Name: measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00
Duration: 6 min 24 s
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Le travail dans le laboratoire Jaramillo-Lambert est soutenu par le National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Toutes les souches de C. elegans ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center, financé par les National Institutes of Health, P40 OD010440. La figure 1D a été créée à l’aide de Biorender.com.

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.
1. Préparation des plaques expérimentales
<ol><li>Préparer des boîtes de Petri de 35 mm de diamètre avec des milieux Modified Youngren’s, Only Bacto-peptone (MYOB). Pour faire des plaques MYOB, ajouter 20 g de gélose Botto, 2 g de NaCl, 0,55 g de Trizma-HCl, 0,24 g de Trizma-OH, 3,1 g de peptone de Bacto et 1,6 mL de cholestérol à 1 L deddH2Oet autoclave pendant 40 min à 121 °C. Laisser refroidir à 55 °C et, à l’aide d’une technique stérile, verser 4 ml du milieu fondu dans chaque boîte de Petri de 35 mm. REMARQUE: Un litre de MYOB fait ~ 250 plaques, qui peuvent être stockées à 4 ° C jusqu’à 6 mois. Nous recommandons un minimum de 10 individus par répétition avec trois ensembles de réplications pour chaque souche.</li>
	<li>À l’aide d’une technique stérile, ensemencer les plaques avec une petite tache (environ 50 μL) de bactéries OP50 au milieu de la plaque. REMARQUE : Les petites pelouses sont particulièrement importantes pour évaluer la fertilisation croisée, car la plus petite tache entraîne une augmentation des rencontres entre les mâles et les hermaphrodites, augmentant ainsi les chances d’accouplement.</li>
</ol>2. Essais de viabilité embryonnaire (autofécondation hermaphrodite)
<ol><li>Jour 1<ol><li>Étiquetez le dos de chaque assiette. Assurez-vous de garder une trace de chaque plaque et de leurs vers respectifs tout au long de l’expérience. REMARQUE: Technique d’étiquetage préférée-Jour 1: ver 1, Jour 1: ver 2, ... etc.</li>
		<li>Transférer un hermaphrodite individuel du stade L4 sur chaque plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Laisser les vers se développer en adultes et pondre leur descendance pendant 24 heures à la température de culture standard de 20 °C. Marquez ces plaques le jour 3. NOTE: La température des expériences peut être modifiée dans le cas de mutations sensibles à la température. Pour les mutations sensibles à la température, les essais de viabilité embryonnaire doivent être effectués à la fois aux températures permissives (15-16 °C) et non permissives (24-26 °C).</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques-Jour 2: ver 1, Jour 2: ver 2, ... etc.</li>
		<li>Transférer les vers individuels du jour 1 sur les nouvelles plaques. REMARQUE: Ces vers devraient avoir atteint l’âge adulte, et les vers de type sauvage devraient déjà avoir commencé à pondre des embryons.</li>
		<li>Laisser les vers pondre des embryons pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques le jour 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3<ol><li>Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques. Jour 3: ver 1, Jour 3: ver 2, ... etc.</li>
		<li>Transférer les vers individuels du jour 2 sur de nouvelles assiettes. Laissez-les pondre pendant 24 heures à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques le jour 5. NOTE: En cas de températures plus basses, les temps d’éclosion seront augmentés. Ajustez en conséquence.</li>
		<li>Dessinez un motif de grille sur un couvercle de 35 mm à l’aide d’un marqueur fin. Placez le couvercle quadrillé sous la plaque d’essai pour le comptage afin de garder une trace des vers précédemment comptés (Figure 1A-B).<ol><li>À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, notez les plaques du jour 1 pour la présence ou l’absence de descendance. Comptez les larves vivantes et les embryons non éclos. NOTE: À ce stade, un temps suffisant s’est écoulé pour que tous les embryons viables aient éclos. Tout embryon non éclos est présumé mort.</li>
			<li>À l’intérieur d’un carré individuel, compter les embryons non éclos et les larves vivantes qui se trouvent entièrement dans le carré (figure 1C-F).</li>
			<li>Pour les vers qui se trouvent sur les bordures carrées, comptez en fonction de l’emplacement de la tête du ver. Comptez les vers dont la tête touche les bords supérieur et gauche du carré (ne comptez pas ceux qui touchent les bords inférieur ou droit; Figure 1D). Ne comptez pas les ovocytes non fécondés pour ce test (Figure 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 4<ol><li>Noter les plaques du jour 2 en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 5<ol><li>Noter les plaques du jour 3 en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Analyser les données obtenues à l’aide de la méthode décrite dans l’analyse des données. NOTE: Certains mutants génétiques peuvent avoir un cycle de reproduction retardé ou élargi. Surveiller les souches individuelles pour la poursuite de la ponte des embryons au-delà des plaques du jour 3. Si la production d’embryons n’a pas cessé au jour 4, continuer à transférer les adultes dans de nouvelles plaques.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Essais de viabilité embryonnaire (fécondation croisée mâle/hermaphrodite)
<ol><li>Jour 1<ol><li>Étiquetez le dos de chaque assiette. Assurez-vous de garder une trace de chaque plaque et de leurs vers respectifs tout au long de l’expérience.</li>
		<li>Transférer un ver hermaphrodite L4 individuel sur chaque plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. NOTE: Les souches féminisées, telles que les mutants de perte de fonction fog-2 , qui ne produisent pas de spermatozoïdes, peuvent être utilisées à la place des hermaphrodites.</li>
		<li>Transférer un seul ver mâle L4 sur chaque plaque étiquetée contenant un hermaphrodite L4. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. REMARQUE: Des souches telles que les mâles variants plg-1 peuvent être utilisées pour déterminer si l’accouplement a eu lieu, car ces mâles déposent un bouchon copulatoire sur la vulve hermaphrodite après l’accouplement.</li>
		<li>Laisser les vers s’accoupler et pondre pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos au jour 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 2<ol><li>Étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez les vers, comme au jour 2 ci-dessus. Dans ce cas, assurez-vous de transférer l’hermaphrodite et le mâle sur de nouvelles plaques. Assurez-vous que l’hermaphrodite a atteint l’âge adulte.</li>
		<li>Laisser les hermaphrodites pondre pendant 24 heures à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos au jour 4.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3<ol><li>Étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez les vers, comme au jour 3 ci-dessus. Assurez-vous de transférer l’hermaphrodite et le mâle sur de nouvelles plaques.</li>
		<li>Laisser pondre la progéniture pendant 24 h à 20 °C ou à une autre température appropriée. Marquez ces plaques pour les embryons vivants par rapport aux embryons non éclos le jour 5.</li>
		<li>À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, compter les larves vivantes et les embryons non éclos des plaques du jour 1, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. REMARQUE: Ne jetez pas les plaques, car elles sont requises pour le jour 4.</li>
		<li>Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 4<ol><li>Compter la descendance vivante et les embryons non éclos des plaques du jour 2, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire.</li>
		<li>Vérifiez les plaques du jour 1 pour les hommes. Si l’accouplement a eu lieu, le rapport génétique attendu des hermaphrodites par rapport aux mâles devrait être de 50:50. Si les plaques du jour 1 ne contiennent aucun mâle, l’accouplement entre le mâle et l’hermaphrodite n’a pas eu lieu. Jetez ce couple d’accouplement et notez cette observation dans le cahier de laboratoire.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 5<ol><li>Compter les larves vivantes et les embryons non éclos des plaques du jour 3, comme décrit à l’étape 2.3.3.1. Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Analyser les données obtenues à l’aide des méthodes décrites dans l’analyse des données.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Calculer le pourcentage de viabilité embryonnaire d’une réplication biologique donnée d’une souche à l’aide de l’équation (1). NOTE: Le nombre de descendants vivants et d’embryons non éclos est obtenu en totalisant le nombre quotidien tout au long de la période expérimentale. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Calculer la taille de la couvée par ver d’une souche donnée en additionnant le nombre de descendants (embryons et larves non éclos) produits par l’hermaphrodite parent. Calculer la taille moyenne de la couvée à l’aide de l’équation (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Indiquez le pourcentage de viabilité embryonnaire et la taille moyenne des couvées avec la moyenne et l’écart-type entre les répétitions biologiques. Effectuer le test t de Student en comparant les données de contrôle et expérimentales.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis.">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li><li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities:+aneuploidies.">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172 (2008).</li><li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization.">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li><li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li><li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte-to-embryo+transition.">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS.">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li><li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis.">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li><li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis.">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans.">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La propagation des espèces à reproduction sexuée nécessite la formation de gamètes haploïdes (c’est-à-dire des ovules et des spermatozoïdes) par méiose, qui sont ensuite unifiés lors de la fécondation, restaurant le nombre de chromosomes diploïdes et initiant le développement embryonnaire. Des erreurs dans l’un de ces processus peuvent entraîner l’infertilité, la létalité embryonnaire et / ou des malformations congénitales. C. elegans est un puissant système modèle pour étudier la reproduction sexuée. Les effets des mutations génétiques ou de l’élimination de l’expression génique (p. ex. interférence ARN) peuvent être évalués relativement rapidement et facilement à l’aide des essais de viabilité embryonnaire et de dimensionnement du couvain décrits ci-dessus. Nous avons utilisé ces méthodes pour la caractérisation initiale des gènes impliqués dans la ségrégation et la fécondation des chromosomes méiotiques / activation des œufs10,11,12. Une réduction observée de la viabilité embryonnaire ou de la taille du couvain indique une perturbation de la méiose, de la gamétogenèse, de la fécondation ou de l’embryogenèse.
Comme la viabilité embryonnaire et le dimensionnement du couvain sont évalués relativement facilement par comptage de la descendance et un simple calcul mathématique, il s’agit d’expériences d’introduction optimales pour les novices en recherche, que ce soit en laboratoire ou en classe. La facilité d’élevage de C. elegans et les avantages économiques les rendent particulièrement adaptés aux cours de biologie expérimentale. Les étudiants acquièrent une expérience de recherche précieuse grâce à l’élevage de C. elegans , apprennent à utiliser des microscopes à dissection et peuvent poser des questions biologiques dans un système de développement auquel il est possible de répondre dans un laps de temps relativement court (environ 5 jours avec le protocole décrit dans cet article).
Le moment du dénombrement des descendants est très important pour les essais de viabilité embryonnaire. À 20 °C, l’embryogenèse prend environ 16 h et les adultes matures sur le plan de la reproduction commencent à pondre environ 60 h après l’éclosion en tant que larves L1. Comme le cycle de vie est rapide, il est important de compter la progéniture dans la fenêtre appropriée, en laissant suffisamment de temps aux embryons pour éclore, mais avant que la progéniture elle-même ne commence à pondre des œufs. Il est également important de noter que les périodes de croissance varient en fonction de la température. La croissance est environ 2,1 fois plus rapide à 24-25 °C qu’à 15-16 °C, et environ 1,3 fois plus rapide à 20 °C que 15-16 °C13. Dans ce protocole, nous recommandons que les dénombrements aient lieu 48 heures après que les adultes ont été placés sur une assiette fraîche. Ce délai garantit que tous les embryons ayant un développement de type sauvage ont suffisamment de temps pour éclore (>16 h), mais ne vieillissent pas au point de se reproduire. Les essais effectués à des températures inférieures à 20 °C peuvent devoir être prolongés (animaux transférés pendant 4 jours) pour que les embryons éclosent et que la descendance éclose atteigne des stades larvaires plus faciles à observer parmi les bactéries sur les plaques MYOB (stades L3-L4).
Une limite aux essais de viabilité embryonnaire et au dimensionnement du couvain est que le processus de développement spécifique qui est perturbé n’est pas facilement apparent. Cependant, ces tests initiaux peuvent être suivis de techniques cytologiques pour déterminer quel processus est affecté. Par exemple, la dissection des vers adultes pour libérer la gonade suivie d’une coloration au 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et une analyse minutieuse de la morphologie de l’ADN dans la lignée germinale peuvent révéler si les processus méiotiques sont perturbés. En outre, la coloration DAPI des embryons peut révéler à quel stade l’embryogenèse s’arrête.
En conclusion, nous avons décrit un protocole pour tester le nombre d’embryons produits (couvée) et le pourcentage d’embryons viables pour divers mutants de C. elegans. Ce test peut être utilisé à la fois pour les hermaphrodites autofécondants et pour les croisements mâle/hermaphrodites. Avec le cycle de vie court de C. elegans, ce protocole peut être complété en moins de 1 semaine. Les tests de viabilité embryonnaire et la taille des couvées peuvent être utilisés comme premières analyses des gènes impliqués dans la méiose, la fécondation ou le développement embryonnaire, et sont des protocoles appropriés pour les chercheurs plus avancés et les novices en recherche (étudiants de premier cycle et de première année).

La reproduction sexuée dans les organismes eucaryotes nécessite la production de gamètes fonctionnels qui fusionnent pour former un embryon par le processus de fécondation. Les gamètes maternels et paternels, les ovules (ovules) et les spermatozoïdes sont créés par les processus spécialisés de division cellulaire et de différenciation de la méiose et de la gamétogenèse1. La méiose commence avec une seule cellule diploïde et se termine par la formation de cellules filles qui contiennent la moitié du nombre de chromosomes de la cellule parentale d’origine. De la réduction de la ploïdie au brassage du matériel génétique en passant par l’assortiment indépendant et la recombinaison croisée, la méiose remplit de multiples fonctions importantes1. Les erreurs dans la méiose peuvent entraîner une aneuploïdie, dans laquelle il y a trop ou trop peu de chromosomes dans un gamète. L’incidence de l’aneuploïdie a des impacts énormes sur la santé humaine, car les déséquilibres chromosomiques sont une cause majeure de fausses couches et de troubles du développement tels que le syndrome de Down et le syndrome d’Edwards2.
La fécondation est le processus par lequel les gamètes maternel et paternel fusionnent pour générer un nouvel organisme3. La reconnaissance des gamètes-gamètes est facilitée par des protéines présentes à la surface des gamètes3. Les erreurs de compatibilité des gamètes entraînent l’infertilité car la fusion des spermatozoïdes et des ovules est incapable de se poursuivre. La fusion d’un spermatozoïde avec un ovocyte déclenche une foule d’événements qui conduisent à la formation appropriée d’un embryon actif qui peut commencer le voyage de développement d’un embryon unicellulaire à un organisme multicellulaire pleinement fonctionnel via des divisions mitotiques4. Tout au long de l’embryogenèse, les événements moléculaires qui régulent le développement doivent être étroitement régulés et programmés avec précision pour permettre une croissance correcte de l’organisme5. Une différenciation cellulaire appropriée au début du développement est cruciale lorsque l’organisme passe d’un embryon pluripotent à un organisme à part entière. En raison de la complexité de ces événements, les perturbations peuvent entraîner des anomalies du développement qui entraînent une létalité embryonnaire.
Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour étudier la méiose, la fécondation et le développement embryonnaire. C. elegans est un nématode transparent qui a deux sexes, mâles et hermaphrodites. C. elegans hermaphrodites, capables de s’autoféconder, sont le sexe prédominant 6,7. La gonade hermaphrodite produit d’abord des spermatozoïdes au cours du quatrième stade larvaire (L4), qui sont stockés dans la spermathèque. Lors de la transition L4 à l’âge adulte, la lignée germinale passe à la production d’ovocytes, qui sont ensuite fécondés via le sperme stocké. Les mâles, qui apparaissent chez les hermaphrodites à un taux inférieur à 0,2%, ne produisent que des spermatozoïdes et peuvent s’accoupler avec des hermaphrodites. Lors de la fécondation croisée, les spermatozoïdes mâles surpassent les spermatozoïdes hermaphrodites dans la fécondation des ovocytes8. Cela permet le maintien relativement facile des mutants homozygotes grâce à des souches autofertilisantes et des manipulations génétiques par croisements génétiques. Les deux sexes permettent des études explorant les différences entre la méiose dans les lignées germinales mâles et femelles. De plus, en raison de la nature transparente de C. elegans et de ses œufs, les processus de méiose, de gamétogenèse, de fécondation et d’embryogenèse peuvent être étudiés chez des animaux vivants et intacts à l’aide de techniques d’imagerie par fluorescence.
Lors de l’analyse de nouvelles mutations dans les gènes qui peuvent jouer un rôle dans la méiose, la fécondation et / ou le développement embryonnaire chez C. elegans, une première étape cruciale consiste à déterminer la viabilité embryonnaire et la taille du couvain, car les erreurs dans ces processus conduisent souvent à un échec ou à une réduction de la production de descendants viables. Cet article décrit un protocole pour évaluer la fertilité, la viabilité embryonnaire et la taille du couvain à partir d’hermaphrodites autofécondants ou de croisements entre hermaphrodites et mâles. Bien que ce test classique ait été utilisé dans de nombreuses études sur C. elegans , nous fournissons un protocole standardisé pour la configuration et la quantification précise. Dans ce protocole, des vers individuels ou des couples mâles/hermaphrodites sont isolés pour permettre l’accouplement et la production de descendance. La production et la viabilité de la descendance sont observées sur une série de jours afin de déterminer le nombre de descendants viables et d’embryons non viables. À la fin de l’expérience, les couvées individuelles sont analysées pour calculer le pourcentage de viabilité embryonnaire et la taille totale de la couvée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>T3501</td>
			<td>Semi-stackable, non-vented.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>211677</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>FW 58.440</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans wild type strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>him-5(e1490)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>DR466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spo-11(ok79)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>AV106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential cell counter</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-670-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSoft Excel or Prism</td>
			<td>MicroSoft or GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>For recording and creating graphical representations of data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>PT9901</td>
			<td>For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td>Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick handle</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>TWPH1</td>
			<td>For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans est un excellent organisme modèle pour l’étude de la méiose, de la fécondation et du développement embryonnaire. C. elegans existe en tant qu’hermaphrodite autofécondante, qui produit de grandes couvées de descendance - lorsque les mâles sont présents, ils peuvent produire des couvées encore plus grandes de descendance croisée. Les erreurs de méiose, de fécondation et d’embryogenèse peuvent être rapidement évaluées comme des phénotypes de stérilité, de fertilité réduite ou de létalité embryonnaire. Cet article décrit une méthode pour déterminer la viabilité embryonnaire et la taille du couvain chez C. elegans. Nous montrons comment mettre en place ce test en choisissant un ver sur une plaque individuelle de Modified Youngren, Only Bacto-peptone (MYOB), établissons le délai approprié pour compter les descendants viables et les embryons non viables, et expliquons comment compter avec précision les spécimens de vers vivants. Cette technique peut être utilisée pour déterminer la viabilité des hermaphrodites autofécondants ainsi que la fertilisation croisée par des couples d’accouplement. Ces expériences relativement simples sont facilement adoptables pour les nouveaux chercheurs, tels que les étudiants de premier cycle et les étudiants de première année des cycles supérieurs.

Nous avons effectué des tests de viabilité embryonnaire et de dimensionnement du couvain sur N2 (type sauvage) et sur deux souches présentant des mutations dans les gènes impliqués dans la méiose, him-5 (e1490) et spo-11 (ok79). Comme him-5 et spo-11 jouent tous deux un rôle dans la formation de croisements méiotiques, des mutations dans ces deux gènes entraînent la formation de gamètes aneuploïdes. Cet essai de viabilité embryonnaire pour N2 a donné un pourcentage de viabilité de 98,9 %, tandis que him-5(e1490) et spo-11(ok79) ont montré une réduction de la viabilité de la descendance avec un pourcentage de 74,9 % et 0,8 %, respectivement (Figure 2A; p < 0,0005). Ces résultats concordent avec ceux publiés antérieurement 7,9. La taille moyenne des couvées N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) a été déterminée à 217, 105 et 219, respectivement (figure 2B). Conformément aux publications précédentes, him-5 (e1490) a une taille de couvain significativement réduite par rapport au type sauvage, alors que spo-11 (ok79) n’en a pas 7,9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> Figure 1 : Démonstration de la configuration de comptage et de la morphologie embryonnaire sur plaques. (A) Image d’un couvercle avec un motif de grille hachurée dessiné à l’aide d’un sharpie fin. (B) Une plaque MYOB de 35 mm avec le couvercle à motifs en dessous pour le comptage. (C) Image montrant un faible grossissement (10x) montrant plusieurs cases de la grille. Les pointes de flèches blanches indiquent plusieurs larves dans ce champ de vision. Le comptage doit être effectué à un grossissement plus élevé (un seul carré dans le champ) pour observer à la fois les larves et les embryons. Barre d’échelle = 1 000 μm. (D) Dessin du couvercle avec le motif de la grille placé sous une plaque de 35 mm. L’encart indique la technique appropriée pour déterminer quelles larves sont comptées dans un carré donné. Comptez de haut en bas, de gauche à droite. Comptez tous les vers qui se trouvent entièrement dans le carré. Les vers qui touchent la limite doivent être comptés en fonction de la position de la tête du ver et non de la queue. Comptez les vers faisant face à la grille actuelle ou les grilles qui ont été précédemment comptées (c’est-à-dire les bords supérieur et gauche). Ne comptez pas les vers dont la tête touche le bas ou le bord droit. À partir de l’encart des vers bleus, les vers bleus seront comptés alors que les vers rouges ne le seront pas. (E) Image représentative des larves écloses N2 L1 en bonne santé (pointe de flèche blanche). (F) Image représentative d’un ovocyte non fécondé (pointe de flèche noire) et d’un embryon non éclos (pointe de flèche rouge). Les ovocytes non fécondés ne doivent pas être comptés pour ce test. Barres d’échelle (E,F) = (100 μm). Remarque: Les images en C, E et F ont été prises avec un microscope Zeiss AxioZoom, avec une caméra fixée dans le but de démontrer l’apparence des larves, des embryons et des ovocytes sur les plaques de vers. Pour les essais de viabilité embryonnaire, les comptages sont effectués tout en observant les plaques à l’aide d’un stéréomicroscope (pas de caméra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> Figure 2 : Graphiques représentatifs illustrant les résultats des essais de viabilité embryonnaire et de la taille des couvées. (A) Pourcentage de viabilité embryonnaire de N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) à 20 °C. (B) Tailles de couvée de N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) à 20 °C . La descendance d’au moins 28 hermaphrodites a été notée pour chaque souche. Le nombre total d’embryons non éclos et de larves marquées était N2 = 6302, him-5(e1490) = 2 945 et spo-11(ok79) = 7 230. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type sur trois répétitions individuelles distinctes. Statistiques calculées à l’aide du test t de Student, n.s. = non significatif, *p < 0,0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Nous présentons ici une méthode générale pour déterminer la viabilité embryonnaire et le nombre total d’embryons produits (couvée) à l’aide de l’organisme modèle C. elegans.

Mesure de la viabilité embryonnaire et de la taille du couvain chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Ce protocole pour déterminer la taille des couvées et la viabilité embryonnaire est utilisé par de nombreux laboratoires de C. elegans. La diminution de la taille brute et de la viabilité embryonnaire peut indiquer des défauts dans des processus de développement importants tels que le myosis, la fécondation et l’embryogenèse. Cette technique fournit des instructions claires pour les chercheurs novices de C.elegans.Il est relativement simple à configurer et à exécuter, et constitue un excellent point de départ lorsque vous travaillez avec de nouvelles souches mutantes. Le plus grand défi pour cette technique est l’identification de l’embryon par rapport à l’embryon non fécondé. Les nouveaux chercheurs devraient pratiquer l’identification des embryons, des ovocytes et des différents stades larvaires avant de commencer ces expériences.Pour commencer, étiquetez le dos de la plaque, transférez un hermaphrodite individuel de l’étage L4 vers le bas dans la plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Laissez les vers se développer en adultes et pondez leur progéniture pendant 24 heures à la température de culture standard de 20 degrés Celsius.Marquez l’assiette le troisième jour. Le lendemain, étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez le jour un ver individuel sur la nouvelle plaque. Laissez les vers pondre des embryons pendant 24 heures à 20 degrés Celsius.Marquez l’assiette le quatrième jour. Le troisième jour, étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez les vers individuels du deuxième jour sur la nouvelle assiette. Laissez les vers pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés.Marquez la plaque le cinquième jour. Dessinez un motif de grille sur un couvercle de 35 millimètres à l’aide d’un marqueur fin. Placez le couvercle quadrillé sous la plaque d’essai pour le comptage afin de garder une trace des vers précédemment comptés.À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos dans le carré individuel. Pour les vers sur les bordures carrées, comptez en fonction de l’emplacement de la tête du ver. Comptez les vers dont la tête touche les bords supérieur et gauche du carré.Notez le nombre de larves vivantes et d’embryons non éclos dans un cahier de laboratoire. Le quatrième jour, marquez la plaque du deuxième jour en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le cinquième jour, marquez la plaque du troisième jour en comptant les larves vivantes et les embryons non éclos, et notez-les dans un cahier de laboratoire.Après avoir étiqueté le dos de la plaque, transférer un ver hermaphrodite L4 individuel sur la plaque. Assurez-vous qu’aucun embryon ou autre ver n’est transféré dans l’assiette. Transférer un seul ver mâle L4 sur la plaque contenant un L quatre hermaphrodites.Laissez les vers s’accoupler et pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés Celsius. Marquez la plaque pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos le troisième jour. Le lendemain, étiquetez un ensemble de nouvelles plaques et transférez l’hermaphrodite et le mâle sur la nouvelle assiette.Assurez-vous que l’hermaphrodite a atteint l’âge adulte. Laissez les hermaphrodites pondre pendant 24 heures à 20 degrés Celsius. Marquez la plaque pour les larves vivantes par rapport aux embryons non éclos le quatrième jour.Le troisième jour, étiquetez un ensemble de nouvelles assiettes et transférez l’hermaphrodite et le mâle sur la nouvelle assiette. Laissez les vers pondre leur progéniture pendant 24 heures à 20 degrés. Marquez l’assiette pour les embryons vivants par rapport aux embryons non éclos le cinquième jour.À l’aide d’un compteur de cellules différentielles, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos dès le premier jour de la plaque et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le quatrième jour, comptez la progéniture vivante et les embryons non éclos de la plaque du deuxième jour et notez-les dans un cahier de laboratoire. Vérifiez l’assiette du premier jour pour les hommes.Si l’accouplement a eu lieu, le rapport génétique attendu des hermaphrodites par rapport aux mâles est de 50 à 50. Si la plaque du premier jour ne contient aucun mâle, l’accouplement entre le mâle et l’hermaphrodite n’a pas eu lieu. Jetez ce couple d’accouplement et notez l’observation dans le cahier de laboratoire.Le cinquième jour, comptez les larves vivantes et les embryons non éclos de la plaque du troisième jour et notez-les dans un cahier de laboratoire. Le test de viabilité embryonnaire pour N2 a donné un pourcentage de viabilité de 98,9%, tandis que him-5 (e1490) et spo-11 (ok79) ont montré une réduction de la viabilité embryonnaire avec un pourcentage de 74,9% et 0,8% respectivement. La taille moyenne des couvées N2, him-5(e1490) et spo-11(ok79) a été déterminée à 217, 105 et 219 respectivement.La reconnaissance des différents stades de développement de C.elegans est importante pour des données précises et reproductibles. Nous vous recommandons de vous familiariser avec le développement des vers à l’aide d’images et d’un microscope à dissection. Cette procédure est une excellente première étape pour déterminer si un gène est impliqué dans un processus de développement et peut être suivie d’analyses cytologiques pour déterminer quel processus est perturbé.

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