Name: isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Science Centre, Polen, bidragsnummer 2019/33/B/NZ5/00647. Vi vill tacka professor Tomasz Gosiewski och Agnieszka Krawczyk från Institutionen för molekylär medicinsk mikrobiologi, Jagiellonian University Medical College för deras ovärderliga hjälp med att upptäcka bakteriellt DNA i EV.

1. Beredning av ultracentrifugrör
<ol><li>Använd sterila engångsrör. Om detta inte är möjligt, återanvänd ultracentrifugrören efter att ha tvättat dem med ett tvättmedel med en steril Pasteur-pipett eller andra engångsapplikatorer. Kom ihåg att ultracentrifugrör bör vara avsedda för en typ av centrifugerat material (cellodlingssupernatant / serum / plasma) och art (människa / mus / etc.).</li>
	<li>Efter tvättmedel, skölj ultracentrifugrören med avjoniserat, LPS-fritt vatten 3x. ...

<ol>
	<li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>van Niel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+directions+in+studying+cell-cell+communication+by+extracellular+vesicles.">Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).</li><li>Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS+induced+inflammatory+responses+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+is+mediated+through+NOX4+and+Gi&#945;+dependent+PI-3+kinase+signalling.">LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Gi&#945; dependent PI-3 kinase signalling.</a> Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).</li><li>Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+endotoxin+contaminations+in+recombinant+proteins+are+sufficient+to+activate+human+CD1c++dendritic+cells.">Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells.</a> PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).</li><li>Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD14+in+host+protection+against+infections+and+in+metabolism+regulation.">Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).</li><li>Takashiba, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+monocytes+to+macrophages+primes+cells+for+lipopolysaccharide+stimulation+via+accumulation+of+cytoplasmic+nuclear+factor+kB.">Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).</li><li>Schwarz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activity+of+masked+endotoxin.">Biological activity of masked endotoxin.</a> Scientific Reports. 7, 44750 (2017).</li><li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-derived+extracellular+vesicles+activate+monocytes+and+are+associated+with+mortality+in+intensive+care+unit+patients.">Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients.</a> Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).</li><li>Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+monocyte-endothelial+cell+interactions+by+platelet+microparticles.">Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).</li><li>Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+(ectosomes)+shed+by+stored+human+platelets+downregulate+macrophages+and+modify+the+development+of+dendritic+cells.">Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells.</a> Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).</li><li>Soekmadji, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+Extracellular+Vesicles+as+Theranostics+-+an+ISEV+meeting+report.">The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).</li><li>Gioannini, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+endotoxin-MD-2+complex+that+produces+Toll-like+receptor+4-dependent+cell+activation+at+picomolar+concentrations.">Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).</li><li>Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics,+endotoxins,+and+the+Limulus+amebocyte+lysate+test.">Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test.</a> Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).</li><li>Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxins+in+culture+medium+for+human+in+vitro+fertilization.">Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization.</a> Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).</li><li>Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+EVs+-+How+temperature+affects+extracellular+vesicles.">Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+detergent+sensitivity+of+extracellular+vesicle+subpopulations.">Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).</li><li>Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinfection+and+sterilization+using+plasma+technology:+fundamentals+and+future+perspectives+for+biological+applications.">Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylene+oxide+gas+sterilization+of+medical+devices.">Ethylene oxide gas sterilization of medical devices.</a> Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Salamon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+iSeq+and+MiSeq+as+the+two+platforms+for+16S+rRNA+sequencing+in+the+study+of+the+gut+of+rat+microbiome.">Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).</li><li>Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-derived+microvesicles+modulate+biological+activity+of+human+monocytes.">Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes.</a> Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).</li><li>Chaiwut, R., Kasinrerk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+concentration+of+lipopolysaccharide+can+induce+the+production+of+various+cytokines+and+chemokines+in+human+primary+monocytes.">Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes.</a> BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).</li><li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling.">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Pham, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+extracellular+vesicles+contaminate+human+extracellular+vesicles+produced+in+cell+culture+conditioned+medium+when+'exosome-depleted+serum'+is+utilised.">Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).</li><li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+contamination:+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies.">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).</li><li>&#193;lvarez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+dynamics+model+to+predict+the+human+monocyte+response+to+endotoxins.">A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins.</a> Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).</li><li>Busatto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+filtration+for+highly+efficient+concentration+of+extracellular+vesicles+from+large+volumes+of+fluid.">Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid.</a> Cells. 7 (12), 273 (2018).</li><li>Ga&#322;uszka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+containing+particulate+matter+promotes+Th1+and+Th17+inflammatory+response+by+monocyte+activation+in+organic+and+inorganic+compounds+dependent+manner.">Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).</li><li>Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+polymyxins:+a+systematic+review+of+the+evidence+from+old+and+recent+studies.">Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies.</a> Critical Care. 10 (1), 27 (2006).</li><li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin+removal+from+protein+solutions.">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li></ol>

Under de senaste åren har metoder för korrekt isolering av elfordon blivit allt viktigare, vilket möjliggör ytterligare tillförlitliga analyser, till exempel i samband med att få tillförlitliga omics och funktionella data24. Baserat på tidigare forskningserfarenhet verkar det som att inte bara typen av isoleringsmetod utan även andra förhållanden under denna procedur kan vara viktiga. Användningen av EV-utarmad FBS är allmänt erkänd som en nödvändighet25,26...

Extracellulära vesiklar (EV), enligt MISEV 2018-nomenklaturen, är en kollektiv term som beskriver olika subtyper av cellutsöndrade membranösa vesiklar som spelar avgörande roller i många fysiologiska och patologiska processer 1,2. Dessutom visar elbilar lovande som nya biomarkörer för olika sjukdomar, liksom terapeutiska medel och läkemedelsleveransfordon. Att förverkliga sin fulla potential är dock svårt eftersom det fortfarande finns många tekniska hinder relaterade till deras förvärv3. En sådan utmaning är isoleringen av endotoxinfria elfordon, som i många fall har försummats. Ett av de vanligaste endotoxinerna är lipopolysackarid (LPS), som är en viktig komponent i gramnegativa bakteriecellväggar och kan orsaka ett akut inflammatoriskt svar på grund av frisättningen av ett stort antal inflammatoriska cytokiner av olika celler 4,5. LPS inducerar ett svar genom att binda till LPS-bindande protein, följt av interaktion med CD14 / TLR4 / MD2-komplexet på myeloida celler. Denna interaktion leder till aktivering av MyD88- och TRIF-beroende signalvägar, vilket i sin tur utlöser kärnfaktorn kappa B (NFkB). Translokation av NFkB till kärnan initierar produktionen av cytokiner6. Monocyter och makrofager är mycket känsliga för LPS, och deras exponering för LPS resulterar i frisättning av inflammatoriska cytokiner och kemokiner (t.ex. IL-6, IL-12, CXCL8 och TNF-α)7,8. CD14-strukturen möjliggör bindning av olika LPS-arter med liknande affinitet och fungerar som en co-receptor för andra tollliknande receptorer (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 och 9)6. Antalet studier som genomförs om effekterna av EV på monocyter / makrofager ökar fortfarande 9,10,11. Speciellt ur perspektivet att studera monocyternas funktioner, deras subpopulationer och andra immunceller är närvaron av endotoxin och till och med deras maskerade närvaro i EV av stor betydelse12. Den förbisedda kontamineringen av elfordon med endotoxiner kan leda till vilseledande slutsatser och dölja deras verkliga biologiska aktivitet. Med andra ord kräver arbete med monocytiska celler förtroende för frånvaro av endotoxinförorening13. Potentiella källor till endotoxiner kan vara vatten, kommersiellt erhållna medier och serum, mediekomponenter och tillsatser, laboratorieglas och plastvaror 5,14,15.
Därför syftade denna studie till att utveckla ett protokoll för isolering av låga endotoxinhaltiga EV. Protokollet ger enkla tips om hur man undviker endotoxinkontaminering under isolering av elbilar istället för att ta bort endotoxiner från elbilar. Tidigare har många protokoll presenterats om hur man tar bort endotoxiner från till exempel konstruerade nanopartiklar som används inom nanomedicin; Ingen av dem är dock användbara för biologiska strukturer som EV. Den effektiva depyrogeneringen av nanopartiklar kan utföras genom sköljning av etanol eller ättiksyra, uppvärmning vid 175 °C i 3 timmar, γ bestrålning eller triton X-100-behandling. Dessa förfaranden leder dock till förstörelse av elfordon16,17.
Det presenterade protokollet är en banbrytande studie som fokuserar på att undvika endotoxinföroreningar i elbilar, till skillnad från tidigare studier om effekten av elbilar på monocyter9. Att tillämpa föreslagna principer på laboratoriepraxis kan bidra till att få tillförlitliga forskningsresultat, vilket kan vara avgörande när man överväger den potentiella användningen av EV som terapeutiska medel i kliniken12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Alix (3A9) Mouse mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td>
			<td>GoogLab Scientific</td>
			<td>GBFT1250-R-NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometr</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELX800NB, Universal Microplate Reader</td>
			<td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin</td>
			<td>&#160;Biowest</td>
			<td>&#160;S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin, 50 mg/mL</td>
			<td>&#160;PAN &#8211; Biotech</td>
			<td>P06-13100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG- HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immun-Blot PVDF Membrane</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1620177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)</td>
			<td>&#160;Enzo Life Sciences, Inc.</td>
			<td>ALX-581-009-L002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>&#160;NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)</td>
			<td>&#160;Invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td>
			<td>EURx</td>
			<td>E3141-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A39552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP Oak Ridge Tube with sealing caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3929, 03613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>RPMI-1640 (Gibco)</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75000100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1704401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection(ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW480 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.22 um</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&#160;</td>
			<td>1703940</td>
			<td>Transfer machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette, 3.5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1171.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of low endotoxin content extracellular vesicles derived from cancer cell lines

Extracellulära vesiklar (EV) är en heterogen population av membranvesiklar som frigörs av celler in vitro och in vivo. Deras allestädes närvaro och betydande roll som bärare av biologisk information gör dem spännande studieobjekt, vilket kräver tillförlitliga och repetitiva protokoll för deras isolering. Att förverkliga sin fulla potential är dock svårt eftersom det fortfarande finns många tekniska hinder relaterade till deras forskning (som korrekt förvärv). Denna studie presenterar ett protokoll för isolering av små EV (enligt MISEV 2018-nomenklaturen) från odlingssupernatanten av tumörcellinjer baserat på differentiell centrifugering. Protokollet innehåller riktlinjer för hur man undviker kontaminering med endotoxiner under isolering av elfordon och hur man korrekt utvärderar dem. Endotoxinkontaminering av elfordon kan avsevärt hindra efterföljande experiment eller till och med maskera deras verkliga biologiska effekter. Å andra sidan kan den förbisedda närvaron av endotoxiner leda till felaktiga slutsatser. Detta är särskilt viktigt när man hänvisar till celler i immunsystemet, inklusive monocyter, eftersom monocyter utgör en population som är särskilt känslig för endotoxinrester. Därför rekommenderas det starkt att screena EV för endotoxinkontaminering, särskilt när man arbetar med endotoxinkänsliga celler såsom monocyter, makrofager, myeloid-härledda suppressorceller eller dendritiska celler.

Ett förutsättnings- eller obligatoriskt steg för detta protokoll är uteslutning av eventuell endotoxinkontaminering från reagens. Alla reagenser som används, såsom FBS, DMEM, RPMI, PBS och till och med ultracentrifugrör, måste vara endotoxinfria (<0,005 EU / ml). Det är inte lätt att upprätthålla systemet med ingen endotoxinkontaminering eftersom till exempel det vanliga/standardserumet för cellodling kan vara dess rika källa (0,364 EU/ml, se tabell 1).
Även om...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines at JoVE.com

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

Det föreslagna protokollet innehåller riktlinjer för hur man undviker kontaminering med endotoxin under isolering av extracellulära vesiklar från cellodlingssupernatanter och hur man korrekt utvärderar dem.

Isolering av extracellulära vesiklar med lågt endotoxininnehåll härrörande från cancercellinjer

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

Detta protokoll ger riktlinjer för hur man undviker kontaminering med endotoxin under isolering av extracellulära vesiklar från cellodlingssupernatanter och hur man korrekt utvärderar dem. Den största fördelen med detta protokoll är att varje laboratorium som sysslar med EV kan begränsa endotoxinkontaminering genom att hålla en aseptisk procedur och använda enkel och allmänt tillgänglig utrustning. Alla som försöker denna teknik för första gången bör börja med nya medier, reagenser och plastvaror som är lågendotoxin, icke-pyrogena märkta.För detta protokoll, använd endotoxinfria reagens, vatten, odlingsmedia, filtrerad PBS, ultralåg endotoxin FBS och ultracentrifugrör. För att börja, samla supernatanten från tidigare odlade SW480- och SW620-cellinjer i lämpligt märkta 15-milliliterrör. Ta bort cellskräp genom att centrifugera supernatanten vid 500 x g i fem minuter vid rumstemperatur.Utan att störa skräpet, samla supernatanten i ett nytt märkt rör och centrifugera vid 3 200 x g i 12 minuter vid fyra grader Celsius. Överför försiktigt 45 ml av supernatanten till ett vertikalt placerat sterilt 50-milliliterrör utan att fukta rörets kanter. Linda rörets lock med en steril, transparent film och förvara den vertikalt vid minus 80 grader Celsius för efterföljande isolering av extracellulära vesiklar.Börja isoleringen genom att förbereda 0,22 mikrometer sprutfilter, sprutor och rör som innehåller cirka 90 ml supernatant. Fyll en spruta med supernatanten och fäst filtret på nåladaptern. Filtrera supernatanten genom filtret i ett 50 ml rör.Pipettera sju ml av filtratet i ett framställt ultracentrifugrör och centrifugera vid 100 000 x g i två timmar vid fyra grader Celsius. Använd en steril Pasteurpipett för att kasta supernatanten. Dra pelletsen i ett ultracentrifugrör med en lång filtrerad pipettspets.Skölj de extracellulära vesiklarna genom att tillsätta sju milliliter filtrerad endotoxinfri PBS. Efter ultracentrifugering, kassera supernatanten med en steril Pasteurpipett och återsuspendera pelleten i 200 mikroliter endotoxinfri PBS. Överför suspensionen till ett sterilt 1,5 ml lågproteinbindande provrör.Överför sedan 10 mikroliter suspension till ett nytt 1,5 ml rör för vidare analys. Vik locket på röret och förvara det på minus 80 grader Celsius. Nu, i ett nytt rör, späd en mikroliter suspension med filtrerad PBS i förhållandet 1 till 1000 för nanopartikelspårningsanalys.För att utföra blottinganalys, blanda först 20 mikrogram av proverna med en laddningsbuffert. Inkubera proverna vid 70 grader Celsius i 10 minuter. Fyll sedan 20 mikrogram av provet i varje brunn av en 10 till 14% polyakrylamidgel med SDS och utför elektrofores i 45 minuter vid 150 volt, med löpande buffert.Placera sedan gelén i en överföringsmaskin med Towbin-buffert och utför en halvtorr överföring av proteiner till ett polyvinylidendifluoridmembran vid 25 volt i en timme. Blockera membranet med 1% BSA genom att inkubera det i en timme på en vippa. Tillsätt BSA-utspädda antikroppar, anti-CD9 eller anti-Alix, till membranet och inkubera över natten vid fyra grader Celsius på en vippa.Efter avlägsnande av antikropparna, tvätta membranet tre gånger med 10 ml TBST i 10 minuter. Lägg nu till get-anti-kanin eller anti-mus sekundär antikropp och inkubera igen på en vippa i en timme vid rumstemperatur. Kassera antikroppen och tvätta membranet som visats tidigare.Häll en milliliter av lösningen innehållande substrat och luminol i lika förhållande på membranet. Placera omedelbart membranet i ett bildsystem och visualisera proteinbanden på skärmen. I den aktuella studien bekräftade western blot-analys närvaron av två extracellulära vesikelmarkörer, CD9 och Alix.Medelstorleken och koncentrationerna av vesiklarna isolerade från både SW480 och SW620 var likartade. Stimulering av monocyter med olika doser av lipopolysackarid, eller LPS, visade att den lägsta dosen av LPS som möjliggjorde utsöndring av interleukin 10 och tumörnekrosfaktor i monocyter var 50 pikogram per milliliter. Det kromogena LAL-testet indikerade att LPS-kontaminering av de extracellulära vesiklarna var cirka 50 pikogram per milliliter för båda cellinjerna.Det viktigaste att komma ihåg är användningen av LPS-fria eller utarmade reagens och rutinmässig LPS-mätning vid varje steg i proceduren. Att förhindra endotoxinkontaminering är lättare än att eliminera det. Det föreslagna protokollet begränsar risken för falska resultat på grund av kontaminering av elfordon med endotoxin och gör det möjligt att bedöma elfordonens aktivitet per cell.Det föreslagna protokollet är användbart för forskare som arbetar med endotoxinkänsliga celler, som monocyter, dendritiska celler och makrofager.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Upprättande av Epstein-Barr virus Tillväxt-transformerade lymfoblastoida cell-linjer

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering och karakterisering av extracellulära blåsor från Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering av extracellulära blåsor från murina bronkoalveolär Lavage vätska med ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

Rening av högavkastande extracellulära vesikel preparat bort från virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolering och karaktärisering av extracellulära blåsor som produceras av Järnbegränsade mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...