Name: measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Arbejdet i Jaramillo-Lambert-laboratoriet støttes af National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alle C. elegans stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som finansieres af National Institutes of Health, P40 OD010440. Figur 1D blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.

BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af forsøgsplader
<ol><li>Tilbered petriskåle med en diameter på 35 mm med modificerede unge, kun Bacto-peptone (MYOB) medier. For at fremstille MYOB-plader tilsættes 20 g Bacto-agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCI, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto pepton og 1,6 ml kolesterol til 1 liter ddH2O og autoklave i 40 minutter ved 121 °C. Lad det køle af til 55 °C, og hæld 4 ml af det smeltede medie i hver 35 mm petriskål ved hjælp af steril teknik. BEMÆRK: En liter MYOB gør ~ 250 plader, som kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder. Vi anbefaler mindst 10 personer pr. replikat med tre replikate sæt for hver stamme.</li>
	<li>Brug steril teknik til at så pladerne med en lille plet (ca. 50 μL) OP50-bakterier i midten af pladen. BEMÆRK: Små græsplæner er især vigtige for vurdering af krydsbefrugtning, da den mindre plet fører til øgede møder mellem hanner og hermafroditter, hvilket øger chancen for parring.</li>
</ol>2. Embryonale levedygtighedsanalyser (hermafrodit selvbefrugtning)
<ol><li>Dag 1<ol><li>Mærk bagsiden af hver plade. Sørg for at holde styr på hver plade og deres respektive orme under hele eksperimentet. BEMÆRK: Foretrukken mærkningsteknik-Dag 1: orm 1, Dag 1: orm 2, ... osv.</li>
		<li>Overfør en individuel L4-trins hermafrodit til hver plade. Sørg for, at der ikke overføres embryoner eller andre orme til pladen. Lad ormene udvikle sig til voksne og læg selvafkom i 24 timer ved standarddyrkningstemperaturen på 20 °C. Scor disse plader på dag 3. BEMÆRK: Temperaturen i eksperimenter kan ændres i tilfælde af temperaturfølsomme mutationer. For temperaturfølsomme mutationer bør embryonale levedygtighedsassays udføres ved både tilladelige (15-16 °C) og ikke-tilladelige temperaturer (24-26 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2<ol><li>Mærk et sæt nye plader-Dag 2: orm 1, Dag 2: orm 2, ... osv.</li>
		<li>Overfør dag 1 individuelle orme til de nye plader. BEMÆRK: Disse orme skulle have nået voksenalderen, og vildtype orme skulle allerede være begyndt at lægge embryoner.</li>
		<li>Lad ormene lægge embryoner i 24 timer ved 20 °C eller en anden passende temperatur. Scor disse plader på dag 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Mærk et sæt nye plader. Dag 3: orm 1, dag 3: orm 2, ... osv.</li>
		<li>Overfør dag 2 individuelle orme til nye plader. Lad dem afkomme i 24 timer ved 20 °C eller en anden passende temperatur. Scor disse plader på dag 5. BEMÆRK: I tilfælde af lavere temperaturer øges rugetiderne. Juster i overensstemmelse hermed.</li>
		<li>Tegn et gittermønster på et 35 mm låg ved hjælp af en fin markør. Anbring gitterlåget under prøvepladen til tælling for at holde styr på tidligere tællede orme (figur 1A-B).<ol><li>Brug en differentiel celletæller til at score dag 1-pladerne for tilstedeværelse eller fravær af afkom. Tæl de levende larver og uudklækkede embryoner. BEMÆRK: På dette tidspunkt er der gået tilstrækkelig tid til, at eventuelle levedygtige embryoner burde være udklækket. Uudklækkede embryoner formodes døde.</li>
			<li>Inden for en enkelt firkant tælles de uudklækkede embryoner og levende larver, der er helt inden for firkanten (figur 1C-F).</li>
			<li>For orme, der er på de firkantede grænser, tælles baseret på placeringen af ormhovedet. Tæl orme med hoveder, der berører firkantens øverste og venstre kant (tæl ikke dem, der rører ved nederste eller højre kant; Figur 1D). Tæl ikke ubefrugtede oocytter til dette assay (figur 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4<ol><li>Dag 2-pladerne bedømmes ved at tælle levende larver og uudklækkede embryoner som beskrevet i trin 2.3.3.1. Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 5<ol><li>Dag 3-pladerne bedømmes ved at tælle levende larver og uudklækkede embryoner som beskrevet i trin 2.3.3.1. Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog. Analyser de opnåede data ved hjælp af metoden beskrevet i dataanalysen. BEMÆRK: Nogle genetiske mutanter kan have enten en forsinket eller udvidet reproduktionscyklus. Overvåg individuelle stammer for fortsat æglægning ud over dag 3-pladerne. Hvis embryoproduktionen ikke er ophørt på dag 4, skal du fortsætte med at overføre voksne til nye plader.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Embryonale levedygtighedsanalyser (krydsbefrugtning mellem han/hermafrodit)
<ol><li>Dag 1<ol><li>Mærk bagsiden af hver plade. Sørg for at holde styr på hver plade og deres respektive orme under hele eksperimentet.</li>
		<li>Overfør en individuel L4 hermafrodit orm på hver plade. Sørg for, at der ikke overføres embryoner eller andre orme til pladen. BEMÆRK: Feminiserede stammer, såsom tåge-2 tab af funktionsmutanter, som ikke producerer sædceller, kan anvendes i stedet for hermafroditter.</li>
		<li>Overfør en enkelt L4 mandlig orm på hver mærket plade, der indeholder en L4 hermafrodit. Sørg for, at der ikke overføres embryoner eller andre orme til pladen. BEMÆRK: Stammer som plg-1 variant hanner kan bruges til at identificere, om parring har fundet sted, da disse hanner deponerer en kopulatorisk prop på hermafrodit vulva efter parring.</li>
		<li>Lad ormene parre sig og lægge afkom i 24 timer ved 20 °C eller en anden passende temperatur. Score disse plader for levende larver versus uudklækkede embryoner på dag 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2<ol><li>Mærk et sæt nye plader og overfør ormene, som i dag 2 ovenfor. I dette tilfælde skal du sørge for at overføre både hermafrodit og han til nye plader. Sørg for, at hermafroditten har nået voksenalderen.</li>
		<li>Hermafroditterne lader afkom lægge afkom i 24 timer ved 20 °C eller en anden passende temperatur. Score disse plader for levende larver versus uudklækkede embryoner på dag 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3<ol><li>Mærk et sæt nye plader og overfør ormene, som på dag 3 ovenfor. Sørg for at overføre både hermafrodit og han til nye plader.</li>
		<li>Lad afkom ligge i 24 timer ved 20 °C eller en anden passende temperatur. Bedøm disse plader for levende versus uudklækkede embryoner på dag 5.</li>
		<li>Ved hjælp af en differentialcelletæller tælles levende larver og uudklækkede embryoner fra dag 1-pladerne som beskrevet i trin 2.3.3.1. BEMÆRK: Kassér ikke pladerne, da de er nødvendige til dag 4.</li>
		<li>Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 4<ol><li>Levende afkom og embryoner, der ikke er udklækket, tælles fra dag 2-pladerne som beskrevet i trin 2.3.3.1. Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog.</li>
		<li>Tjek dag 1 plader til mænd. Hvis parring har fundet sted, skal det forventede genetiske forhold mellem hermafroditter og mænd være 50:50. Hvis dag 1-pladerne ikke indeholder nogen mænd, forekom parring mellem hanen og hermafroditten ikke. Kassér dette parringspar, og registrer denne observation i laboratoriebogen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 5<ol><li>Levende larver og uudklækkede embryoner tælles fra dag 3-pladerne som beskrevet i trin 2.3.3.1. Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog. Analyser de opnåede data ved hjælp af metoderne beskrevet i dataanalysen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse af data
<ol><li>Beregn den embryonale levedygtighedsprocent af en given biologisk replikat af en stamme ved hjælp af ligning (1). BEMÆRK: Antallet af levende afkom og embryoner, der ikke er udklækket, beregnes ved at lægge det daglige antal sammen i forsøgsperioden. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Beregn yngelstørrelsen pr. orm af en given stamme ved at opsummere antallet af afkom (uudklækkede embryoner og larver) produceret af moderhermafroditten. Beregn den gennemsnitlige yngelstørrelse ved hjælp af ligning (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Rapporter embryonal levedygtighedsprocent og gennemsnitlig yngelstørrelse med gennemsnits- og standardafvigelsen mellem biologiske replikater. Udfør elevens t-test, der sammenligner kontrol- og eksperimentelle data.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis.">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li><li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities:+aneuploidies.">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172 (2008).</li><li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization.">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li><li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li><li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte-to-embryo+transition.">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS.">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li><li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis.">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li><li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis.">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans.">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Formering af seksuelt reproducerende arter kræver dannelse af haploide gameter (dvs. æg og sædceller) gennem meiose, som derefter forenes ved befrugtning, genopretter det diploide kromosomnummer og initierer embryonal udvikling. Fejl i nogen af disse processer kan føre til infertilitet, embryonal dødelighed og / eller fødselsdefekter. C. elegans er et kraftfuldt modelsystem til at studere seksuel reproduktion. Virkningerne af genmutationer eller knockdown af genekspression (f.eks. RNA-interferens) kan vurderes relativt hurtigt og let ved hjælp af de embryonale levedygtigheds- og yngelstørrelsesassays, der er beskrevet ovenfor. Vi har brugt disse metoder til den indledende karakterisering af gener, der er involveret i meiotisk kromosomadskillelse og befrugtning / ægaktivering10,11,12. En observeret reduktion i embryonal levedygtighed eller yngelstørrelse indikerer en forstyrrelse i meiose, gametogenese, befrugtning eller embryogenese.
Da embryonal levedygtighed og yngelstørrelse vurderes relativt let ved at tælle afkom og en simpel matematisk beregning, er disse optimale introduktionseksperimenter for forskningsbegyndere enten i laboratoriet eller klasseværelset. Den lette C. elegans husdyrhold og økonomiske fordele gør dem særligt velegnede til eksperimentel biologi klasser. De studerende får værdifuld forskningserfaring gennem C. elegans husdyrhold, lærer at bruge dissekerende mikroskoper og kan stille biologiske spørgsmål i et udviklingssystem, der kan besvares på relativt kort tid (ca. 5 dage med protokollen beskrevet i dette papir).
Tidspunktet for antallet af afkom er meget vigtigt for analyser af embryonale levedygtighed. Ved 20 °C tager embryogenesen ca. 16 timer, og reproduktivt modne voksne begynder at lægge æg ca. 60 timer efter udklækningen som L1-larver. Da livscyklussen er hurtig, er det vigtigt at tælle afkom inden for det relevante vindue, så embryonerne har tilstrækkelig tid til at klække, men før afkommets eget afkom begynder at lægge æg. Det er også vigtigt at bemærke, at vækstperioder varierer afhængigt af temperaturen. Væksten er ca. 2,1 gange hurtigere ved 24-25 °C end 15-16 °C og ca. 1,3 gange hurtigere ved 20 °C end 15-16 °C13. I denne protokol anbefaler vi, at tællinger sker 48 timer efter, at de voksne er placeret på en frisk tallerken. Denne tidsramme sikrer, at alle embryoner med udvikling af vildtyper har tilstrækkelig tid til at klække (>16 timer), men ikke ældes til det punkt, hvor de er reproduktionsevne. Det kan være nødvendigt at forlænge analyser udført ved temperaturer under 20 °C (overføre dyr i 4 dage), så embryonerne klækkes, og afkommets afkom når larvestadier, der er lettere at observere blandt bakterierne på MYOB-pladerne (L3-L4-stadier).
En begrænsning for embryonale levedygtighedsanalyser og yngelstørrelser er, at den specifikke udviklingsproces, der forstyrres, ikke er umiddelbart synlig. Imidlertid kan disse indledende assays følges op med cytologiske teknikker for at bestemme, hvilken proces der påvirkes. For eksempel kan dissektion af de voksne orme for at frigive gonaden efterfulgt af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning og omhyggelig analyse af DNA-morfologi inden for kimlinjen afsløre, om meiotiske processer forstyrres. Derudover kan DAPI-farvning af embryoner afsløre, på hvilket stadium embryogenese arresterer.
Afslutningsvis har vi beskrevet en protokol til analyse af antallet af producerede embryoner (yngel) og procentdelen af embryoner, der er levedygtige for forskellige C. elegans-mutanter. Dette assay kan bruges til både selvbefrugtende hermafroditter og til mandlige / hermafrodit krydsninger. Med C. elegans korte livscyklus kan denne protokol afsluttes på mindre end 1 uge. Embryonale levedygtighedsanalyser og yngelstørrelser kan bruges som første analyser af gener, der er involveret i meiose, befrugtning eller embryonal udvikling, og er passende protokoller for mere avancerede forskere og forskningsbegyndere (både bachelor- og førsteårsstuderende).

Seksuel reproduktion i eukaryote organismer kræver produktion af funktionelle gameter, der fusionerer for at danne et embryo gennem befrugtningsprocessen. Moder- og faderlige kønsceller, æg (æg) og sædceller skabes gennem de specialiserede celledelings- og differentieringsprocesser af meiose og gametogenese1. Meiose starter med en enkelt diploide celle og slutter med dannelsen af datterceller, der indeholder halvdelen af antallet af kromosomer i den oprindelige forældrecelle. Fra reduktion af ploidi til blanding af genetisk materiale via uafhængigt sortiment og crossover-rekombination tjener meiose flere vigtige funktioner1. Fejl inden for meiose kan resultere i aneuploidi, hvor der er for mange eller for få kromosomer i en gamet. Forekomster af aneuploidier har enorme konsekvenser for menneskers sundhed, da kromosomale ubalancer er en væsentlig årsag til aborter og udviklingsforstyrrelser som Downs syndrom og Edwards syndrom2.
Befrugtning er den proces, hvorved moderens og faderens gameter smelter sammen for at generere en ny organisme3. Gamete-gametgenkendelse lettes af proteiner på gametoverfladen3. Fejl med gametkompatibilitet fører til infertilitet, da sæd- og ægfusion ikke kan fortsætte. Fusionen af sædceller med en oocyt udløser en lang række begivenheder, der fører til korrekt dannelse af et aktivt embryo, der kan begynde udviklingsrejsen fra et enkeltcelleembryo til en fuldt funktionel flercellet organisme via mitotiske opdelinger4. Gennem embryogenese skal molekylære begivenheder, der regulerer udviklingen, være stramt reguleret og præcist timet for at muliggøre korrekt vækst af organismen5. Korrekt cellulær differentiering under tidlig udvikling er afgørende, da organismen overgår fra et pluripotent embryo til en fuldgyldig organisme. På grund af kompleksiteten af disse begivenheder kan forstyrrelser føre til udviklingsfejl, der resulterer i embryonal dødelighed.
Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til at studere meiose, befrugtning og embryonal udvikling. C. elegans er en gennemsigtig nematode, der har to køn, mænd og hermafroditter. C. elegans hermafroditter, som er i stand til selvbefrugtning, er det dominerende køn 6,7. Hermafroditgonaden producerer først sædceller under det fjerde larvestadium (L4), som opbevares i spermatheca. Ved overgangen fra L4 til voksenalderen skifter kimlinjen til at producere oocytter, som derefter befrugtes via den lagrede sæd. Mænd, der opstår i hermafroditter med en hastighed på mindre end 0,2%, producerer kun sæd og kan parre sig med hermafroditter. Ved krydsbefrugtning udkonkurrerer mandlig sæd hermafroditsæd i befrugtning af oocytter8. Dette giver mulighed for relativt let vedligeholdelse af homozygote mutanter gennem selvbefrugtende bestande og for genetiske manipulationer gennem genetiske krydsninger. De to køn giver mulighed for undersøgelser, der undersøger forskelle mellem meiose i mandlige og kvindelige kimlinjer. På grund af den gennemsigtige karakter af C. elegans og dets æg kan processerne for meiose, gametogenese, befrugtning og embryogenese undersøges hos levende, intakte dyr ved hjælp af fluorescensbilleddannelsesteknikker.
Når man analyserer nye mutationer i gener, der kan spille en rolle i meiose, befrugtning og / eller embryonal udvikling i C. elegans, er et afgørende første skridt at bestemme embryonal levedygtighed og yngelstørrelse, da fejl i disse processer ofte fører til en fiasko eller reduktion i produktionen af levedygtigt afkom. Dette papir beskriver en protokol til vurdering af fertilitet, embryonal levedygtighed og yngelstørrelse fra enten selvbefrugtende hermafroditter eller krydsninger mellem hermafroditter og mænd. Mens dette klassiske assay er blevet brugt i mange C. elegans undersøgelser, leverer vi en standardiseret protokol til opsætning og nøjagtig kvantificering. I denne protokol isoleres individuelle orme eller mandlige / hermafroditpar for at muliggøre parring og afkomproduktion. Afkomsproduktion og levedygtighed observeres over en række dage for at bestemme antallet af levedygtige afkom og ikke-levedygtige embryoner. Ved afslutningen af eksperimentet analyseres individuelle kuld for at beregne embryonale levedygtighedsprocent og total yngelstørrelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>T3501</td>
			<td>Semi-stackable, non-vented.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>211677</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>FW 58.440</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans wild type strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>him-5(e1490)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>DR466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spo-11(ok79)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>AV106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential cell counter</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-670-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSoft Excel or Prism</td>
			<td>MicroSoft or GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>For recording and creating graphical representations of data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>PT9901</td>
			<td>For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td>Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick handle</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>TWPH1</td>
			<td>For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til undersøgelse af meiose, befrugtning og embryonal udvikling. C. elegans eksisterer som selvbefrugtende hermafroditter, der producerer store kuld af afkom - når mænd er til stede, kan de producere endnu større kuld af krydsafkom. Fejl i meiose, befrugtning og embryogenese kan hurtigt vurderes som fænotyper af sterilitet, nedsat fertilitet eller embryonal dødelighed. Denne artikel beskriver en metode til bestemmelse af embryonal levedygtighed og yngelstørrelse i C. elegans. Vi demonstrerer, hvordan man opretter dette assay ved at plukke en orm på en individuel modificeret ynglings, kun Bacto-peptone (MYOB) plade, etablere den passende tidsramme til at tælle levedygtige afkom og ikke-levedygtige embryoner og forklare, hvordan man nøjagtigt tæller levende ormprøver. Denne teknik kan bruges til at bestemme levedygtighed i selvbefrugtende hermafroditter samt krydsbefrugtning ved parringspar. Disse relativt enkle eksperimenter er let anvendelige for nye forskere, såsom bachelorstuderende og førsteårsstuderende.

Vi udførte embryonal levedygtighed og yngelstørrelsesanalyser på N2 (vildtype) og på to stammer, der huser mutationer i gener, der er involveret i meiose, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79). Da både him-5 og spo-11 spiller en rolle i meiotisk crossover-dannelse, resulterer mutationer i disse to gener i dannelsen af aneuploide kønsceller. Denne embryonale levedygtighedsanalyse for N2 gav en levedygtighedsprocent på 98,9%, mens både him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) viste en reduktion i afkomslevedygtighed med en procentdel på henholdsvis 74,9% og 0,8% (figur 2A; p < 0,0005). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater 7,9. Den gennemsnitlige yngelstørrelse af N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) blev bestemt til at være henholdsvis 217, 105 og 219 (figur 2B). I overensstemmelse med tidligere publikationer har him-5 (e1490) en signifikant reduceret yngelstørrelse sammenlignet med vildtype, mens spo-11 (ok79) ikke 7,9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> Figur 1: Demonstration af tælleopstilling og embryomorfologi på plader . (A) Billede af et låg med et krydsskraveret gittermønster tegnet ved hjælp af en fin sharpie. (B) En 35 mm MYOB-plade med det mønstrede låg nedenunder til tælling. (C) Billede, der viser et synsfelt med lav forstørrelse (10x), der viser flere bokse i gitteret. Hvide pilespidser peger på flere larver inden for dette synsfelt. Tælling skal ske ved en højere forstørrelse (kun en firkant i marken) for at observere både larver og embryoner. Skalabjælke = 1.000 μm. (D) Tegneserie af låget med gittermønsteret placeret under en 35 mm plade. Indsatsen angiver den korrekte teknik til at bestemme, hvilke larver der tælles i en given firkant. Tæl fra top til bund, fra venstre mod højre. Tæl eventuelle orme, der er helt inden for firkanten. Orme, der berører grænsen, skal tælles baseret på ormehovedets position, ikke halen. Tæl orme, der vender mod det eller de aktuelle gitter, der tidligere er blevet talt (dvs. øverste og venstre kant). Tæl ikke orme med hoveder, der berører bunden eller højre kant. Fra indsatsen tælles blå orme, mens røde orme ikke gør. (E) Repræsentativt billede af sunde N2 L1 klækkede larver (hvid pilespids). (F) Repræsentativt billede af en ubefrugtet oocyt (sort pilespids) og et uudklækket embryo (rød pilespids). Ubefrugtede oocytter bør ikke tælles med i denne analyse. Skalastænger (E,F) = (100 μm). Bemærk: Billeder i C, E og F blev taget med et Zeiss AxioZoom-mikroskop med et kamera fastgjort med det formål at demonstrere udseendet af larver, embryoner og oocytter på ormeplader. For embryonale levedygtighedsanalyser udføres tællinger, mens pladerne observeres ved hjælp af et stereomikroskop (intet kamera). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> Figur 2: Repræsentative grafer, der viser resultaterne fra embryonale levedygtighedsanalyser og yngelstørrelser. (A) Embryonal levedygtighedsprocent af N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) ved 20 °C. (B) Yngelstørrelser på N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) ved 20 °C . Afkom af mindst 28 hermafroditter blev scoret for hver stamme. Det samlede antal uudklækkede embryoner plus larver scoret var N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2.945 og spo-11 (ok79) = 7.230. Fejlbjælker angiver standardafvigelsen på tværs af tre separate individuelle replikater. Statistik beregnet ved hjælp af elevens t-test, n.s. = ikke signifikant, *p < 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Her præsenterer vi en generel metode til bestemmelse af embryonale levedygtighed og det samlede antal embryoner produceret (yngel) ved hjælp af modelorganismen C. elegans.

Måling af embryonal levedygtighed og yngelstørrelse i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Denne protokol til bestemmelse af yngelstørrelse og embryonal levedygtighed bruges af mange C.elegans laboratorier. Fald i brutal størrelse og embryonal levedygtighed kan indikere defekter i vigtige udviklingsprocesser såsom myose, befrugtning og embryogenese. Denne teknik giver klare instruktioner til nybegyndere C.elegans forskere.Det er relativt enkelt at opsætte og udføre, og er et godt udgangspunkt, når man arbejder med nye mutantstammer. Den største udfordring for denne teknik er embryo versus ubefrugtet embryoidentifikation. Nye forskere bør øve identifikation af embryoner, oocytter og de forskellige larvestadier, før de begynder disse eksperimenter.For at begynde skal du mærke bagsiden af pladen, overføre en individuel L4-trins hermafrodit ned til pladen. Sørg for, at der ikke overføres embryoner eller andre orme til pladen. Lad ormene udvikle sig til voksne og læg selvafkom i 24 timer ved standarddyrkningstemperaturen på 20 grader celsius.Scor pladen på dag tre. Den næste dag skal du mærke et sæt nye plader og overføre dagen en individuel orm til den nye plade. Lad ormene lægge embryoner i 24 timer ved 20 grader celsius.Scor pladen på dag fire. På dag tre skal du mærke et sæt nye plader og overføre dag to individuelle orme til den nye plade. Lad ormene lægge afkom i 24 timer ved 20 grader.Scor pladen på dag fem. Tegn et gittermønster på et 35 millimeter låg ved hjælp af en fin markør. Placer gitterlåget under testpladen til tælling for at holde styr på tidligere tællede orme.Brug en differentiel celletæller til at tælle de levende larver og uudklækkede embryoner inden for den enkelte firkant. For orme på de firkantede grænser tæller baseret på placeringen af ormhovedet. Tæl orme med hoveder, der berører firkantens øverste og venstre kant.Registrer antallet af levende larver og uudklækkede embryoner i en laboratoriebog. På dag fire skal du score dag to-pladen ved at tælle de levende larver og uudklækkede embryoner og registrere dem i en laboratoriebog. På dag fem skal du score dag tre-pladen ved at tælle de levende larver og uudklækkede embryoner og registrere dem i en laboratoriebog.Efter mærkning af bagsiden af pladen overføres en individuel L4 hermafrodit orm på pladen. Sørg for, at der ikke overføres embryoner eller andre orme til pladen. Overfør en enkelt L4 hanorm til pladen, der indeholder en L fire hermafrodit.Lad ormene parre sig og lægge afkom i 24 timer ved 20 grader celsius. Scor pladen for levende larver versus uudklækkede embryoner på dag tre. Den næste dag skal du mærke et sæt nye plader og overføre hermafrodit og han til den nye plade.Sørg for, at hermafroditten har nået voksenalderen. Lad hermafroditterne lægge afkom i 24 timer ved 20 grader celsius. Scor pladen for levende larver versus uudklækkede embryoner på dag fire.På dag tre skal du mærke et sæt nye plader og overføre hermafrodit og han til den nye plade. Lad ormene lægge afkom i 24 timer ved 20 grader. Score pladen for levende versus uudklækkede embryoner på dag fem.Brug en differentiel celletæller til at tælle de levende larver og uudklækkede embryoner fra dag ét plade og registrere dem i en laboratoriebog. På dag fire tælles levende afkom og uudklækkede embryoner fra dag to-pladen og registreres i en laboratoriebog. Tjek dag en plade for mænd.Hvis parring har fundet sted, er det forventede genetiske forhold mellem hermafroditter og mænd 50 til 50. Hvis den ene plade ikke indeholder nogen hanner, forekom parring mellem hanen og hermafroditten ikke. Kassér dette parringspar, og registrer observationen i laboratoriebogen.På dag fem tælles de levende larver og uudklækkede embryoner fra dag tre-pladen og registreres i en laboratoriebog. Embryonal levedygtighedsanalysen for N2 gav en levedygtighedsprocent på 98,9%, mens både him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) viste en reduktion i embryonal levedygtighed med en procentdel på henholdsvis 74,9% og 0,8%. Den gennemsnitlige yngelstørrelse af N2, him-5 (e1490) og spo-11 (ok79) blev bestemt til at være henholdsvis 217, 105 og 219.Genkendelse af de forskellige stadier af C.elegans udvikling er vigtig for nøjagtige og reproducerbare data. Vi anbefaler at blive fortrolig med ormudvikling ved hjælp af billeder og et dissekerende mikroskop. Denne procedure er et godt første skridt til at afgøre, om et gen er involveret i en udviklingsproces og kan efterfølges af cytologiske analyser for at bestemme, hvilken proces der forstyrres.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis Elegans - en alsidig In Vivo Model til at studere Host-mikrobe interaktioner

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Kultur og assay af storstilet blandet stadie Caenorhabditis elegans Populationer

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size LEfSe in Microbiome Data

Assisteret udvælgelse af biomarkører ved lineær diskriminantanalyseeffektstørrelse (LEfSe) i mikrobiomdata

There is growing attention toward closed biological genomes in the environment and in health. To explore and reveal the intergroup differences among ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Måling af Caenorhabditis elegans Følsomhed over for acetylcholin receptoragonist levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Undersøgelse af billige metoder til måling af levetid og sundhed i Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Analyse af transgenerationel epigenetisk arv i C. elegans ved hjælp af en fluorescerende reporter og kromatinimmunudfældning (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...