Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
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この研究は、ポーランド国立科学センター、助成金番号2019/33 / B / NZ5 / 00647によってサポートされました。ヤギェウォ大学医科大学分子医学微生物学部のTomasz Gosiewski教授とAgnieszka Krawczyk教授が、EVの細菌DNAの検出に貴重な支援をしてくださったことに感謝します。

1.超遠心チューブの準備
<ol><li>滅菌済みの使い捨てチューブを使用してください。これが不可能な場合は、滅菌パスツールピペットまたは他の使い捨てアプリケーターを使用して洗剤で洗浄した後、超遠心チューブを再利用してください。超遠心チューブは、1種類の遠心分離材料(細胞培養上清/血清/血漿)と種(ヒト/マウスなど)専用にする必要があることを忘れないでください?...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

ここ数年、EVを適切に分離する方法がますます重要になり、たとえば、信頼性の高いオミクスおよび機能データを取得するという文脈で、EVのさらなる信頼性の高い分析が可能になりました24。これまでの研究経験から、分離方法の種類だけでなく、この手順中の他の条件も重要かもしれないようです。EV枯渇FBSの使用は、必要性として広く認識されています25,26...

MISEV 2018命名法によると、細胞外小胞(EV)は、多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす細胞分泌膜小胞のさまざまなサブタイプを表す総称です1,2。さらに、EVは、さまざまな疾患の新規バイオマーカー、治療薬、ドラッグデリバリービークルとして有望視されています。しかし、買収に関連する多くの技術的障害がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です3。そのような課題の1つは、多くの場合無視されてきたエンドトキシンフリーEVの分離です。最も一般的なエンドトキシンの1つはリポ多糖(LPS)であり、これはグラム陰性細菌細胞壁の主成分であり、さまざまな細胞による多数の炎症性サイトカインの放出により急性炎症反応を引き起こす可能性があります4,5。LPSは、LPS結合タンパク質に結合し、続いて骨髄系細胞上のCD14/TLR4/MD2複合体との相互作用によって応答を誘導します。この相互作用は、MyD88およびTRIF依存性シグナル伝達経路の活性化をもたらし、それが次に核因子κB(NFkB)を誘発する。NFkBの核への転座は、サイトカイン6の産生を開始する。単球およびマクロファージはLPSに対して非常に感受性が高く、LPSへの曝露は炎症性サイトカインおよびケモカイン(例えば、IL-6、IL-12、CXCL8、およびTNF-α)の放出をもたらす7,8。CD14構造は、同様の親和性を持つ異なるLPS種の結合を可能にし、他のトール様受容体(TLR)(TLR1、2、3、4、6、7、および9)の共受容体として機能します6。単球/マクロファージに対するEVの効果について実施されている研究の数は、依然として増加しています9,10,11。特に単球、その亜集団、および他の免疫細胞の機能を研究する観点から、エンドトキシンの存在、さらにはEVにおけるそれらのマスクされた存在さえも非常に重要です12。エンドトキシンによるEVの見過ごされた汚染は、誤解を招く結論につながり、それらの真の生物学的活性を隠す可能性があります。言い換えれば、単球細胞を扱うには、エンドトキシン汚染がないことに自信が必要です13。エンドトキシンの潜在的な供給源は、水、商業的に入手した培地および血清、培地成分および添加剤、実験用ガラス器具、およびプラスチック製品であり得る5、14、15。
したがって、この研究は、低エンドトキシン含有EVの分離のためのプロトコルを開発することを目的としていました。このプロトコルは、EVからエンドトキシンを除去する代わりに、EVの分離中にエンドトキシン汚染を回避する方法に関する簡単なヒントを提供します。これまで、ナノメディシンで使用される操作されたナノ粒子などからエンドトキシンを除去する方法について多くのプロトコルが提示されてきました。しかし、それらのどれもEVのような生物学的構造には有用ではありません。ナノ粒子の効果的な脱パイロジェン化は、エタノールまたは酢酸のすすぎ、175°Cでの3時間の加熱、γ照射、またはトリトンX-100処理によって行うことができます。ただし、これらの手順はEV16,17の破壊につながります。
提示されたプロトコルは、単球に対するEVの影響に関する以前の研究とは異なり、EV中のエンドトキシン不純物の回避に焦点を当てた先駆的な研究です9。 提案された原則を実験室診療に適用することは、信頼できる研究結果を得るのに役立つ可能性があり、これは、診療所での治療薬としてのEVの潜在的な使用を検討する際に重要になる可能性があります12。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

細胞外小胞(EV)は、 in vitro および in vivoで細胞によって放出される膜小胞の不均一な集団です。それらの遍在と生物学的情報のキャリアとしての重要な役割は、それらを興味深い研究対象にし、それらの分離のために信頼できる反復的なプロトコルを必要とします。しかし、彼らの研究に関連する多くの技術的障害(適切な取得など)がまだあるため、それらの可能性を最大限に引き出すことは困難です。この研究は、差動遠心分離に基づいて腫瘍細胞株の培養上清から小型EVを単離するためのプロトコル(MISEV 2018命名法による)を提示します。このプロトコルには、EVの隔離中にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。EVのエンドトキシン汚染は、その後の実験を著しく妨げたり、真の生物学的効果を覆い隠したりすることさえあります。一方、見落とされたエンドトキシンの存在は、誤った結論につながる可能性があります。単球はエンドトキシン残基に特に敏感な集団を構成するため、単球を含む免疫系の細胞に言及する場合、これは特に重要です。したがって、特に単球、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞、樹状細胞などのエンドトキシン感受性細胞を扱う場合は、エンドトキシン汚染についてEVをスクリーニングすることを強くお勧めします。

このプロトコルの前提条件または必須のステップは、試薬からエンドトキシン汚染の可能性を排除することです。FBS、DMEM、RPMI、PBS、さらには超遠心チューブなど、使用するすべての試薬は、エンドトキシンフリー(<0.005 EU/mL)でなければなりません。エンドトキシン汚染のない体制を維持することは容易ではなく、例えば、細胞培養用の通常/標準血清がその豊富な供給源(0.364 EU/mL; 表1</s...

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Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

提案されたプロトコルには、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインが含まれています。

がん細胞株由来の低エンドトキシン含量細胞外小胞の単離

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

このプロトコルは、細胞培養上清から細胞外小胞を単離する際にエンドトキシンによる汚染を回避する方法と、それらを適切に評価する方法に関するガイドラインを提供します。このプロトコルの主な利点は、EVに関係するすべてのラボが、無菌手順を維持し、シンプルで広く利用可能な機器を使用することにより、エンドトキシン汚染を制限できることです。この技術を初めて試す人は誰でも、低エンドトキシンで非発熱性ラベルの付いた新しい培地、試薬、プラスチック製品から始める必要があります。このプロトコルでは、エンドトキシンフリー試薬、水、培地、ろ過PBS、超低エンドトキシンFBS、および超遠心チューブを使用します。まず、以前に培養したSW480およびSW620細胞株の上清を、適切に標識された15ミリリットルのチューブに集めます。上清を500 x gで室温で5分間遠心分離することにより、細胞破片を除去します。破片を乱すことなく、上清を新しいラベル付きチューブに集め、摂氏4度で12分間3, 200 x gで遠心分離します。チューブの端を濡らさずに、45ミリリットルの上清を垂直に配置された滅菌50ミリリットルのチューブに慎重に移します。チューブのキャップを滅菌済みの透明なフィルムで包み、摂氏マイナス80度で垂直に保管して、細胞外小胞を分離します。約90ミリリットルの上清を含む0.22マイクロメートルのシリンジフィルター、シリンジ、およびチューブを準備することから分離を開始します。シリンジに上清を入れ、フィルターをニードルアダプターに固定します。上清をフィルターを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。7ミリリットルのろ液を調製した超遠心チューブにピペットで入れ、摂氏4度で2時間100, 000 x gで遠心分離します。滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄します。長いろ過ピペットチップを使用して、ペレットを超遠心チューブに引き込みます。7ミリリットルのろ過されたエンドトキシンフリーPBSを加えて、細胞外小胞を洗い流します。超遠心後、滅菌パスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを200マイクロリットルのエンドトキシンフリーPBSに再懸濁します。懸濁液を滅菌済みの1.5ミリリットルの低タンパク質結合試験管に移します。次に、10マイクロリットルの懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移してさらに分析します。チューブのキャップを包み、マイナス80°Cで保管してください。次に、新しいチューブに入れ、ろ過されたPBSを使用して1マイクロリットルの懸濁液を1〜1000の比率で希釈し、ナノ粒子追跡分析を行います。ブロッティング分析を行うには、まず20マイクログラムのサンプルをローディングバッファーと混合します。サンプルを摂氏70度で10分間インキュベートします。次に、SDSを含む10〜14%ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに20マイクログラムのサンプルをロードし、ランニングバッファーを使用して150ボルトで45分間電気泳動を実行します。次に、ゲルをトウビン緩衝液を含む転写機に入れ、ポリビニリデンジフルオリド膜上にタンパク質を25ボルトで1時間セミドライ転写する。メンブレンをロッカーで1時間インキュベートすることにより、1%BSAでブロックします。BSA希釈抗体、抗CD9または抗Alixをメンブレンに加え、ロッカー上で摂氏4度で一晩インキュベートします。抗体を除去した後、膜を10ミリリットルのTBSTで10分間3回洗浄する。次に、ヤギ抗ウサギまたは抗マウス二次抗体を加え、ロッカー上で室温で1時間インキュベートします。抗体を廃棄し、前述のようにメンブレンを洗浄します。基質とルミノールを含む1ミリリットルの溶液を同じ比率で膜に注ぎます。すぐにメンブレンをイメージングシステムに入れ、タンパク質バンドをスクリーン上で可視化します。本研究では、ウェスタンブロット分析により、CD9とAlixの2つの細胞外小胞マーカーの存在が確認されました。SW480とSW620の両方から単離された小胞の平均サイズと濃度は類似していた。異なる用量のリポ多糖(LPS)による単球の刺激は、単球におけるインターロイキン10および腫瘍壊死因子の分泌を可能にするLPSの最低用量を示し、ミリリットルあたり50ピコグラムであった。発色LAL試験では、細胞外小胞のLPS汚染は、両方の細胞株でミリリットルあたり約50ピコグラムであることが示されました。覚えておくべき最も重要なことは、LPSフリーまたは枯渇した試薬の使用、および手順の各ステップでの定期的なLPS測定です。エンドトキシン汚染を防ぐことは、それを排除するよりも簡単です。提案されたプロトコルは、エンドトキシンによるEVの汚染による誤った結果の可能性を制限し、細胞あたりのEV活性を評価することを可能にします。提案されたプロトコルは、単球、樹状細胞、マクロファージなどのエンドトキシン感受性細胞を扱う研究者にとって有用です。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

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から胸腺リンパ腫のT細胞株の導出 ATM - / -</supと p53の - / -</supマウス

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免疫・感染学

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Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

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Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...