Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Centre, Polen, bevillingsnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vil gerne takke professor Tomasz Gosiewski og Agnieszka Krawczyk fra Institut for Molekylær Medicinsk Mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College for deres uvurderlige hjælp til påvisning af bakterielt DNA i elbiler.

1. Fremstilling af ultracentrifugerør
<ol><li>Brug sterile engangsrør. Hvis dette ikke er muligt, skal du genbruge ultracentrifugeglassene efter at have vasket dem med et vaskemiddel med en steril Pasteur-pipette eller andre engangsapplikatorer. Husk, at ultracentrifugeglas skal være dedikeret til én type centrifugeret materiale (cellekultursupernatant/serum/plasma) og arter (menneske/mus/osv.).</li>
	<li>Efter vask af vaskemiddel skylles ultracentrifugeglassene med deioniseret, LPS-frit vand 3x.<b...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

I de seneste år er metoder til korrekt isolering af elektriske køretøjer blevet stadig vigtigere, hvilket gør det muligt at foretage yderligere pålidelige analyser, f.eks. i forbindelse med opnåelse af pålidelige omics og funktionelle data24. Baseret på tidligere forskningserfaringer ser det ud til, at ikke kun typen af isolationsmetode, men også andre forhold under denne procedure kan være vigtige. Brugen af EV-forarmet FBS er bredt anerkendt som en nødvendighed25,26<...

Ekstracellulære vesikler (EV'er) er ifølge MISEV 2018-nomenklaturen et kollektivt udtryk, der beskriver forskellige undertyper af celleudskillede membranøse vesikler, der spiller afgørende roller i adskillige fysiologiske og patologiske processer 1,2. Desuden viser elbiler lovende som nye biomarkører for forskellige sygdomme samt terapeutiske midler og lægemiddelleveringskøretøjer. Det er imidlertid vanskeligt at realisere deres fulde potentiale, da der stadig er mange tekniske hindringer i forbindelse med deres erhvervelse3. En sådan udfordring er isoleringen af endotoksinfrie elbiler, som i mange tilfælde er blevet forsømt. En af de mest almindelige endotoksiner er lipopolysaccharid (LPS), som er en vigtig bestanddel af gramnegative bakteriecellevægge og kan forårsage en akut inflammatorisk reaktion på grund af frigivelsen af et stort antal inflammatoriske cytokiner af forskellige celler 4,5. LPS inducerer et respons ved binding til LPS-bindende protein efterfulgt af interaktion med CD14/TLR4/MD2-komplekset på myeloide celler. Denne interaktion fører til aktivering af MyD88- og TRIF-afhængige signalveje, som igen udløser den nukleare faktor kappa B (NFkB). Translokation af NFkB til kernen initierer produktionen af cytokiner6. Monocytter og makrofager er meget følsomme over for LPS, og deres eksponering for LPS resulterer i frigivelse af inflammatoriske cytokiner og kemokiner (fx IL-6, IL-12, CXCL8 og TNF-α)7,8. CD14-strukturen muliggør binding af forskellige LPS-arter med lignende affinitet og fungerer som en co-receptor for andre toll-lignende receptorer (TLR'er) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 og 9)6. Antallet af undersøgelser, der udføres på virkningerne af EV'er på monocytter / makrofager, stiger stadig 9,10,11. Især ud fra perspektivet om at studere monocytternes funktioner, deres subpopulationer og andre immunceller er tilstedeværelsen af endotoksin og endda deres maskerede tilstedeværelse i elbiler af stor betydning12. Den oversete forurening af elbiler med endotoksiner kan føre til vildledende konklusioner og skjule deres sande biologiske aktivitet. Med andre ord kræver arbejde med monocytiske celler tillid til fravær af endotoksinforurening13. Potentielle kilder til endotoksiner kan være vand, kommercielt opnåede medier og sera, mediekomponenter og additiver, laboratorieglasvarer og plastvarer 5,14,15.
Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle en protokol til isolering af elbiler med lavt endotoksinholdigt indhold. Protokollen giver enkle tip til, hvordan man undgår endotoksinforurening under EVs isolering i stedet for at fjerne endotoksiner fra EV'er. Tidligere er der blevet præsenteret mange protokoller om, hvordan man fjerner endotoksiner fra for eksempel konstruerede nanopartikler, der anvendes i nanomedicin; Ingen af dem er dog nyttige til biologiske strukturer såsom elbiler. Den effektive depyrogenering af nanopartikler kan udføres ved skylning af ethanol eller eddikesyre, opvarmning til 175 °C i 3 timer, γ bestråling eller triton X-100-behandling; Disse procedurer fører imidlertid til destruktion af elbiler16,17.
Den præsenterede protokol er en banebrydende undersøgelse med fokus på at undgå endotoksin urenheder i EV'er, i modsætning til tidligere undersøgelser af effekten af EV'er på monocytter9. Anvendelse af foreslåede principper på laboratoriepraksis kan bidrage til at opnå pålidelige forskningsresultater, hvilket kan være afgørende, når man overvejer den potentielle anvendelse af EV'er som terapeutiske midler i klinikken12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Ekstracellulære vesikler (EV'er) er en heterogen population af membranvesikler frigivet af celler in vitro og in vivo. Deres allestedsnærværende og betydelige rolle som bærere af biologisk information gør dem spændende studieobjekter, der kræver pålidelige og gentagne protokoller for deres isolering. Det er imidlertid vanskeligt at realisere deres fulde potentiale, da der stadig er mange tekniske hindringer relateret til deres forskning (som korrekt erhvervelse). Denne undersøgelse præsenterer en protokol til isolering af små elbiler (ifølge MISEV 2018-nomenklaturen) fra kultursupernatanten af tumorcellelinjer baseret på differentiel centrifugering. Protokollen indeholder retningslinjer for, hvordan man undgår forurening med endotoksiner under isolering af elbiler, og hvordan man korrekt evaluerer dem. Endotoksinforurening af elbiler kan betydeligt hindre efterfølgende eksperimenter eller endda maskere deres sande biologiske virkninger. På den anden side kan den oversete tilstedeværelse af endotoksiner føre til forkerte konklusioner. Dette er af særlig betydning, når der henvises til celler i immunsystemet, herunder monocytter, fordi monocytter udgør en befolkning, der er særlig følsom over for endotoksinrester. Derfor anbefales det stærkt at screene EV'er for endotoksinforurening, især når man arbejder med endotoksinfølsomme celler såsom monocytter, makrofager, myeloidafledte suppressorceller eller dendritiske celler.

En forudsætning eller obligatorisk trin for denne protokol er udelukkelse af mulig endotoksinforurening fra reagenser. Alle de anvendte reagenser, såsom FBS, DMEM, RPMI, PBS og endda ultracentrifugerør, skal være endotoksinfri (<0,005 EU / ml). Det er ikke let at opretholde regimet uden endotoksinkontaminering, da f.eks. det almindelige/standardserum til cellekultur kan være dets rige kilde (0,364 EU/ml; se tabel 1).
Selvom denne protokol blev udviklet til at isolere elbi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Den foreslåede protokol indeholder retningslinjer for, hvordan kontaminering med endotoksin undgås under isolering af ekstracellulære vesikler fra cellekultursupernatanter, og hvordan de evalueres korrekt.

Isolering af ekstracellulære vesikler med lavt endotoksinindhold afledt af kræftcellelinjer

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Denne protokol indeholder retningslinjer for, hvordan man undgår kontaminering med endotoksin under isolering af ekstracellulære vesikler fra cellekultursupernatanter, og hvordan man korrekt evaluerer dem. Den største fordel ved denne protokol er, at ethvert laboratorium, der beskæftiger sig med elbiler, kan begrænse endotoksinforurening ved at holde en aseptisk procedure og bruge simpelt og bredt tilgængeligt udstyr. Alle, der prøver denne teknik for første gang, bør starte med nye medier, reagenser og plastvarer, der er lavendotoksin, ikke-pyrogene mærket.Til denne protokol skal du bruge endotoksinfrie reagenser, vand, kulturmedier, filtreret PBS, ultra lavendotoksin FBS og ultracentrifugerør. Til at begynde med samles supernatanten fra tidligere dyrkede SW480- og SW620-cellelinjer i passende mærkede 15 milliliter rør. Cellerester fjernes ved centrifugering af supernatanten ved 500 x g i fem minutter ved stuetemperatur.Uden at forstyrre affaldet samles supernatanten i et nyt mærket rør og centrifugeres ved 3.200 x g i 12 minutter ved fire grader Celsius. 45 ml supernatant overføres forsigtigt til et lodret anbragt sterilt 50 ml-glas uden at gøre rørets kanter våde. Pak rørets hætte med en steril, gennemsigtig film, og opbevar den lodret ved minus 80 grader Celsius til efterfølgende isolering af ekstracellulære vesikler.Isolationen påbegyndes ved at klargøre 0,22 mikrometer sprøjtefiltre, sprøjter og tuber, der indeholder ca. 90 ml supernatant. Fyld en sprøjte med supernatanten, og fastgør filteret til kanyleadapteren. Supernatanten filtreres gennem filteret over i et glas på 50 ml.Pipette syv ml af filtratet i et forberedt ultracentrifugerør og centrifuger ved 100.000 x g i to timer ved fire grader Celsius. Brug en steril Pasteur-pipette til at kassere supernatanten. Træk pillerne ind i et ultracentrifugerør ved hjælp af en lang filtreret pipettespids.Skyl de ekstracellulære vesikler ved at tilsætte syv ml filtreret endotoksinfri PBS. Efter ultracentrifugering kasseres supernatanten med en steril Pasteur-pipette, og pelletpen resuspenderes i 200 mikroliter endotoksinfri PBS. Overfør suspensionen til et sterilt 1,5 ml reagensglas med lavt proteinbindingsgrundlag.Overfør derefter 10 mikroliter suspension til et nyt 1,5 ml rør til yderligere analyse. Pak hætten på røret, og opbevar den ved minus 80 grader Celsius. Nu, i et nyt rør, fortyndes en mikroliter suspension ved hjælp af filtreret PBS i et forhold på 1 til 1000 til nanopartikelsporingsanalyse.For at udføre blottinganalyse blandes først 20 mikrogram af prøverne med en belastningsbuffer. Prøverne inkuberes ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Derefter lægges 20 mikrogram af prøven i hvert hul i en 10 til 14% polyacrylamidgel med SDS, og der udføres elektroforese i 45 minutter ved 150 volt med løbende buffer.Anbring derefter gelen i en overførselsmaskine med Towbin-buffer, og udfør en halvtør overførsel af proteiner på en polyvinylidendifluoridmembran ved 25 volt i en time. Bloker membranen med 1%BSA ved at inkubere den i en time på en vippe. Tilsæt BSA-fortyndede antistoffer, anti-CD9 eller anti-Alix, til membranen, og inkuber natten over ved fire grader Celsius på en vippe.Efter fjernelse af antistofferne vaskes membranen tre gange med 10 ml TBST i 10 minutter. Tilføj nu ged anti-kanin eller anti-mus sekundært antistof, og inkuber igen på en rocker i en time ved stuetemperatur. Kassér antistoffet, og vask membranen som tidligere vist.Hæld en milliliter af opløsningen indeholdende substrat og luminol i et lige forhold på membranen. Placer straks membranen i et billeddannelsessystem, og visualiser proteinbåndene på skærmen. I denne undersøgelse bekræftede western blot-analyse tilstedeværelsen af to ekstracellulære vesikelmarkører, CD9 og Alix.Den gennemsnitlige størrelse og koncentrationerne af vesiklerne isoleret fra både SW480 og SW620 var ens. Stimulering af monocyt med forskellige doser lipopolysaccharid eller LPS viste den laveste dosis LPS, der muliggjorde sekretion af interleukin 10, og tumornekrosefaktor i monocytter var 50 picogram pr. milliliter. Den kromogene LAL-test viste, at LPS-forurening af de ekstracellulære vesikler var omkring 50 picogram pr. milliliter for begge cellelinjer.Den vigtigste ting at huske er brugen af LPS-fri eller udtømte reagenser og rutinemæssig LPS-måling på hvert trin i proceduren. Det er lettere at forhindre endotoksinforurening end at fjerne det. Den foreslåede protokol begrænser muligheden for falske resultater på grund af forurening af elbiler med endotoksin og gør det muligt at vurdere elbilernes aktivitet pr. celle.Den foreslåede protokol er nyttig for forskere, der arbejder med endotoksinfølsomme celler, som monocytter, dendritiske celler og makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Etablering af Epstein-Barr virus Vækst-transformerede lymfoblastoide cellelinjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske ved hjælp af en ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Rensning af ekstracellulære vesikulære præparater med høj udbytte afstand fra virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler produceret af jern begrænsede mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...