، والأواني الزجاجية المختبرية ، والأواني البلاستيكية5،14،15.
لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول لعزل المركبات الكهربائية منخفضة السموم الداخلية. يوفر البروتوكول تلميحات بسيطة حول كيفية تجنب تلوث السموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية بدلا من إزالة السموم الداخلية من المركبات الكهربائية. في السابق ، تم تقديم العديد من البروتوكولات حول كيفية إزالة السموم الداخلية من ، على سبيل المثال ، الجسيمات النانوية المهندسة المستخدمة في الطب النانوي. ومع ذلك ، لا يوجد أي منها مفيد للهياكل البيولوجية مثل المركبات الكهربائية. يمكن إجراء إزالة الحرارة الفعالة للجسيمات النانوية عن طريق شطف الإيثانول أو حمض الخليك ، أو التسخين عند 175 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، أو تشعيع γ ، أو معالجة Triton X-100 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات تؤدي إلى تدمير المركبات الكهربائية16,17.
البروتوكول المقدم هو دراسة رائدة تركز على تجنب شوائب السموم الداخلية في المركبات الكهربائية ، على عكس الدراسات السابقة حول تأثير EVs على الخلايا الوحيدة9. قد يساعد تطبيق المبادئ المقترحة على الممارسة المختبرية في الحصول على نتائج بحثية موثوقة ، والتي يمكن أن تكون حاسمة عند النظر في الاستخدام المحتمل للمركبات الكهربائية كعوامل علاجية فيالعيادة 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي مجموعة غير متجانسة من الحويصلات الغشائية التي تطلقها الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي. إن وجودها في كل مكان ودورها الهام كحاملين للمعلومات البيولوجية يجعلها كائنات دراسة مثيرة للاهتمام ، وتتطلب بروتوكولات موثوقة ومتكررة لعزلها. ومع ذلك ، فإن تحقيق إمكاناتهم الكاملة أمر صعب حيث لا تزال هناك العديد من العقبات التقنية المتعلقة بأبحاثهم (مثل الاستحواذ المناسب). تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة (وفقا لتسمية MISEV 2018) من طاف الثقافة لخطوط الخلايا السرطانية على أساس الطرد المركزي التفاضلي. يتضمن البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالسموم الداخلية أثناء عزل المركبات الكهربائية وكيفية تقييمها بشكل صحيح. يمكن أن يؤدي تلوث السموم الداخلية للمركبات الكهربائية إلى إعاقة التجارب اللاحقة بشكل كبير أو حتى إخفاء آثارها البيولوجية الحقيقية. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التغاضي عن وجود السموم الداخلية إلى استنتاجات غير صحيحة. هذا له أهمية خاصة عند الإشارة إلى خلايا الجهاز المناعي ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، لأن الوحيدات تشكل مجموعة حساسة بشكل خاص لبقايا السموم الداخلية. لذلك ، يوصى بشدة بفحص EVs بحثا عن تلوث السموم الداخلية ، خاصة عند العمل مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية مثل الخلايا الوحيدة أو الضامة أو الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أو الخلايا المتغصنة.

الشرط الأساسي أو الخطوة الإلزامية لهذا البروتوكول هي استبعاد التلوث المحتمل للسموم الداخلية من الكواشف. يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة ، مثل FBS و DMEM و RPMI و PBS وحتى أنابيب الطرد المركزي الفائقة ، خالية من السموم الداخلية (<0.005 EU / mL). إن الحفاظ على نظام عدم التلوث بالذيفان الداخلي ليس بالأم...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

يتضمن البروتوكول المقترح إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح.

عزل الحويصلات خارج الخلية ذات المحتوى المنخفض من السموم الداخلية المشتقة من خطوط الخلايا السرطانية

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول كيفية تجنب التلوث بالذيفان الداخلي أثناء عزل الحويصلات خارج الخلية من طافات زراعة الخلايا ، وكيفية تقييمها بشكل صحيح. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن كل مختبر معني بالمركبات الكهربائية قد يحد من تلوث السموم الداخلية عن طريق الحفاظ على إجراء معقم واستخدام معدات بسيطة ومتاحة على نطاق واسع. يجب على كل من يجرب هذه التقنية لأول مرة أن يبدأ بالوسائط الجديدة والكواشف والأواني البلاستيكية منخفضة السموم الداخلية وغير البيروجينية.بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الكواشف الخالية من السموم الداخلية ، والماء ، ووسائط الاستزراع ، و PBS المصفى ، و FBS منخفض السموم الداخلية ، وأنابيب الطرد المركزي الفائقة. للبدء ، اجمع المادة الطافية من خطوط خلايا SW480 و SW620 المزروعة مسبقا في أنابيب سعة 15 ملليلتر تحمل علامات مناسبة. قم بإزالة بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي للطاف عند 500 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.دون إزعاج الحطام ، اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد مسمى ، وجهاز طرد مركزي عند 3،200 × جم لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل بعناية 45 مل من المادة الطافية إلى أنبوب معقم رأسيا سعة 50 ملليلتر ، دون ترطيب حواف الأنبوب. لف غطاء الأنبوب بغشاء معقم وشفاف ، وقم بتخزينه عموديا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للعزل اللاحق للحويصلات خارج الخلية.ابدأ العزل عن طريق تحضير مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر ومحاقن وأنابيب تحتوي على حوالي 90 ملليلترا من المادة الطافية. املأ حقنة بالمادة الطافية ، وقم بتثبيت المرشح على محول الإبرة. قم بتصفية المادة الطافية من خلال المرشح في أنبوب سعة 50 ملليلتر.ماصة سبعة ملليلتر من المرشح في أنبوب الطرد المركزي الفائق المعدة ، وأجهزة الطرد المركزي في 100،000 × غرام لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. استخدم ماصة باستور معقمة للتخلص من المادة الطافية. اسحب الكريات إلى أنبوب طرد مركزي فائق باستخدام طرف ماصة طويل مصفى.شطف الحويصلات خارج الخلية عن طريق إضافة سبعة ملليلتر من PBS المصفى الخالي من السموم الداخلية. بعد الطرد المركزي الفائق ، تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة باستور معقمة وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني خال من السموم الداخلية. انقل التعليق إلى أنبوب اختبار معقم منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر.ثم انقل 10 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر لمزيد من التحليل. لف غطاء الأنبوب واحفظه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. الآن ، في أنبوب جديد ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من التعليق باستخدام PBS المصفى بنسبة 1 إلى 1000 لتحليل تتبع الجسيمات النانوية.لإجراء تحليل النشاف ، قم أولا بخلط 20 ميكروغرام من العينات مع مخزن مؤقت للتحميل. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بتحميل 20 ميكروغرام من العينة في كل بئر من 10 إلى 14٪ من هلام بولي أكريلاميد مع SDS ، وقم بإجراء رحلان كهربائي لمدة 45 دقيقة عند 150 فولت ، مع تشغيل المخزن المؤقت.بعد ذلك ، ضع الجل في آلة نقل مع مخزن مؤقت Towbin ، وقم بإجراء نقل شبه جاف للبروتينات على غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين عند 25 فولت لمدة ساعة واحدة. سد الغشاء مع 1٪ BSA عن طريق احتضانه لمدة ساعة واحدة على الروك. أضف الأجسام المضادة المخففة BSA ، المضادة ل CD9 أو anti-Alix ، إلى الغشاء ، واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية على الروك.بعد إزالة الأجسام المضادة ، اغسل الغشاء ثلاث مرات ب 10 ملليلتر من TBST لمدة 10 دقائق. أضف الآن أجساما مضادة ثانوية مضادة للأرانب أو مضادة للفأر ، واحتضانها مرة أخرى على الروك لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الجسم المضاد ، واغسل الغشاء كما هو موضح سابقا.صب ملليلتر واحد من المحلول الذي يحتوي على الركيزة واللومينول بنسبة متساوية على الغشاء. ضع الغشاء على الفور في نظام التصوير ، وتصور أشرطة البروتين على الشاشة. في الدراسة الحالية ، أكد تحليل اللطخة الغربية وجود علامتين للحويصلة خارج الخلية ، CD9 و Alix.كان متوسط حجم وتركيزات الحويصلات المعزولة من كل من SW480 و SW620 متشابهة. أظهر تحفيز الخلايا الوحيدة بجرعات مختلفة من عديد السكاريد الدهني ، أو LPS ، أن أقل جرعة من LPS تمكن من إفراز الإنترلوكين 10 وعامل نخر الورم في الخلايا الوحيدة كان 50 بيكوجرام لكل ملليلتر. أشار اختبار LAL الكروموجيني إلى أن تلوث LPS للحويصلات خارج الخلية كان حوالي 50 بيكوغرام لكل ملليلتر لكلا خطي الخلية.أهم شيء يجب تذكره هو استخدام الكواشف الخالية من LPS أو المستنفدة ، وقياس LPS الروتيني في كل خطوة من خطوات الإجراء. منع تلوث السموم الداخلية أسهل من القضاء عليه. يحد البروتوكول المقترح من إمكانية حدوث نتائج خاطئة بسبب تلوث المركبات الكهربائية بالذيفان الداخلي ، ويسمح بتقييم نشاط المركبات الكهربائية لكل خلية.البروتوكول المقترح مفيد للباحثين الذين يعملون مع الخلايا الحساسة للسموم الداخلية ، مثل الخلايا الوحيدة والخلايا المتغصنة والبلاعم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / --</sup و البروتين p53 -- / --</sup الفئران

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

إنشاء فيروس ابشتاين بار النمو وتحولت خطوط الخليوي Lymphoblastoid

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

تنقية عالية الغلة الاستعدادات الحويصلة خارج الخلية بعيدا عن الفيروس

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...