Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum, Polen, unter der Fördernummer 2019/33/B/NZ5/00647 unterstützt. Wir danken Professor Tomasz Gosiewski und Agnieszka Krawczyk von der Abteilung für Molekulare Medizinische Mikrobiologie des Medizinischen Kollegs der Jagiellonen-Universität für ihre unschätzbare Hilfe beim Nachweis von bakterieller DNA in Elektrofahrzeugen.

1. Vorbereitung von Ultrazentrifugenröhrchen
<ol><li>Verwenden Sie sterile Einwegröhrchen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen wieder, nachdem Sie sie mit einem Reinigungsmittel mit einer sterilen Pasteurpipette oder anderen Einwegapplikatoren gewaschen haben. Denken Sie daran, dass Ultrazentrifugenröhrchen für eine Art von zentrifugiertem Material (Zellkulturüberstand/Serum/Plasma) und Spezies (Mensch/Maus/etc.) bestimmt sein sollten.</li>
	<li>Spülen Sie di...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

In den letzten Jahren haben Methoden zur ordnungsgemäßen Isolierung von Elektrofahrzeugen zunehmend an Bedeutung gewonnen, um weitere zuverlässige Analysen zu ermöglichen, z. B. im Zusammenhang mit der Gewinnung zuverlässiger Omics- und Funktionsdaten24. Basierend auf früheren Forschungserfahrungen scheint es, dass nicht nur die Art der Isolationsmethode, sondern auch andere Bedingungen während dieses Verfahrens wichtig sein können. Die Verwendung von EV-abgereichertem FBS wird weithin als...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen 1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffunggibt 3. Eine solche Herausforderung ist die Isolierung von endotoxinfreien Elektrofahrzeugen, die in vielen Fällen vernachlässigt wurde. Eines der häufigsten Endotoxine ist das Lipopolysaccharid (LPS), das ein Hauptbestandteil gramnegativer bakterieller Zellwände ist und aufgrund der Freisetzung einer großen Anzahl von entzündlichen Zytokinen durch verschiedene Zellen eine akute Entzündungsreaktion hervorrufen kann 4,5. LPS induziert eine Reaktion durch Bindung an das LPS-bindende Protein, gefolgt von einer Interaktion mit dem CD14/TLR4/MD2-Komplex auf myeloischen Zellen. Diese Wechselwirkung führt zur Aktivierung von MyD88- und TRIF-abhängigen Signalwegen, was wiederum den Kernfaktor Kappa B (NFkB) auslöst. Die Translokation von NFkB in den Zellkern initiiert die Produktion von Zytokinen6. Monozyten und Makrophagen reagieren sehr empfindlich auf LPS, und ihre Exposition gegenüber LPS führt zu einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (z. B. IL-6, IL-12, CXCL8 und TNF-α)7,8. Die CD14-Struktur ermöglicht die Bindung verschiedener LPS-Spezies mit ähnlicher Affinität und dient als Co-Rezeptor für andere Toll-like-Rezeptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 und 9)6. Die Zahl der Studien, die zu den Auswirkungen von EVs auf Monozyten/Makrophagen durchgeführt werden, nimmt immer noch zu 9,10,11. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Funktionen von Monozyten, ihren Subpopulationen und anderen Immunzellen ist das Vorhandensein von Endotoxin und sogar ihre maskierte Anwesenheit in EVs von großer Bedeutung12. Die übersehene Kontamination von Elektrofahrzeugen mit Endotoxinen kann zu irreführenden Schlussfolgerungen führen und ihre wahre biologische Aktivität verschleiern. Mit anderen Worten, die Arbeit mit monozytären Zellen erfordert Vertrauen in die Abwesenheit einer Endotoxinkontamination13. Mögliche Quellen für Endotoxine können Wasser, kommerziell erhältliche Medien und Seren, Medienkomponenten und -additive, Laborglaswaren und Kunststoffwaren 5,14,15 sein.
Daher zielte diese Studie darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung von niedrig endotoxinhaltigen EVs zu entwickeln. Das Protokoll enthält einfache Hinweise, wie eine Endotoxinkontamination während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden werden kann, anstatt Endotoxine aus Elektrofahrzeugen zu entfernen. Zuvor wurden viele Protokolle vorgestellt, wie Endotoxine beispielsweise aus technisch hergestellten Nanopartikeln entfernt werden können, die in der Nanomedizin verwendet werden. Keiner von ihnen ist jedoch für biologische Strukturen wie EVs nützlich. Die effektive Depyrogenisierung von Nanopartikeln kann durch Ethanol- oder Essigsäurespülen, Erhitzen auf 175 °C für 3 h, γ Bestrahlung oder Triton-X-100-Behandlung erfolgen; Diese Verfahren führen jedoch zur Zerstörung von Elektrofahrzeugen16,17.
Das vorgestellte Protokoll ist eine bahnbrechende Studie, die sich auf die Vermeidung von Endotoxinverunreinigungen in EVs konzentriert, im Gegensatz zu früheren Studien zur Wirkung von EVs auf Monozyten9. Die Anwendung der vorgeschlagenen Prinzipien auf die Laborpraxis kann dazu beitragen, zuverlässige Forschungsergebnisse zu erhalten, was entscheidend sein kann, wenn die mögliche Verwendung von EVs als Therapeutika in der Klinik in Betracht gezogen wird12.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine heterogene Population von Membranvesikeln, die von Zellen in vitro und in vivo freigesetzt werden. Ihre Allgegenwart und ihre bedeutende Rolle als Träger biologischer Informationen machen sie zu faszinierenden Studienobjekten, die zuverlässige und sich wiederholende Protokolle für ihre Isolierung erfordern. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Forschung gibt (wie z.B. die richtige Beschaffung). Diese Studie stellt ein Protokoll für die Isolierung kleiner EVs (gemäß der MISEV 2018-Nomenklatur) aus dem Kulturüberstand von Tumorzelllinien vor, das auf differentieller Zentrifugation basiert. Das Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxinen während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden und richtig bewertet werden kann. Eine Endotoxin-Kontamination von EVs kann nachfolgende Experimente erheblich behindern oder sogar ihre wahren biologischen Auswirkungen verschleiern. Andererseits kann das übersehene Vorhandensein von Endotoxinen zu falschen Schlussfolgerungen führen. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn es um Zellen des Immunsystems, einschließlich Monozyten, geht, da Monozyten eine Population darstellen, die besonders empfindlich auf Endotoxinrückstände reagiert. Daher wird dringend empfohlen, EVs auf Endotoxinkontamination zu untersuchen, insbesondere wenn mit endotoxinempfindlichen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen oder dendritischen Zellen gearbeitet wird.

Voraussetzung oder obligatorischer Schritt für dieses Protokoll ist der Ausschluss einer möglichen Endotoxinkontamination aus Reagenzien. Alle verwendeten Reagenzien wie FBS, DMEM, RPMI, PBS und sogar Ultrazentrifugenröhrchen müssen endotoxinfrei sein (<0,005 EU/ml). Es ist nicht einfach, das Regime ohne Endotoxinkontamination aufrechtzuerhalten, da z. B. das Normal-/Standardserum für die Zellkultur eine reichhaltige Quelle sein kann (0,364 EU/ml; siehe Tabelle 1).
Obwohl...

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Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Dieses Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass jedes Labor, das sich mit Elektrofahrzeugen befasst, die Endotoxinkontamination begrenzen kann, indem es ein aseptisches Verfahren durchführt und einfache und weit verbreitete Geräte verwendet. Jeder, der diese Technik zum ersten Mal ausprobiert, sollte mit neuen Medien, Reagenzien und Kunststoffen beginnen, die endotoxinarm, nicht pyrogen markiert sind.Verwenden Sie für dieses Protokoll endotoxinfreie Reagenzien, Wasser, Nährmedien, gefiltertes PBS, FBS mit extrem niedrigem Endotoxingehalt und Ultrazentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zunächst den Überstand von zuvor kultivierten SW480- und SW620-Zelllinien in entsprechend markierten 15-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie den Überstand fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500 x g zentrifugieren.Sammeln Sie den Überstand, ohne den Schmutz zu stören, in einem neuen beschrifteten Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 3.200 x g für 12 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie vorsichtig 45 Milliliter des Überstands in ein senkrecht aufgestelltes steriles 50-Milliliter-Röhrchen, ohne die Ränder des Röhrchens zu benetzen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens mit einer sterilen, transparenten Folie ein und lagern Sie sie senkrecht bei minus 80 Grad Celsius, um anschließend extrazelluläre Vesikel zu isolieren.Beginnen Sie mit der Isolierung, indem Sie 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter, Spritzen und Röhrchen mit etwa 90 Millilitern Überstand vorbereiten. Füllen Sie eine Spritze mit dem Überstand und befestigen Sie den Filter am Nadeladapter. Filtern Sie den Überstand durch den Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen.Sieben Milliliter des Filtrats werden in ein vorbereitetes Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Stunden lang bei 100.000 x g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um den Überstand zu entsorgen. Ziehen Sie die Pellets mit einer langen gefilterten Pipettenspitze in ein Ultrazentrifugenröhrchen.Spülen Sie die extrazellulären Vesikel durch Zugabe von sieben Millilitern gefiltertem endotoxinfreiem PBS. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette verworfen und das Pellet in 200 Mikrolitern endotoxinfreiem PBS resuspendiert. Übertragen Sie die Suspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Reagenzglas mit geringer Proteinbindung.Übertragen Sie dann 10 Mikroliter Suspension zur weiteren Analyse in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Wickeln Sie die Kappe des Röhrchens ein und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Verdünnen Sie nun in einem neuen Röhrchen einen Mikroliter Suspension mit gefiltertem PBS im Verhältnis 1 zu 1000 für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.Um eine Blotting-Analyse durchzuführen, mischen Sie zunächst 20 Mikrogramm der Proben mit einem Beladungspuffer. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Laden Sie dann 20 Mikrogramm der Probe in jede Vertiefung eines 10 bis 14%igen Polyacrylamidgels mit SDS und führen Sie eine Elektrophorese für 45 Minuten bei 150 Volt mit laufendem Puffer durch.Als nächstes geben Sie das Gel in eine Transfermaschine mit Towbin-Puffer und führen eine Stunde lang einen halbtrockenen Transfer von Proteinen auf eine Polyvinylidendifluoridmembran bei 25 Volt durch. Blockieren Sie die Membran mit 1% BSA, indem Sie sie eine Stunde lang auf einer Wippe inkubieren. Fügen Sie der Membran BSA-verdünnte Antikörper, Anti-CD9 oder Anti-Alix, hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe.Waschen Sie die Membran nach dem Entfernen der Antikörper dreimal 10 Minuten lang mit 10 Millilitern TBST. Fügen Sie nun Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie erneut eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Entsorgen Sie den Antikörper und waschen Sie die Membran wie zuvor gezeigt.Gießen Sie einen Milliliter der Lösung, die Substrat und Luminol enthält, in einem gleichen Verhältnis auf die Membran. Platzieren Sie die Membran sofort in einem Bildgebungssystem und visualisieren Sie die Proteinbanden auf dem Bildschirm. In der vorliegenden Studie bestätigte die Western-Blot-Analyse das Vorhandensein von zwei extrazellulären Vesikelmarkern, CD9 und Alix.Die mittlere Größe und die Konzentrationen der Vesikel, die sowohl aus SW480 als auch aus SW620 isoliert wurden, waren ähnlich. Die Stimulation von Monozyten mit verschiedenen Dosen von Lipopolysaccharid (LPS) zeigte die niedrigste Dosis von LPS, die die Sekretion von Interleukin 10 ermöglichte, und der Tumornekrosefaktor in Monozyten betrug 50 Pikogramm pro Milliliter. Der chromogene LAL-Test zeigte, dass die LPS-Kontamination der extrazellulären Vesikel für beide Zelllinien etwa 50 Pikogramm pro Milliliter betrug.Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist die Verwendung von LPS-freien oder abgereicherten Reagenzien und die routinemäßige LPS-Messung bei jedem Schritt des Verfahrens. Es ist einfacher, eine Endotoxinkontamination zu verhindern, als sie zu beseitigen. Das vorgeschlagene Protokoll begrenzt die Möglichkeit falscher Ergebnisse aufgrund der Kontamination von EVs mit Endotoxin und ermöglicht die Bewertung der EV-Aktivität pro Zelle.Das vorgeschlagene Protokoll ist nützlich für Forscher, die mit Endotoxin-empfindlichen Zellen wie Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen arbeiten.

Research

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

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