Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
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이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(National Science Centre)의 보조금 번호 2019/33/B/NZ5/00647의 지원을 받았습니다. EV에서 박테리아 DNA를 검출하는 데 귀중한 도움을 주신 Jagiellonian University Medical College의 분자 의료 미생물학과의 Tomasz Gosiewski 교수와 Agnieszka Krawczyk 교수에게 감사드립니다.

1. 초원심분리기 튜브의 제조
<ol><li>멸균된 일회용 튜브를 사용하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 멸균 파스퇴르 피펫 또는 기타 일회용 애플리케이터를 사용하여 세제로 세척한 후 초원심분리기 튜브를 재사용하십시오. 초원심분리기 튜브는 한 가지 유형의 원심분리 물질(세포 배양 상청액/혈청/혈장)과 종(인간/마우스 등) 전용이어야 합니다.</li>
	<li>세제 세척 후 초원심분리기...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

지난 몇 년 동안, 적절한 전기차 분리를 위한 방법들이 점점 더 중요해졌으며, 예를 들어, 신뢰할 수 있는 오믹스 및 기능 데이터를 얻는 맥락에서 더욱 신뢰할 수 있는 분석이 가능해졌다24. 이전 연구 경험에 비추어 볼 때, 격리 방법의 유형뿐만 아니라이 절차 중 다른 조건도 중요 할 수 있습니다. EV-고갈 FBS의 사용은 필요성으로 널리 인식되고 있다25,26</sup...

MISEV 2018 명명법에 따르면 세포외 소포(EV)는 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 분비 막낭의 다양한 하위 유형을 설명하는 집합적인 용어입니다 1,2. 또한 EV는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커, 치료제 및 약물 전달 수단으로서의 가능성을 보여줍니다. 그러나 인수와 관련된 기술적 장애물이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다3. 이러한 과제 중 하나는 많은 경우 무시되어 온 내독소가 없는 EV의 분리입니다. 가장 흔한 내독소 중 하나는 지질다당류(LPS)로, 그람 음성 박테리아 세포벽의 주요 구성 요소이며 다양한 세포에 의한 많은 수의 염증성 사이토카인의 방출로 인해 급성 염증 반응을 일으킬 수 있습니다 4,5. LPS는 LPS 결합 단백질에 결합한 후 골수 세포에서 CD14/TLR4/MD2 복합체와 상호작용하여 반응을 유도합니다. 이 상호 작용은 MyD88 및 TRIF 의존성 신호 전달 경로의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 핵 인자 카파 B(NFkB)를 유발합니다. NFkB의 핵으로의 전좌는 사이토카인의 생산을 개시한다6. 단핵구와 대식세포는 LPS에 매우 민감하며 LPS에 노출되면 염증성 사이토카인과 케모카인(예: IL-6, IL-12, CXCL8 및 TNF-α)이 방출됩니다7,8. CD14 구조는 유사한 친화도를 갖는 상이한 LPS 종의 결합을 가능하게 하고, 다른 톨-유사 수용체 (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 및 9)에 대한 공동-수용체로서 작용한다6. 단핵구/대식세포에 대한 EV의 영향에 대한 연구의 수는 여전히 증가하고 있습니다 9,10,11. 특히 단핵구, 그 하위 집단 및 기타 면역 세포의 기능을 연구하는 관점에서 볼 때, 내독소의 존재와 EV에서 가려진 존재는 매우 중요합니다12. 내독소로 인한 EV의 간과된 오염은 오해의 소지가 있는 결론으로 이어지고 진정한 생물학적 활성을 숨길 수 있습니다. 즉, 단핵구 세포로 작업하려면 내독소 오염이 없다는 확신이 필요합니다13. 내독소의 잠재적 공급원은 물, 상업적으로 입수된 배지 및 혈청, 배지 성분 및 첨가제, 실험실 유리 제품 및 플라스틱 제품일 수 있다 5,14,15.
따라서 본 연구는 저내독소 함유 EV의 분리를 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이 프로토콜은 EV에서 내독소를 제거하는 대신 EV 격리 중에 내독소 오염을 피하는 방법에 대한 간단한 힌트를 제공합니다. 이전에는 예를 들어 나노 의학에 사용되는 조작 된 나노 입자에서 내 독소를 제거하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 제시되었습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 EV와 같은 생물학적 구조에 유용하지 않습니다. 나노 입자의 효과적인 발열원 제거는 에탄올 또는 아세트산 헹굼, 175 °C에서 3 시간 동안 가열, γ 조사 또는 트리톤 X-100 처리에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차는 EV16,17의 파괴로 이어집니다.
제시된 프로토콜은 단핵구에 대한 EV의 효과에 대한 이전 연구와 달리 EV의 내독소 불순물을 피하는 데 초점을 맞춘 선구적인 연구입니다9. 제안된 원리를 실험실 실습에 적용하면 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 클리닉에서 치료제로서 EV의 잠재적 사용을 고려할 때 중요할 수 있다12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

세포외 소포(EV)는 시험관 내 및 생체 내 세포에서 방출되는 이질적인 막 소포 집단입니다. 그들의 편재성과 생물학적 정보의 운반자로서의 중요한 역할은 그들을 흥미로운 연구 대상으로 만들고 분리를 위해 신뢰할 수 있고 반복적인 프로토콜이 필요합니다. 그러나 연구와 관련된 많은 기술적 장애물(예: 적절한 획득)이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다. 이 연구는 차등 원심분리를 기반으로 하는 종양 세포주의 배양 상층액에서 소형 EV(MISEV 2018 명명법에 따름)를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 EV를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. EV의 내독소 오염은 후속 실험을 크게 방해하거나 실제 생물학적 효과를 가릴 수도 있습니다. 반면에, 내 독소의 간과 된 존재는 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이것은 단핵구를 포함한 면역계의 세포를 언급 할 때 특히 중요한데, 이는 단핵구가 내 독소 잔기에 특히 민감한 집단을 구성하기 때문입니다. 따라서 특히 단핵구, 대식세포, 골수 유래 억제 세포 또는 수지상 세포와 같은 내독소에 민감한 세포로 작업할 때 EV의 내독소 오염을 스크리닝하는 것이 좋습니다.

이 프로토콜의 전제 조건 또는 필수 단계는 시약에서 가능한 내독소 오염을 배제하는 것입니다. FBS, DMEM, RPMI, PBS 및 초원심분리기 튜브와 같이 사용되는 모든 시약은 내독소가 없어야 합니다(<0.005 EU/mL). 예를 들어, 세포 배양을 위한 일반/표준 혈청이 풍부한 공급원이 될 수 있기 때문에 내독소 오염이 없는 체계를 유지하는 것은 쉽지 않습니다(0.364 EU/mL, 표 1 참조).
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Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

이 프로토콜은 세포 배양 상층액에서 세포외 소포체를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 EV와 관련된 모든 실험실이 무균 절차를 유지하고 간단하고 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 내독소 오염을 제한할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 처음 시도하는 모든 사람은 내독소가 적고 발열성이 없는 표지가 된 새로운 배지, 시약 및 플라스틱 제품으로 시작해야 합니다.이 프로토콜의 경우 내독소가 없는 시약, 물, 배양 배지, 여과된 PBS, 초저내독소 FBS 및 초원심분리기 튜브를 사용합니다. 시작하려면 이전에 배양된 SW480 및 SW620 세포주에서 상층액을 적절하게 표지된 15밀리리터 튜브에 수집합니다. 상층액을 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.파편을 방해하지 않고 상층액을 새 라벨이 붙은 튜브에 모으고 섭씨 4도에서 12 분 동안 3, 200 x g에서 원심 분리합니다. 튜브의 가장자리를 적시지 않고 45 밀리리터의 상청액을 수직으로 배치 된 멸균 50 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 섭씨 영하 80도에서 수직으로 보관하여 세포외 소포를 분리합니다.약 90ml의 상층액이 들어 있는 0.22마이크로미터 주사기 필터, 주사기 및 튜브를 준비하여 분리를 시작합니다. 주사기에 상청액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 고정하십시오. 필터를 통해 상청액을 50 밀리리터 튜브로 여과합니다.여과액 7 밀리리터를 준비된 초원심분리 튜브에 피펫팅하고, 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000 x g에서 원심분리한다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 긴 여과된 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 초원심분리기 튜브로 당깁니다.7밀리리터의 여과된 내독소가 없는 PBS를 추가하여 세포외 소포를 헹굽니다. 초원심분리 후, 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 200마이크로리터의 내독소가 없는 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 현탁액을 멸균된 1.5밀리리터 저단백질 결합 시험관으로 옮깁니다.그런 다음 추가 분석을 위해 10마이크로리터의 현탁액을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브의 캡을 감싸고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 새로운 튜브에 나노 입자 추적 분석을 위해 여과 된 PBS를 사용하여 1 : 1000의 비율로 1 마이크로 리터의 현탁액을 희석합니다.블로팅 분석을 수행하려면 먼저 20마이크로그램의 샘플을 로딩 버퍼와 혼합합니다. 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 20마이크로그램의 샘플을 SDS가 포함된 10-14% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 로드하고 완충액을 사용하여 150볼트에서 45분 동안 전기영동을 수행합니다.다음으로, Towbin 완충액이 있는 이송 기계에 겔을 넣고 1시간 동안 25볼트에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 상에 단백질의 반건조 전사를 수행합니다. 멤브레인을 1%BSA로 차단하여 로커에서 1시간 동안 배양합니다. BSA 희석 항체인 항-CD9 또는 항-알릭스를 멤브레인에 넣고 로커에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.항체를 제거한 후, 10 분 동안 10 밀리리터의 TBST로 멤브레인을 3 회 세척한다. 이제 염소 항 토끼 또는 항 마우스 2 차 항체를 넣고 실온에서 1 시간 동안 로커에서 다시 배양하십시오. 항체를 버리고 이전에 시연된 대로 멤브레인을 세척합니다.기질과 루미놀을 함유한 용액 1밀리리터를 멤브레인에 같은 비율로 붓습니다. 즉시 멤브레인을 이미징 시스템에 배치하고 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다. 본 연구에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 두 개의 세포외 소포 마커인 CD9와 Alix의 존재가 확인되었습니다.SW480과 SW620 모두에서 분리된 소포의 평균 크기와 농도는 비슷했습니다. 다른 용량의 지질다당류(LPS)로 단핵구를 자극한 결과 인터루킨 10의 분비를 가능하게 하는 LPS의 최저 용량과 단핵구의 종양 괴사 인자는 밀리리터당 50피코그램이었습니다. 발색 LAL 테스트는 세포외 소포의 LPS 오염이 두 세포주 모두에서 밀리리터당 약 50피코그램임을 나타냅니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 LPS가 없거나 고갈된 시약을 사용하고 절차의 각 단계에서 일상적인 LPS 측정입니다. 내독소 오염을 예방하는 것이 제거하는 것보다 쉽습니다. 제안된 프로토콜은 내독소에 의한 EV의 오염으로 인한 잘못된 결과의 가능성을 제한하고 세포당 EV 활성을 평가할 수 있도록 합니다.제안된 프로토콜은 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포와 같은 내독소에 민감한 세포를 다루는 연구자에게 유용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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연구

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

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세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

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One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

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철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...