Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша, грант No 2019/33/B/NZ5/00647. Мы хотели бы поблагодарить профессора Томаша Госевского и Агнешку Кравчик с кафедры молекулярной медицинской микробиологии Медицинского колледжа Ягеллонского университета за их неоценимую помощь в обнаружении бактериальной ДНК в EV.

1. Подготовка ультрацентрифужных пробирок
<ol><li>Используйте стерильные одноразовые пробирки. Если это невозможно, повторно используйте ультрацентрифужные пробирки после их мытья моющим средством с помощью стерильной пастеровской пипетки или других одноразовых аппликаторо?...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

В последние несколько лет все большее значение приобретают методы надлежащей изоляции электромобилей, позволяющие проводить их дальнейший надежный анализ, например, в контексте получения надежных омиксных и функциональных данных24. Основываясь на предыдущем опыте иссле?...

Внеклеточные везикулы (ВВ), согласно номенклатуре MISEV 2018, являются собирательным термином, описывающим различные подтипы секретируемых клетками мембранных везикул, которые играют решающую роль в многочисленных физиологических и патологических процессах 1,2. Кроме того, электромобили обещают стать новыми биомаркерами различных заболеваний, а также терапевтическими агентами и средствами доставки лекарств. Однако реализовать весь их потенциал сложно, так как все еще существует множество технических препятствий, связанных с их приобретением3. Одной из таких проблем является выделение электромобилей, не содержащих эндотоксинов, которым во многих случаях пренебрегают. Одним из наиболее распространенных эндотоксинов является липополисахарид (ЛПС), который является основным компонентом грамотрицательных бактериальных клеточных стенок и может вызывать острую воспалительную реакцию из-за высвобождения различными клетками большого количества воспалительных цитокинов 4,5. ЛПС индуцирует реакцию путем связывания с ЛПС-связывающим белком с последующим взаимодействием с комплексом CD14/TLR4/MD2 на миелоидных клетках. Это взаимодействие приводит к активации MyD88- и TRIF-зависимых сигнальных путей, что, в свою очередь, запускает ядерный фактор каппа В (NFkB). Транслокация NFkB в ядро инициирует продукцию цитокинов6. Моноциты и макрофаги очень чувствительны к ЛПС, и их воздействие на ЛПС приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и хемокинов (например, IL-6, IL-12, CXCL8 и TNF-α)7,8. Структура CD14 позволяет связывать различные виды ЛПС с одинаковым сродством и служит корецептором для других толл-подобных рецепторов (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 и 9)6. Количество исследований, проводимых о влиянии ЭВ на моноциты/макрофаги, все еще увеличивается 9,10,11. Особенно с точки зрения изучения функций моноцитов, их субпопуляций и других иммунных клеток большое значение имеет наличие эндотоксина и даже их замаскированное присутствие в ВВ12. Упущенное из виду загрязнение электромобилей эндотоксинами может привести к вводящим в заблуждение выводам и скрыть их истинную биологическую активность. Другими словами, работа с моноцитарными клетками требует уверенности в отсутствии загрязнения эндотоксинами13. Потенциальными источниками эндотоксинов могут быть вода, коммерчески получаемые среды и сыворотки, компоненты и добавки сред, лабораторная стеклянная посуда и пластмассовая посуда 5,14,15.
Таким образом, это исследование было направлено на разработку протокола выделения ВВ с низким содержанием эндотоксина. Протокол содержит простые подсказки о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время изоляции электромобилей вместо удаления эндотоксинов из электромобилей. Ранее было представлено множество протоколов о том, как удалять эндотоксины, например, из инженерных наночастиц, используемых в наномедицине; однако ни один из них не полезен для биологических структур, таких как электромобили. Эффективное депирогенирование наночастиц может быть осуществлено промывкой этанолом или уксусной кислотой, нагреванием при 175 °C в течение 3 ч, облучением γ или обработкой тритоном X-100; однако эти процедуры приводят к разрушению ЭВ16,17.
Представленный протокол является новаторским исследованием, направленным на предотвращение примесей эндотоксина в EV, в отличие от предыдущих исследований о влиянии EV на моноциты9. Применение предложенных принципов в лабораторной практике может помочь получить надежные результаты исследований, что может иметь решающее значение при рассмотрении потенциального использования ЭВ в качестве терапевтических агентов в клинике12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную популяцию мембранных везикул, высвобождаемых клетками in vitro и in vivo. Их вездесущность и значительная роль в качестве носителей биологической информации делают их интригующими объектами исследования, требующими надежных и повторяющихся протоколов для их выделения. Однако реализовать весь их потенциал сложно, поскольку все еще существует множество технических препятствий, связанных с их исследованиями (например, правильное приобретение). В данном исследовании представлен протокол выделения малых ЭВ (по номенклатуре MISEV 2018) из супернатанта культуры линий опухолевых клеток на основе дифференциального центрифугирования. Протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать загрязнения эндотоксинами во время выделения электромобилей и как правильно их оценивать. Загрязнение электромобилей эндотоксинами может значительно затруднить последующие эксперименты или даже замаскировать их истинные биологические эффекты. С другой стороны, упущенное из виду присутствие эндотоксинов может привести к неправильным выводам. Это имеет особое значение, когда речь идет о клетках иммунной системы, включая моноциты, потому что моноциты составляют популяцию, которая особенно чувствительна к остаткам эндотоксина. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить скрининг EV на загрязнение эндотоксинами, особенно при работе с чувствительными к эндотоксину клетками, такими как моноциты, макрофаги, клетки-супрессоры миелоидного происхождения или дендритные клетки.

Предпосылкой или обязательным этапом этого протокола является исключение возможного загрязнения эндотоксинами из реагентов. Все используемые реагенты, такие как FBS, DMEM, RPMI, PBS и даже ультрацентрифужные пробирки, должны не содержать эндотоксинов (<0,005 ЕС / мл). Поддерживать режим отсутств...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Предлагаемый протокол включает в себя рекомендации о том, как избежать контаминации эндотоксином при выделении внеклеточных везикул из надосадочных продуктов клеточных культур и как правильно их оценивать.

Выделение внеклеточных везикул с низким содержанием эндотоксинов, полученных из линий раковых клеток

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Этот протокол содержит рекомендации о том, как избежать загрязнения эндотоксином во время выделения внеклеточных везикул из надосадочных продуктов клеточных культур и как правильно их оценивать. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что каждая лаборатория, занимающаяся электромобилями, может ограничить загрязнение эндотоксинами, соблюдая асептическую процедуру и используя простое и широко доступное оборудование. Каждый, кто пробует эту технику впервые, должен начать с новых носителей, реагентов и пластиковой посуды с низким содержанием эндотоксинов, не имеющих пирогенной маркировки.Для этого протокола используйте реагенты, не содержащие эндотоксинов, воду, питательные среды, фильтрованные PBS, FBS со сверхнизким содержанием эндотоксина и ультрацентрифужные пробирки. Для начала соберите надосадочную жидкость из ранее культивируемых клеточных линий SW480 и SW620 в соответствующим образом помеченные 15-миллилитровые пробирки. Удалите клеточный мусор центрифугированием надосадочной жидкости при 500 x g в течение пяти минут при комнатной температуре.Не беспокоя мусор, соберите надосадочную жидкость в новую маркированную пробирку и центрифугу при 3 200 x g в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно перелейте 45 миллилитров надосадочной жидкости в вертикально расположенную стерильную 50-миллилитровую пробирку, не смачивая края пробирки. Оберните крышку пробирки стерильной прозрачной пленкой и храните ее вертикально при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей изоляции внеклеточных везикул.Начните изоляцию с подготовки шприцевых фильтров, шприцев и пробирок размером 0,22 микрометра, содержащих примерно 90 миллилитров надосадочной жидкости. Наполните шприц надосадочной жидкостью и закрепите фильтр на адаптере иглы. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр в 50-миллилитровую трубку.Пипеткой налейте семь миллилитров фильтрата в подготовленную ультрацентрифужную пробирку и центрифугу при 100 000 х г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Используйте стерильную пипетку Пастера, чтобы избавиться от надосадочной жидкости. Вытащите гранулы в ультрацентрифужную трубку с помощью длинного фильтрованного наконечника пипетки.Промойте внеклеточные везикулы, добавив семь миллилитров отфильтрованного PBS, не содержащего эндотоксинов. После ультрацентрифугирования выбросьте надосадочную жидкость с помощью стерильной пипетки Пастера и ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах PBS, не содержащего эндотоксинов. Перенесите суспензию в стерильную 1,5-миллилитровую пробирку с низким содержанием белка.Затем перелейте 10 микролитров суспензии в новую 1,5-миллилитровую пробирку для дальнейшего анализа. Оберните крышку тюбика и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Теперь в новую пробирку разбавьте один микролитр суспензии, используя отфильтрованный PBS в соотношении 1 к 1000 для анализа отслеживания наночастиц.Чтобы выполнить анализ блоттинга, сначала смешайте 20 мкг образцов с загрузочным буфером. Инкубируйте образцы при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем загрузите 20 мкг образца в каждую лунку 10-14% полиакриламидного геля с SDS и проведите электрофорез в течение 45 минут при напряжении 150 вольт с работающим буфером.Затем поместите гель в машину для переноса с буфером Towbin и выполните полусухой перенос белков на мембрану из поливинилидендифторида при напряжении 25 вольт в течение одного часа. Заблокируйте мембрану 1% BSA, инкубировав ее в течение одного часа на коромысле. Добавьте разбавленные BSA антитела, анти-CD9 или анти-Alix, к мембране и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия на коромысле.После удаления антител трижды промойте мембрану 10 миллилитрами TBST в течение 10 минут. Теперь добавьте вторичное антитело против кролика или мыши и снова инкубируйте на коромысле в течение одного часа при комнатной температуре. Выбросьте антитело и промойте мембрану, как показано ранее.Налейте на мембрану один миллилитр раствора, содержащего субстрат и люминол в равном соотношении. Немедленно поместите мембрану в систему визуализации и визуализируйте белковые полосы на экране. В настоящем исследовании анализ вестерн-блоттинга подтвердил наличие двух внеклеточных маркеров везикул, CD9 и Alix.Средний размер и концентрации везикул, выделенных как из SW480, так и из SW620, были одинаковыми. Стимуляция моноцитов различными дозами липополисахарида, или ЛПС, показала, что самая низкая доза ЛПС, обеспечивающая секрецию интерлейкина 10, а фактор некроза опухоли в моноцитах составлял 50 пикограмм на миллилитр. Хромогенный тест LAL показал, что загрязнение ЛПС внеклеточных везикул составляло около 50 пикограмм на миллилитр для обеих клеточных линий.Самое важное, что нужно помнить, - это использование реагентов, не содержащих ЛПС или обедненных реагентов, а также регулярное измерение ЛПС на каждом этапе процедуры. Предотвратить загрязнение эндотоксинами легче, чем устранить его. Предложенный протокол ограничивает возможность ложных результатов из-за контаминации ЭВ эндотоксином и позволяет оценить активность ВВ на клетку.Предлагаемый протокол полезен для исследователей, работающих с чувствительными к эндотоксину клетками, такими как моноциты, дендритные клетки и макрофаги.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Вывод тимуса лимфомы Т-клеточных линий из Atm - / -</sup И Р53 - / -</sup Мыши

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Создание вирусом Эпштейна-Барра роста трансформированных лимфобластоидных клеточных линий

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Выделение предшественника В-клеточных подмножеств из пуповинной крови

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Изоляция внеклеточного Vesicles из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости методом центрифугирования ультрафильтрации

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Очистка высокой урожайности Внеклеточных Препаратов Весикл вдали от вируса

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...