Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia, número de bolsa 2019/33/B/NZ5/00647. Gostaríamos de agradecer ao Professor Tomasz Gosiewski e Agnieszka Krawczyk do Departamento de Microbiologia Médica Molecular, Faculdade de Medicina da Universidade Jaguelônica por sua inestimável ajuda na detecção de DNA bacteriano em EVs.

1. Preparação de tubos de ultracentrífuga
<ol><li>Use tubos estéreis de uso único. Se isso não for possível, reutilize os tubos ultracentrífugos depois de lavá-los com detergente usando uma pipeta Pasteur estéril ou outros aplicadores de uso único. Lembre-se que os tubos de ultracentrífuga devem ser dedicados a um tipo de material centrifugado (sobrenadante de cultura celular/soro/plasma) e espécie (humano/camundongo/etc.).</li>
	<li>Após uma lavagem com detergente, enxágue os tubos ultr...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

Nos últimos anos, métodos para o isolamento adequado dos EVs têm se tornado cada vez mais importantes, possibilitando suas análises mais confiáveis, por exemplo, no contexto da obtenção de dados ômicos e funcionais confiáveis24. Com base na experiência de pesquisa prévia, parece que não só o tipo de método de isolamento, mas também outras condições durante este procedimento podem ser importantes. O uso de SFB com DEPLEÇÃO de EV é amplamente reconhecido como uma necessidade<sup ...

Vesículas extracelulares (EVs), de acordo com a nomenclatura MISEV 2018, são um termo coletivo que descreve vários subtipos de vesículas membranosas secretadas por células que desempenham papéis cruciais em inúmeros processos fisiológicos e patológicos 1,2. Além disso, os EVs mostram-se promissores como novos biomarcadores para várias doenças, bem como agentes terapêuticos e veículos de liberação de medicamentos. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua aquisição3. Um desses desafios é o isolamento de EVs livres de endotoxinas, que tem sido negligenciado em muitos casos. Uma das endotoxinas mais comuns é o lipopolissacarídeo (LPS), que é um dos principais componentes da parede celular de bactérias gram-negativas e pode causar uma resposta inflamatória aguda, devido à liberação de um grande número de citocinas inflamatórias por várias células 4,5. O LPS induz uma resposta por ligação à proteína ligadora do LPS, seguida de interação com o complexo CD14/TLR4/MD2 em células mieloides. Essa interação leva à ativação das vias de sinalização dependentes de MyD88 e TRIF, que por sua vez desencadeiam o fator nuclear kappa B (NFkB). A translocação do NFkB para o núcleo inicia a produção de citocinas6. Monócitos e macrófagos são altamente sensíveis ao LPS, e sua exposição ao LPS resulta em uma liberação de citocinas inflamatórias e quimiocinas (por exemplo, IL-6, IL-12, CXCL8 e TNF-α)7,8. A estrutura CD14 permite a ligação de diferentes espécies de LPS com afinidade semelhante e serve como co-receptor para outros receptores toll-like (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 e 9)6. O número de estudos sendo conduzidos sobre os efeitos dos EVs em monócitos/macrófagos ainda está aumentando 9,10,11. Especialmente do ponto de vista do estudo das funções dos monócitos, suas subpopulações e outras células imunes, a presença de endotoxina e mesmo sua presença mascarada em EVs é de grande importância12. A contaminação negligenciada de EVs com endotoxinas pode levar a conclusões enganosas e ocultar sua verdadeira atividade biológica. Em outras palavras, trabalhar com células monocíticas requer confiança na ausência de contaminação por endotoxinas13. Fontes potenciais de endotoxinas podem ser água, meios e soros obtidos comercialmente, componentes e aditivos de meios, vidraria de laboratório e plasticware 5,14,15.
Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo para o isolamento de EVs com baixo teor de endotoxinas. O protocolo fornece dicas simples sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs em vez de remover endotoxinas de EVs. Anteriormente, muitos protocolos foram apresentados sobre como remover endotoxinas de, por exemplo, nanopartículas projetadas usadas em nanomedicina; no entanto, nenhum deles é útil para estruturas biológicas como EVs. A despirogenação efetiva das nanopartículas pode ser realizada por enxágue com etanol ou ácido acético, aquecimento a 175 °C por 3 h, irradiação γ ou tratamento com triton X-100; entretanto, esses procedimentos levam à destruição dos EVs16,17.
O protocolo apresentado é um estudo pioneiro focado em evitar impurezas de endotoxinas em EVs, ao contrário de estudos anteriores sobre o efeito de EVs em monócitos9. A aplicação dos princípios propostos à prática laboratorial pode auxiliar na obtenção de resultados confiáveis de pesquisa, o que pode ser crucial quando se considera o potencial uso dos EVs como agentes terapêuticos na clínica12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Vesículas extracelulares (EVs) são uma população heterogênea de vesículas de membrana liberadas por células in vitro e in vivo. Sua onipresença e seu significativo papel como portadores de informações biológicas os tornam objetos de estudo intrigantes, exigindo protocolos confiáveis e repetitivos para seu isolamento. No entanto, realizar todo o seu potencial é difícil, pois ainda existem muitos obstáculos técnicos relacionados à sua pesquisa (como a aquisição adequada). Este estudo apresenta um protocolo para o isolamento de pequenos EVs (de acordo com a nomenclatura MISEV 2018) a partir do sobrenadante de cultura de linhagens de células tumorais baseado em centrifugação diferencial. O protocolo inclui orientações sobre como evitar a contaminação por endotoxinas durante o isolamento de EVs e como avaliá-los adequadamente. A contaminação por endotoxinas de EVs pode dificultar significativamente experimentos subsequentes ou mesmo mascarar seus verdadeiros efeitos biológicos. Por outro lado, a presença negligenciada de endotoxinas pode levar a conclusões incorretas. Isso é de particular importância quando se refere a células do sistema imunológico, incluindo monócitos, porque os monócitos constituem uma população especialmente sensível a resíduos de endotoxinas. Portanto, é altamente recomendável rastrear EVs para contaminação por endotoxinas, especialmente quando se trabalha com células sensíveis à endotoxina, como monócitos, macrófagos, células supressoras derivadas do mielóide ou células dendríticas.

Um pré-requisito ou etapa obrigatória para este protocolo é a exclusão de possível contaminação por endotoxinas de reagentes. Todos os reagentes utilizados, como FBS, DMEM, RPMI, PBS e até mesmo tubos de ultracentrífuga, devem ser isentos de endotoxinas (<0,005 EU/mL). Manter o regime de ausência de contaminação por endotoxinas não é fácil, pois, por exemplo, o soro regular/padrão para cultura celular pode ser sua rica fonte (0,364 EU/mL; ver Tabela 1).
Embora ...

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Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

O protocolo proposto inclui diretrizes sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente.

Isolamento de Vesículas Extracelulares de Baixo Conteúdo de Endotoxinas Derivadas de Linhagens Celulares Cancerígenas

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Este protocolo fornece orientações sobre como evitar a contaminação com endotoxina durante o isolamento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultura celular e como avaliá-las adequadamente. A principal vantagem deste protocolo é que todo laboratório preocupado com EVs pode limitar a contaminação por endotoxinas mantendo um procedimento asséptico e usando equipamentos simples e amplamente disponíveis. Todo mundo que está tentando esta técnica pela primeira vez deve começar com novos meios, reagentes e plasticware que são de baixa endotoxina, não pirogênicos rotulados.Para este protocolo, utilizar reagentes livres de endotoxinas, água, meios de cultura, PBS filtrado, SFB ultra baixa endotoxina e tubos de ultracentrífuga. Para começar, colete o sobrenadante de linhagens celulares SW480 e SW620 previamente cultivadas em tubos de 15 mililitros devidamente marcados. Remova os restos celulares centrifugando o sobrenadante a 500 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Sem perturbar os detritos, colete o sobrenadante em um novo tubo marcado e centrifugue a 3.200 x g por 12 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente 45 mililitros do sobrenadante para um tubo estéril de 50 mililitros colocado verticalmente, sem molhar as bordas do tubo. Embrulhe a tampa do tubo com um filme estéril e transparente e armazene-o verticalmente a 80 graus Celsius negativos para posterior isolamento das vesículas extracelulares.Comece o isolamento preparando filtros de seringas, seringas e tubos de 0,22 micrômetros contendo aproximadamente 90 mililitros de sobrenadante. Encha uma seringa com o sobrenadante e fixe o filtro no adaptador da agulha. Filtre o sobrenadante através do filtro em um tubo de 50 mililitros.Pipetar sete mililitros do filtrado para um tubo de ultracentrífuga preparado e centrifugar a 100.000 x g por duas horas a quatro graus Celsius. Use uma pipeta Pasteur estéril para descartar o sobrenadante. Puxe os pellets para dentro de um tubo de ultracentrífuga usando uma ponta de pipeta longa filtrada.Enxaguar as vesículas extracelulares adicionando sete mililitros de PBS livre de endotoxina filtrada. Após a ultracentrifugação, descartar o sobrenadante com pipeta Pasteur estéril e ressuspender o pellet em 200 microlitros de PBS livre de endotoxina. Transfira a suspensão para um tubo de ensaio estéril de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas.Em seguida, transfira 10 microlitros de suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro para análise posterior. Embrulhe a tampa do tubo e guarde-a a 80 graus Celsius negativos. Agora, em um novo tubo, dilua um microlitro de suspensão usando PBS filtrado na proporção de 1 para 1000 para análise de rastreamento de nanopartículas.Para realizar a análise de blotting, primeiro misture 20 microgramas das amostras com um tampão de carga. Incubar as amostras a 70 graus Celsius durante 10 minutos. Em seguida, carregar 20 microgramas da amostra em cada poço de um gel de poliacrilamida de 10 a 14% com SDS e realizar eletroforese por 45 minutos a 150 volts, com tampão de funcionamento.Em seguida, coloque o gel em uma máquina de transferência com tampão Towbin e realize uma transferência semi-seca de proteínas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno a 25 volts por uma hora. Bloqueie a membrana com 1% de BSA incubando-a por uma hora em um balancim. Adicione anticorpos diluídos BSA, anti-CD9 ou anti-Alix, à membrana e incube durante a noite a quatro graus Celsius em um balancim.Após a remoção dos anticorpos, lave a membrana três vezes com 10 mililitros de TBST por 10 minutos. Agora adicione o anticorpo secundário de cabra anti-coelho ou anti-camundongo e incube novamente em um balancim por uma hora à temperatura ambiente. Descarte o anticorpo e lave a membrana conforme demonstrado anteriormente.Deite um mililitro da solução contendo substrato e luminol numa proporção igual sobre a membrana. Coloque imediatamente a membrana em um sistema de imagem e visualize as bandas de proteína na tela. No presente estudo, a análise por western blot confirmou a presença de dois marcadores de vesícula extracelular, CD9 e Alix.O tamanho médio e as concentrações das vesículas isoladas de SW480 e SW620 foram semelhantes. A estimulação de monócitos com diferentes doses de lipopolissacarídeo, ou LPS, mostrou que a menor dose de LPS permitiu a secreção de interleucina 10 e o fator de necrose tumoral em monócitos foi de 50 picogramas por mililitro. O teste de LAL cromogênico indicou que a contaminação por LPS das vesículas extracelulares foi de cerca de 50 picogramas por mililitro para ambas as linhagens celulares.A coisa mais importante a lembrar é o uso de reagentes livres ou esgotados de LPS e a medição rotineira de LPS em cada etapa do procedimento. Prevenir a contaminação por endotoxinas é mais fácil do que eliminá-la. O protocolo proposto limita a possibilidade de falsos resultados devido à contaminação dos EVs com endotoxina e permite avaliar a atividade dos EVs por célula.O protocolo proposto é útil para pesquisadores que trabalham com células sensíveis a endotoxinas, como monócitos, células dendríticas e macrófagos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

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Imunologia e Infecção

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

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Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

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Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

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Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolamento das vesículas extracelulares de fluido broncoalveolar murino, usando uma técnica de centrifugação de ultrafiltração

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Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

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