Name: measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

העבודה במעבדת Jaramillo-Lambert נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS R35GM142524. כל זני C. elegans סופקו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis , הממומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, P40 OD010440. איור 1D נוצר באמצעות Biorender.com.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת צלחות ניסוי
<ol><li>הכינו צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ עם מדיית בקטו-פפטון (MYOB) של Young Youngren's שונה. כדי להכין צלחות MYOB, הוסף 20 גרם של אגר Bacto, 2 גרם של NaCl, 0.55 גרם של Trizma-HCl, 0.24 גרם של Trizma-OH, 3.1 גרם של פפטון Bacto, ו 1.6 מ"ל של כולסטרול ל 1 L של ddH2O ו autoclave במשך 40 דקות ב 121 ° C. מצננים ל-55 מעלות צלזיוס ובטכניקה סטרילית יוצקים 4 מ"ל מהמדיה המותכת לכל צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. הערה: ליטר MYOB מייצר ~ 250 צלחות, אשר ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. אנו ממליצים על מינימום של 10 פרטים לכל שכפול עם שלוש ערכות שכפול לכל זן.</li>
	<li>בטכניקה סטרילית, זרעו את הצלחות עם נקודה קטנה (כ -50 מיקרוליטר) של חיידקי OP50 במרכז הצלחת. הערה: מדשאות קטנות חשובות במיוחד להערכת הפריה צולבת מכיוון שהנקודה הקטנה יותר מובילה למפגשים מוגברים בין זכרים להרמפרודיטים, ובכך מגדילה את הסיכוי להזדווג.</li>
</ol>2. בדיקות כדאיות עוברית (הפריה עצמית הרמפרודיטית)
<ol><li>יום 1<ol><li>תייגו את גב כל צלחת. הקפידו לעקוב אחר כל צלחת והתולעים המתאימות לה לאורך כל הניסוי. הערה: טכניקת תיוג מועדפת-יום 1: תולעת 1, יום 1: תולעת 2, ... וכו.</li>
		<li>העבירו הרמפרודיט בודד בשלב L4 על כל צלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. אפשרו לתולעים להתפתח למבוגרים ולהניח צאצאים עצמיים במשך 24 שעות בטמפרטורת הגידול הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס. הבקיעו את הצלחות האלה ביום השלישי. הערה: הטמפרטורה של ניסויים יכולה להשתנות במקרה של מוטציות רגישות לטמפרטורה. עבור מוטציות רגישות לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות כדאיות עוברית הן בטמפרטורה המתירנית (15-16 מעלות צלזיוס) והן בטמפרטורה הלא מתירנית (24-26 מעלות צלזיוס).</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>תווית קבוצה של צלחות חדשות-יום 2: תולעת 1, יום 2: תולעת 2, ... וכו.</li>
		<li>העבירו תולעים בודדות ביום הראשון לצלחות החדשות. הערה: תולעים אלה היו צריכות להגיע לבגרות, ותולעים מסוג בר היו צריכות כבר להתחיל להטיל עוברים.</li>
		<li>אפשרו לתולעים להטיל עוברים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או בטמפרטורה מתאימה אחרת. ציון צלחות אלה ביום 4.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 3<ol><li>תייגו קבוצה של לוחות חדשים. יום 3: תולעת 1, יום 3: תולעת 2, ... וכו.</li>
		<li>מעבירים תולעים בודדות ביום 2 לצלחות חדשות. אפשר להם להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 ° C או טמפרטורה מתאימה אחרת. ציון צלחות אלה ביום 5. הערה: במקרים של טמפרטורות נמוכות יותר, זמני הבקיעה יוארכו. התאימו בהתאם.</li>
		<li>ציירו דוגמת רשת על מכסה של 35 מ"מ באמצעות סמן עדין. הניחו את המכסה המרושת מתחת ללוחית הבדיקה לצורך ספירה כדי לעקוב אחר תולעים שנספרו בעבר (איור 1A-B).<ol><li>באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, להבקיע את היום 1 לוחות עבור נוכחות או היעדר צאצאים. ספרו את הזחלים החיים ואת העוברים שלא בקעו. הערה: בשלב זה, חלף מספיק זמן כך שכל עובר בר קיימא היה צריך לבקוע. כל עובר שלא בקע הוא בחזקת מת.</li>
			<li>בתוך ריבוע בודד, ספרו את העוברים שלא בקעו ואת הזחלים החיים שנמצאים לגמרי בתוך הריבוע (איור 1C-F).</li>
			<li>עבור תולעים שנמצאות על הגבולות המרובעים, יש לספור על סמך מיקום ראש התולעת. ספרו תולעים שראשיהן נוגעים בקצה העליון והשמאלי של הריבוע (אין לספור את אלה שנוגעות בקצה התחתון או הימני; איור 1D). אל תספרו ביציות לא מופרות עבור הבדיקה הזו (איור 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 4<ol><li>ציון היום 2 לוחות על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 5<ol><li>ציון היום 3 לוחות על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה. נתח את הנתונים המתקבלים באמצעות השיטה המתוארת בניתוח הנתונים. הערה: לחלק מהמוטנטים הגנטיים עשוי להיות מחזור רבייה מושהה או מורחב. עקוב אחר זנים בודדים להמשך הטלת עוברים מעבר ליום 3 פלטות. אם ייצור העוברים לא הופסק עד היום הרביעי, המשיכו להעביר מבוגרים לצלחות חדשות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מבחני כדאיות עוברית (הפריה צולבת זכרית/הרמפרודיט)
<ol><li>יום 1<ol><li>תייגו את גב כל צלחת. הקפידו לעקוב אחר כל צלחת והתולעים המתאימות לה לאורך כל הניסוי.</li>
		<li>העבירו תולעת הרמפרודיט L4 בודדת לכל צלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. הערה: זנים נשיים, כגון מוטציות אובדן תפקוד של fog-2 , שאינם מייצרים זרע, יכולים לשמש במקום הרמפרודיטים.</li>
		<li>העבירו תולעת זכרית L4 בודדת לכל צלחת מסומנת המכילה הרמפרודיט L4. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. הערה: ניתן להשתמש בזנים כגון זכרים מסוג plg-1 כדי לזהות אם התרחשה הזדווגות, מכיוון שזכרים אלה מפקידים פקק כפייתי על הפות ההרמפרודיטי לאחר ההזדווגות.</li>
		<li>אפשרו לתולעים להזדווג ולהניח צאצאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום השלישי.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>תייגו קבוצה של צלחות חדשות והעבירו את התולעים, כמו ביום השני לעיל. במקרה זה, הקפד להעביר הן את hermaphrodite ואת זכר על לוחות חדשים. ודא כי hermaphrodite הגיע לבגרות.</li>
		<li>אפשר hermaphrodites להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 ° C, או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום 4.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 3<ol><li>תייגו קבוצה של צלחות חדשות והעבירו את התולעים, כמו ביום 3 לעיל. דאגו להעביר גם את ההרמפרודיט וגם את הזכר לצלחות חדשות.</li>
		<li>אפשר להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 °C (75 °F), או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור עוברים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום 5.</li>
		<li>באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, ספור את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום הראשון של הצלחות, כמתואר בשלב 2.3.3.1. הערה: אין להשליך את הצלחות, מכיוון שהן נדרשות ליום 4.</li>
		<li>רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 4<ol><li>ספור את הצאצאים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום 2 פלטות, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.</li>
		<li>בדוק את היום 1 צלחות לזכרים. אם התרחשה הזדווגות, היחס הגנטי הצפוי של הרמפרודיטים לזכרים צריך להיות 50:50. אם צלחות יום 1 אינן מכילות זכרים, ההזדווגות בין הזכר להרמפרודיט לא התרחשה. השליכו את זוג ההזדווגות הזה ותיעדו את התצפית הזו במחברת המעבדה.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 5<ol><li>ספור את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום 3 לוחות, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה. נתח את הנתונים המתקבלים באמצעות השיטות המתוארות בניתוח הנתונים.</li>
	</ol></li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>חישוב אחוז הכדאיות העוברית של העתק ביולוגי נתון של זן באמצעות משוואה (1). הערה: מספר הצאצאים החיים והעוברים שלא בקעו מתקבל על ידי סיכום הספירה היומית לאורך תקופת הניסוי. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>חישוב גודל התולעת לכל תולעת מזן נתון על ידי סיכום מספר הצאצאים (עוברים וזחלים שלא בקעו) המיוצרים על ידי הרמפרודיט ההורה. חשב את גודל הברוד הממוצע באמצעות משוואה (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>דווח על אחוז הכדאיות העוברית וגודל הברוד הממוצע עם הממוצע וסטיית התקן בין ההעתקים הביולוגיים. בצע מבחן t של התלמיד המשווה את נתוני הבקרה והניסוי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis.">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li><li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities:+aneuploidies.">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172 (2008).</li><li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization.">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li><li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li><li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte-to-embryo+transition.">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS.">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li><li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis.">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li><li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis.">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans.">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

ריבוי מינים המתרבים מינית דורש היווצרות של גמטות הפלואידים (כלומר, ביציות וזרע) באמצעות מיוזה, אשר לאחר מכן מאוחדים בעת ההפריה, שחזור מספר הכרומוזום הדיפלואידי והתחלת התפתחות עוברית. טעויות בכל אחד מהתהליכים הללו עלולות להוביל לאי פוריות, קטלניות עוברית ו / או מומים מולדים. C. elegans היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקר רבייה מינית. ניתן להעריך את ההשפעות של מוטציות גנטיות או הפלת ביטוי גנים (למשל, הפרעות RNA) במהירות ובקלות יחסית באמצעות מבחני הכדאיות העוברית ומבחני גודל הברוד שתוארו לעיל. השתמשנו בשיטות אלה לאפיון ראשוני של גנים המעורבים בהפרדת כרומוזומים מיוטיים והפריה/הפעלת ביציות10,11,12. ירידה שנצפתה בכדאיות העוברית או בגודל הברוד מצביעה על הפרעה במיוזה, בגמטוגנזה, בהפריה או באמבריוגנזה.
מכיוון שהכדאיות העוברית וגודל הצאצא מוערכים בקלות יחסית באמצעות ספירת צאצאים וחישוב מתמטי פשוט, אלה הם ניסויי מבוא אופטימליים לטירוני מחקר במעבדה או בכיתה. קלות הגידול של C. elegans והיתרונות הכלכליים הופכים אותם למתאימים במיוחד לשיעורי ביולוגיה ניסויית. הסטודנטים צוברים ניסיון מחקרי רב ערך באמצעות גידול C. elegans , לומדים להשתמש במיקרוסקופים מנתחים, ויכולים לשאול שאלות ביולוגיות במערכת התפתחותית שניתן לענות עליהן בזמן קצר יחסית (כ -5 ימים עם הפרוטוקול המתואר במאמר זה).
העיתוי של ספירת הצאצאים חשוב מאוד לבדיקות כדאיות עוברית. ב 20 ° C, embryogenesis לוקח בערך 16 שעות, ובוגרים רבייה מתחילים להטיל ביצים כ 60 שעות לאחר בקיעה כמו זחלי L1. מכיוון שמחזור החיים מהיר, חשוב לספור את הצאצאים בחלון המתאים, מה שמאפשר מספיק זמן לעוברים לבקוע אך לפני שהצאצאים עצמם מתחילים להטיל ביצים. חשוב גם לציין כי תקופות הצמיחה משתנות בהתאם לטמפרטורה. הצמיחה היא בערך 2.1 פעמים מהר יותר ב 24-25 ° C מאשר 15-16 ° C, וכ 1.3 פעמים מהר יותר ב 20 ° C מאשר 15-16 ° C13. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים שהספירה תתרחש 48 שעות לאחר שהמבוגרים מונחים על צלחת טרייה. מסגרת זמן זו מבטיחה כי לכל העוברים עם התפתחות מסוג בר יש מספיק זמן לבקוע (>16 שעות), אך הם אינם מזדקנים עד לנקודת יכולת הרבייה. ייתכן שיהיה צורך להאריך בדיקות המבוצעות בטמפרטורות נמוכות מ-20 מעלות צלזיוס (להעביר בעלי חיים למשך 4 ימים) כדי שהעוברים יבקעו וכדי שצאצאים שבקעו יגיעו לשלבי זחל שקל יותר לצפות בהם בקרב החיידקים על לוחות MYOB (שלבי L3-L4).
מגבלה במבחני הכדאיות העוברית ובגודל הברוד היא שהתהליך ההתפתחותי הספציפי שמוטרד אינו נראה לעין. עם זאת, בדיקות ראשוניות אלה ניתן לעקוב עם טכניקות ציטולוגיות כדי לקבוע איזה תהליך מושפע. לדוגמה, דיסקציה של התולעים הבוגרות כדי לשחרר את הגונד ואחריה צביעה של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) וניתוח זהיר של מורפולוגיה של DNA בתוך קו הנבט יכולים לגלות אם תהליכים מיוטיים משובשים. בנוסף, צביעת DAPI של עוברים יכולה לחשוף באיזה שלב אמבריוגנזה נעצרת.
לסיכום, תיארנו פרוטוקול להערכת מספר העוברים המיוצרים (brood) ואחוז העוברים שהם ברי קיימא עבור מוטציות שונות של C. elegans. בדיקה זו יכולה לשמש הן להרמפרודיטים המפרים את עצמם והן לצלבים זכריים/הרמפרודיטים. עם מחזור החיים הקצר של C. elegans, פרוטוקול זה יכול להסתיים בתוך פחות משבוע אחד. מבחני כדאיות עוברית וגדלי ברוד יכולים לשמש כאנליזות ראשונות של גנים המעורבים במיוזה, הפריה או התפתחות עוברית, והם פרוטוקולים מתאימים לחוקרים מתקדמים יותר ולטירוני מחקר (סטודנטים לתואר ראשון ושנה א' לתואר שני) כאחד.

רבייה מינית באורגניזמים איקריוטים דורשת ייצור של גמטות פונקציונליות המתמזגות ליצירת עובר בתהליך ההפריה. הגמטות האימהיות והאבהיות, הביציות והזרע נוצרים באמצעות תהליכי חלוקת תאים מיוחדים ותהליכי התמיינות של מיוזה וגמטוגנזה1. מיוזה מתחילה בתא דיפלואידי יחיד ומסתיימת בהיווצרות תאי בת המכילים מחצית ממספר הכרומוזומים של תא ההורים המקורי. החל מהפחתת פלואידיות ועד לדשדוש של חומר גנטי באמצעות מבחר עצמאי ורקומבינציה מוצלבת, מיוזה ממלאת מספר פונקציות חשובות1. טעויות בתוך מיוזה יכולות לגרום לאנאופלואידיה, שבה יש יותר מדי או מעט מדי כרומוזומים בתוך גמטה. למקרים של אנופלואידיה יש השפעות עצומות על בריאות האדם, שכן חוסר איזון כרומוזומלי הוא הגורם העיקרי להפלות והפרעות התפתחותיות כגון תסמונת דאון ותסמונת אדוארדס2.
הפריה היא התהליך שבו הגמטות האימהיות והאבהיות מתמזגות ליצירת אורגניזם חדש3. זיהוי Gamete-gamete הוא הקל על ידי חלבונים על פני הגמטה3. שגיאות בתאימות הגמטה מובילות לאי פוריות מכיוון שאיחוי זרע וביצית אינו מסוגל להמשיך. איחוי זרע עם ביצית מעורר שורה של אירועים המובילים להיווצרות נכונה של עובר פעיל שיכול להתחיל את המסע ההתפתחותי מעובר חד תאי לאורגניזם רב-תאי המתפקד במלואו באמצעות חלוקות מיטוטיות4. במהלך האמבריוגנזה, אירועים מולקולריים המווסתים את ההתפתחות חייבים להיות מוסדרים היטב ומתוזמנים במדויק כדי לאפשר צמיחה תקינה של האורגניזם5. התמיינות תאית נכונה במהלך ההתפתחות המוקדמת היא חיונית כאשר האורגניזם עובר מעובר פלוריפוטנטי לאורגניזם מלא. בשל מורכבותם של אירועים אלה, שיבושים עלולים להוביל למומים התפתחותיים הגורמים לקטלניות עוברית.
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans היא נמטודה שקופה בעלת שני מינים, זכרים והרמפרודיטים. C. elegans hermaphrodites, אשר מסוגלים להפריה עצמית, הם המין השולט 6,7. הגונד ההרמפרודיטי מייצר לראשונה זרע בשלב הזחל הרביעי (L4), המאוחסנים בזרעונים. במעבר L4 לבגרות, קו הנבט עובר לייצור ביציות, אשר מופרות לאחר מכן באמצעות הזרע המאוחסן. זכרים, אשר מתעוררים hermaphrodites בשיעור של פחות מ 0.2%, רק לייצר זרע יכול להזדווג עם hermaphrodites. בהפריה צולבת, הזרע הגברי עולה על הזרע ההרמפרודיטי בהפריית הביציות8. זה מאפשר תחזוקה קלה יחסית של מוטנטים הומוזיגוטיים באמצעות מניות הפריה עצמית ומניפולציות גנטיות באמצעות הצלבות גנטיות. שני המינים מאפשרים מחקרים הבוחנים הבדלים בין מיוזה בקווי נבט זכריים ונקביים. יתר על כן, בשל האופי השקוף של C. elegans וביציותיו, ניתן לחקור את תהליכי המיוזה, הגמטוגנזה, ההפריה והאמבריוגנזה בבעלי חיים חיים ושלמים באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית.
כאשר מנתחים מוטציות חדשות בגנים שעשויות לשחק תפקיד במיוזה, הפריה ו / או התפתחות עוברית ב- C. elegans, צעד ראשון מכריע הוא קביעת הכדאיות העוברית וגודל הצאצא, שכן טעויות בתהליכים אלה מובילות לעתים קרובות לכישלון או לירידה בייצור צאצאים בני קיימא. מאמר זה מתאר פרוטוקול להערכת פוריות, כדאיות העובר וגודל הרבייה מהרמפרודיטים המפרים את עצמם או מהכלאות בין הרמפרודיטים לזכרים. בעוד שבדיקה קלאסית זו שימשה במחקרים רבים של C. elegans , אנו מספקים פרוטוקול סטנדרטי להתקנה וכימות מדויק. בפרוטוקול זה, תולעים בודדות או זוגות זכרים/הרמפרודיטים מבודדים כדי לאפשר הזדווגות ויצירת צאצאים. ייצור צאצאים ויכולת קיום נצפים במשך סדרה של ימים כדי לקבוע את מספר הצאצאים ברי קיימא ועוברים שאינם בני קיימא. בסיום הניסוי מנתחים גזעים בודדים כדי לחשב את אחוז הכדאיות העוברית ואת גודל הברוד הכולל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>T3501</td>
			<td>Semi-stackable, non-vented.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>211677</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>FW 58.440</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans wild type strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>him-5(e1490)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>DR466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spo-11(ok79)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>AV106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential cell counter</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-670-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSoft Excel or Prism</td>
			<td>MicroSoft or GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>For recording and creating graphical representations of data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>PT9901</td>
			<td>For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td>Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick handle</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>TWPH1</td>
			<td>For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans קיימים כהרמפרודיטים המפרים את עצמם, אשר מייצרים צאצאים גדולים - כאשר הזכרים נוכחים, הם יכולים לייצר צאצאים גדולים עוד יותר של צאצאים צולבים. טעויות במיוזה, הפריה ואמבריוגנזה ניתנות להערכה מהירה כפנוטיפים של עקרות, פוריות מופחתת או קטלניות עוברית. מאמר זה מתאר שיטה לקביעת הכדאיות העוברית וגודל הברוד ב- C. elegans. אנו מדגימים כיצד להגדיר בדיקה זו על ידי בחירת תולעת על לוחית בודדת של צעירים מעובדים, רק Bacto-peptone (MYOB), קובעים את מסגרת הזמן המתאימה לספירת צאצאים בני קיימא ועוברים שאינם בני קיימא, ומסבירים כיצד לספור במדויק דגימות תולעים חיות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע כדאיות בהפריה עצמית hermaphrodites כמו גם הפריה הדדית על ידי זוגות הזדווגות. ניסויים פשוטים יחסית אלה ניתנים לאימוץ בקלות עבור חוקרים חדשים, כגון סטודנטים לתואר ראשון וסטודנטים בשנה הראשונה לתואר שני.

ביצענו בדיקות כדאיות עוברית וגודל ברוד על N2 (סוג פראי) ועל שני זנים בעלי מוטציות בגנים המעורבים במיוזה, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79). מכיוון שגם HIM-5 וגם SPO-11 ממלאים תפקיד בהיווצרות הצלבה מיוטית, מוטציות בשני גנים אלה גורמות להיווצרות גמטות אנאופלואידיות. בדיקת כדאיות עוברית זו עבור N2 הניבה אחוז כדאיות של 98.9%, בעוד שגם HIM-5 (e1490) וגם spo-11(ok79) הראו ירידה בכדאיות הצאצאים עם אחוזים של 74.9% ו-0.8%, בהתאמה (איור 2A; עמ' < 0.0005). תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם תוצאותשפורסמו בעבר 7,9. גודל הברוד הממוצע של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) נקבע כ-217, 105 ו-219, בהתאמה (איור 2B). בהתאם לפרסומים קודמים, ל-him-5 (e1490) יש גודל קטן משמעותית בהשוואה לסוג הבר, בעוד ש-spo-11(ok79) אינו 7,9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> איור 1: הדגמה של מערך ספירה ומורפולוגיה של עוברים על לוחות . (A) תמונה של מכסה עם תבנית רשת צולבת שצוירה באמצעות שארפ עדין. (B) לוחית MYOB בקוטר 35 מ"מ עם מכסה עם דוגמה מתחתיה לצורך ספירה. (C) תמונה המדגימה שדה ראייה בהגדלה נמוכה (10x) המציג תיבות מרובות של הרשת. ראשי חץ לבנים מצביעים על כמה זחלים בתוך שדה ראייה זה. הספירה צריכה להיעשות בהגדלה גבוהה יותר (רק ריבוע אחד בשדה) כדי לצפות הן בזחלים והן בעוברים. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. (D) קריקטורה של המכסה עם תבנית הרשת הממוקמת מתחת ללוח 35 מ"מ. הכניסה מציינת את הטכניקה הנכונה כדי לקבוע אילו זחלים נספרים בריבוע נתון. ספירה מלמעלה למטה, משמאל לימין. ספרו את כל התולעים שנמצאות לגמרי בתוך הריבוע. יש לספור תולעים הנוגעות בגבול על פי מיקום ראש התולעת, ולא הזנב. ספירת תולעים הפונות לרשת הנוכחית או רשתות שנספרו בעבר (כלומר, קצה עליון וקצה שמאלי). אין לספור תולעים עם ראשים הנוגעים בקצוות התחתונים או הימניים. מההתחלה, תולעים כחולות ייספרו ואילו תולעים אדומות לא. (E) תמונה מייצגת של זחלים בריאים N2 L1 שבקעו (ראש חץ לבן). (F) תמונה מייצגת של ביצית לא מופרית (ראש חץ שחור) ועובר שלא בקע (ראש חץ אדום). ביציות לא מופרות לא צריך להיספר עבור בדיקה זו. פסי קנה מידה (E,F) = (100 מיקרומטר). הערה: התמונות ב-C, E ו-F צולמו במיקרוסקופ Zeiss AxioZoom, עם מצלמה מחוברת לצורך הדגמת המראה של זחלים, עוברים וביציות על לוחות תולעים. עבור בדיקות כדאיות עוברית, הספירה נעשית תוך התבוננות בלוחות באמצעות סטריאומיקרוסקופ (ללא מצלמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> איור 2: גרפים מייצגים המתארים את התוצאות של מבחני כדאיות עובריים וגדלי ברוד. (A) אחוז הכדאיות העוברית של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) ב-20°C. (B) גדלי Brood של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) ב-20°C . צאצאיהם של לפחות 28 הרמפרודיטים הובקעו עבור כל זן. המספר הכולל של עוברים שלא בקעו בתוספת זחלים שנבדקו היו N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945, ו- spo-11(ok79) = 7,230. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן על-פני שלושה עותקים משוכפלים נפרדים. סטטיסטיקה מחושבת באמצעות מבחן t של תלמיד, n.s. = לא מובהק, *p < 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

פרוטוקול זה לקביעת גודל הגזע והכדאיות העוברית משמש מעבדות רבות של C.elegans. ירידה בגודל הגבורה וביכולת הקיום העוברית יכולה להצביע על פגמים בתהליכים התפתחותיים חשובים כגון מיוזה, הפריה ואמבריוגנזה. טכניקה זו מספקת הוראות ברורות לחוקרי C.elegans מתחילים.הוא פשוט יחסית להתקנה ולביצוע, ומהווה נקודת התחלה מצוינת בעבודה עם זנים מוטנטיים חדשים. האתגר הגדול ביותר בטכניקה זו הוא זיהוי עובר לעומת זיהוי עובר לא מופרי. חוקרים חדשים צריכים לתרגל את זיהוי העוברים, הביציות ושלבי הזחל השונים לפני תחילת ניסויים אלה.כדי להתחיל, תייגו את גב הצלחת, העבירו הרמפרודיט בודד בשלב L4 אל הצלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. אפשרו לתולעים להתפתח למבוגרים ולהניח צאצאים עצמיים במשך 24 שעות בטמפרטורת הרבייה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס.הבקיעו את הצלחת ביום השלישי. למחרת, תייגו סט של צלחות חדשות והעבירו את היום שבו תולעת בודדת אחת לצלחת החדשה. אפשרו לתולעים להטיל עוברים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.הבקיעו את הצלחת ביום הרביעי. ביום השלישי, תייגו סט של צלחות חדשות והעבירו את היום השני של תולעים בודדות לצלחת החדשה. אפשרו לתולעים להניח צאצאים במשך 24 שעות ב-20 מעלות.הבקיעו את הצלחת ביום החמישי. ציירו דוגמת רשת על מכסה של 35 מ"מ בעזרת טוש עדין. הניחו את המכסה המרושת מתחת ללוחית הבדיקה לצורך ספירה כדי לעקוב אחר תולעים שנספרו בעבר.באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, ספרו את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו בתוך הריבוע הבודד. עבור תולעים על גבולות ריבוע לספור מבוסס על המיקום של ראש התולעת. ספרו תולעים עם ראשים שנוגעים בקצה העליון והשמאלי של הריבוע.רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה. ביום הרביעי, הניחו את היום השני על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו ורשמו אותם במחברת מעבדה. ביום החמישי, הניקוד את היום השלישי על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו, ורשום אותם במחברת מעבדה.לאחר תיוג גב הצלחת, העבירו תולעת הרמפרודיט L4 בודדת לצלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. מעבירים תולעת זכרית L4 בודדת לצלחת המכילה הרמפרודיט L ארבע.אפשרו לתולעים להזדווג ולהניח צאצאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הניקוד את הצלחת עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום השלישי. למחרת, תייגו סט של צלחות חדשות והעבירו את ההרמפרודיט והזכר לצלחת החדשה.ודא כי hermaphrodite הגיע לבגרות. אפשרו להרמפרודיטים להניח צאצאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הניקוד את הצלחת עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום הרביעי.ביום השלישי, תייגו סט של צלחות חדשות והעבירו את ההרמפרודיט והזכר לצלחת החדשה. אפשרו לתולעים להניח צאצאים במשך 24 שעות ב-20 מעלות. הניקוד את הצלחת עבור עוברים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום החמישי.באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, ספרו את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום הראשון ורשמו אותם במחברת מעבדה. ביום הרביעי, ספרו את הצאצאים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום השני ורשמו אותם במחברת מעבדה. בדוק את היום צלחת אחת לזכרים.אם התרחשה הזדווגות, היחס הגנטי הצפוי של הרמפרודיטים לזכרים הוא 50 עד 50. אם ביום צלחת אחת אין זכרים, לא התרחשה הזדווגות בין הזכר להרמפרודיט. השליכו את זוג ההזדווגות הזה ותיעדו את התצפית במחברת המעבדה.ביום החמישי, ספרו את הזחלים החיים ואת העוברים שלא בקעו מהיום השלישי ורשמו אותם במחברת מעבדה. בדיקת הכדאיות העוברית עבור N2 הניבה אחוז כדאיות של 98.9%, בעוד שגם הוא-5 (e1490) וגם spo-11(ok79) הראו ירידה בכדאיות העוברית עם אחוזים של 74.9% ו-0.8% בהתאמה. גודל הברוד הממוצע של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) נקבע כ-217, 105 ו-219 בהתאמה.הכרת השלבים השונים של פיתוח C.elegans חשובה לנתונים מדויקים וניתנים לשחזור. מומלץ להכיר את התפתחות התולעים באמצעות תמונות ומיקרוסקופ מנתח. הליך זה הוא צעד ראשון נהדר כדי לקבוע אם גן מעורב בתהליך התפתחותי והוא יכול להיות ואחריו ניתוחים ציטולוגיים כדי לקבוע איזה תהליך משובש.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size LEfSe in Microbiome Data

בחירה בסיוע של סמנים ביולוגיים לפי גודל אפקט ניתוח מפלה ליניארי (LEfSe) בנתוני מיקרוביום

There is growing attention toward closed biological genomes in the environment and in health. To explore and reveal the intergroup differences among ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...