Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia, numero di sovvenzione 2019/33/B/NZ5/00647. Vorremmo ringraziare il professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk del Dipartimento di Microbiologia Medica Molecolare, Jagiellonian University Medical College per il loro inestimabile aiuto nella rilevazione del DNA batterico nelle EV.

1. Preparazione di tubi per ultracentrifuga
<ol><li>Utilizzare tubi sterili monouso. Se ciò non è possibile, riutilizzare i tubi ultracentrifuga dopo averli lavati con un detergente utilizzando una pipetta sterile Pasteur o altri applicatori monouso. Ricorda che le provette ultracentrifughe dovrebbero essere dedicate a un tipo di materiale centrifugato (coltura cellulare supernatante / siero / plasma) e specie (uomo / topo / ecc.).</li>
	<li>Dopo un lavaggio detergente, sciacquare i tubi dell'ultrace...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

Negli ultimi anni, i metodi per un corretto isolamento dei veicoli elettrici sono diventati sempre più importanti, consentendo loro ulteriori analisi affidabili, ad esempio, nel contesto dell'ottenimento di omiche affidabili e dati funzionali24. Sulla base di precedenti esperienze di ricerca, sembra che non solo il tipo di metodo di isolamento, ma anche altre condizioni durante questa procedura possano essere importanti. L'uso di FBS impoveriti di EV è ampiamente riconosciuto come una necessità...

Le vescicole extracellulari (EV), secondo la nomenclatura MISEV 2018, sono un termine collettivo che descrive vari sottotipi di vescicole membranose secrete da cellule che svolgono ruoli cruciali in numerosi processi fisiologici e patologici 1,2. Inoltre, i veicoli elettrici sono promettenti come nuovi biomarcatori per varie malattie, nonché agenti terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro acquisizione3. Una di queste sfide è l'isolamento delle EV prive di endotossine, che è stato trascurato in molti casi. Una delle endotossine più comuni è il lipopolisaccaride (LPS), che è un componente importante delle pareti cellulari batteriche gram-negative e può causare una risposta infiammatoria acuta, a causa del rilascio di un gran numero di citochine infiammatorie da parte di varie cellule 4,5. LPS induce una risposta legandosi alla proteina legante LPS, seguita dall'interazione con il complesso CD14/TLR4/MD2 sulle cellule mieloidi. Questa interazione porta all'attivazione di vie di segnalazione dipendenti da MyD88 e TRIF, che a loro volta innescano il fattore nucleare kappa B (NFkB). La traslocazione di NFkB nel nucleo avvia la produzione di citochine6. I monociti e i macrofagi sono altamente sensibili agli LPS e la loro esposizione agli LPS provoca un rilascio di citochine infiammatorie e chemochine (ad esempio, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. La struttura CD14 consente il legame di diverse specie di LPS con affinità simile e funge da co-recettore per altri recettori toll-like (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. Il numero di studi condotti sugli effetti delle EV sui monociti/macrofagi è ancora in aumentodi 9,10,11. Soprattutto dal punto di vista dello studio delle funzioni dei monociti, delle loro sottopopolazioni e di altre cellule immunitarie, la presenza di endotossine e persino la loro presenza mascherata nelle EV è di grande importanza12. La contaminazione trascurata delle EV con endotossine può portare a conclusioni fuorvianti e nascondere la loro vera attività biologica. In altre parole, lavorare con cellule monocitiche richiede fiducia in assenza di contaminazione da endotossine13. Le potenziali fonti di endotossine possono essere acqua, terreni e sieri ottenuti commercialmente, componenti e additivi dei supporti, vetreria da laboratorio e articoli in plastica 5,14,15.
Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un protocollo per l'isolamento di EV contenenti endotossine basse. Il protocollo fornisce semplici suggerimenti su come evitare la contaminazione da endotossine durante l'isolamento delle EV invece di rimuovere le endotossine dalle EV. In precedenza, sono stati presentati molti protocolli su come rimuovere le endotossine, ad esempio, dalle nanoparticelle ingegnerizzate utilizzate in nanomedicina; tuttavia, nessuno di essi è utile per strutture biologiche come i veicoli elettrici. L'efficace depirogenazione delle nanoparticelle può essere effettuata mediante risciacquo con etanolo o acido acetico, riscaldamento a 175 °C per 3 ore, irradiazione γ o trattamento tritone X-100; tuttavia, queste procedure portano alla distruzione dei veicoli elettrici16,17.
Il protocollo presentato è uno studio pionieristico incentrato sull'evitare le impurità delle endotossine nelle EV, a differenza dei precedenti studi sull'effetto delle EV sui monociti9. L'applicazione dei principi proposti alla pratica di laboratorio può aiutare a ottenere risultati di ricerca affidabili, che possono essere cruciali quando si considera il potenziale uso di EV come agenti terapeutici nella clinica12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Le vescicole extracellulari (EV) sono una popolazione eterogenea di vescicole di membrana rilasciate dalle cellule in vitro e in vivo. La loro onnipresenza e il ruolo significativo come portatori di informazioni biologiche li rendono oggetti di studio intriganti, che richiedono protocolli affidabili e ripetitivi per il loro isolamento. Tuttavia, realizzare il loro pieno potenziale è difficile in quanto ci sono ancora molti ostacoli tecnici legati alla loro ricerca (come l'acquisizione corretta). Questo studio presenta un protocollo per l'isolamento di piccole EV (secondo la nomenclatura MISEV 2018) dalla coltura surnatante di linee cellulari tumorali basate sulla centrifugazione differenziale. Il protocollo include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossine durante l'isolamento delle EV e su come valutarle correttamente. La contaminazione da endotossine delle EV può ostacolare significativamente gli esperimenti successivi o addirittura mascherare i loro veri effetti biologici. D'altra parte, la presenza trascurata di endotossine può portare a conclusioni errate. Ciò è di particolare importanza quando ci si riferisce alle cellule del sistema immunitario, compresi i monociti, perché i monociti costituiscono una popolazione particolarmente sensibile ai residui di endotossine. Pertanto, è altamente raccomandato eseguire lo screening delle EV per la contaminazione da endotossine, specialmente quando si lavora con cellule sensibili all'endotossina come monociti, macrofagi, cellule soppressori derivate da mieloidi o cellule dendritiche.

Un prerequisito o un passo obbligatorio per questo protocollo è l'esclusione di possibili contaminazioni da endotossine dai reagenti. Tutti i reagenti utilizzati, come FBS, DMEM, RPMI, PBS e persino provette da ultracentrifuga, devono essere privi di endotossine (<0,005 EU/mL). Mantenere il regime di non contaminazione da endotossine non è facile in quanto, ad esempio, il siero normale/standard per la coltura cellulare può essere la sua ricca fonte (0,364 EU/ml; vedi Tabella 1).
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Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Il protocollo proposto include linee guida su come evitare la contaminazione con endotossina durante l'isolamento di vescicole extracellulari da supernatanti di coltura cellulare e su come valutarle correttamente.

Isolamento di vescicole extracellulari a basso contenuto di endotossine derivate da linee cellulari tumorali

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Questo protocollo fornisce linee guida su come evitare la contaminazione con endotossina durante l'isolamento di vescicole extracellulari da supernatanti di coltura cellulare e su come valutarle correttamente. Il vantaggio principale di questo protocollo è che ogni laboratorio che si occupa di EV può limitare la contaminazione da endotossine mantenendo una procedura asettica e utilizzando apparecchiature semplici e ampiamente disponibili. Tutti coloro che stanno provando questa tecnica per la prima volta dovrebbero iniziare con nuovi media, reagenti e articoli in plastica che sono a bassa endotossina, non pirogeni marcati.Per questo protocollo, utilizzare reagenti privi di endotossine, acqua, terreni di coltura, PBS filtrato, FBS a bassissima endotossina e tubi per ultracentrifuga. Per iniziare, raccogliere il surnatante da linee cellulari SW480 e SW620 precedentemente coltivate in tubi da 15 millilitri opportunamente etichettati. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando il surnatante a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.Senza disturbare i detriti, raccogliere il surnatante in un nuovo tubo etichettato e centrifugare a 3.200 x g per 12 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire con attenzione 45 millilitri di surnatante in un tubo sterile da 50 millilitri posizionato verticalmente, senza bagnare i bordi del tubo. Avvolgere il cappuccio del tubo con una pellicola sterile e trasparente e conservarlo verticalmente a meno 80 gradi Celsius per il successivo isolamento delle vescicole extracellulari.Iniziare l'isolamento preparando filtri per siringhe da 0,22 micrometri, siringhe e tubi contenenti circa 90 millilitri di surnatante. Riempire una siringa con il surnatante e fissare il filtro all'adattatore dell'ago. Filtrare il surnatante attraverso il filtro in un tubo da 50 millilitri.Pipettare sette millilitri del filtrato in un tubo di ultracentrifuga preparato e centrifugare a 100.000 x g per due ore a quattro gradi Celsius. Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per eliminare il surnatante. Tirare i pellet in un tubo ultracentrifugo utilizzando una punta di pipetta filtrata lunga.Risciacquare le vescicole extracellulari aggiungendo sette millilitri di PBS filtrato privo di endotossine. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante utilizzando una pipetta Pasteur sterile e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS privo di endotossine. Trasferire la sospensione in una provetta sterile a basso legame proteico da 1,5 millilitri.Quindi trasferire 10 microlitri di sospensione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri per ulteriori analisi. Avvolgere il cappuccio del tubo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Ora, in un nuovo tubo, diluire un microlitro di sospensione utilizzando PBS filtrato in un rapporto di 1 a 1000 per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle.Per eseguire l'analisi di blotting, mescolare prima 20 microgrammi di campioni con un buffer di caricamento. Incubare i campioni a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi caricare 20 microgrammi del campione in ciascun pozzetto di un gel di poliacrilammide dal 10 al 14% con SDS ed eseguire l'elettroforesi per 45 minuti a 150 volt, con tampone corrente.Quindi, posizionare il gel in una macchina di trasferimento con tampone Towbin ed eseguire un trasferimento semi-secco di proteine su una membrana di difluoruro di polivinilidene a 25 volt per un'ora. Bloccare la membrana con 1% BSA incubandola per un'ora su un bilanciere. Aggiungere anticorpi diluiti BSA, anti-CD9 o anti-Alix, alla membrana e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius su un bilanciere.Dopo aver rimosso gli anticorpi, lavare la membrana tre volte con 10 millilitri di TBST per 10 minuti. Ora aggiungi l'anticorpo secondario anti-coniglio o anti-topo di capra e incubare di nuovo su un rocker per un'ora a temperatura ambiente. Eliminare l'anticorpo e lavare la membrana come dimostrato in precedenza.Versare un millilitro della soluzione contenente substrato e luminolo in un rapporto uguale sulla membrana. Posizionare immediatamente la membrana in un sistema di imaging e visualizzare le bande proteiche sullo schermo. Nel presente studio, l'analisi western blot ha confermato la presenza di due marcatori di vescicole extracellulari, CD9 e Alix.Le dimensioni medie e le concentrazioni delle vescicole isolate sia da SW480 che da SW620 erano simili. La stimolazione del monocita con diverse dosi di lipopolisaccaride, o LPS, ha mostrato che la dose più bassa di LPS che consente la secrezione di interleuchina 10 e il fattore di necrosi tumorale nei monociti era di 50 picogrammi per millilitro. Il test cromogenico LAL ha indicato che la contaminazione da LPS delle vescicole extracellulari era di circa 50 picogrammi per millilitro per entrambe le linee cellulari.La cosa più importante da ricordare è l'uso di reagenti privi di LPS o impoveriti e la misurazione LPS di routine in ogni fase della procedura. Prevenire la contaminazione da endotossine è più facile che eliminarla. Il protocollo proposto limita la possibilità di risultati falsi a causa della contaminazione delle EV con endotossina e consente di valutare l'attività delle EV per cellula.Il protocollo proposto è utile per i ricercatori che lavorano con cellule sensibili alle endotossine, come monociti, cellule dendritiche e macrofagi.

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