Name: measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Jaramillo-Lambert laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri NIGMS R35GM142524 tarafından desteklenmektedir. Tüm C. elegans suşları , Ulusal Sağlık Enstitüleri, P40 OD010440 tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Şekil 1D , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.
1. Deney plakalarının hazırlanması
<ol><li>Modifiye Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) ortamı ile 35 mm çapında Petri yemekleri hazırlayın. MYOB plakaları yapmak için, 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0.55 g Trizma-HCl, 0.24 g Trizma-OH, 3.1 g Bacto pepton ve 1.6 mL kolesterolü 1 L ddH2O'ya ve 121 ° C'de 40 dakika boyunca otoklav ekleyin. 55 ° C'ye soğumaya bırakın ve steril teknik kullanarak, her 35 mm Petri kabına 4 mL erimiş ortam dökün. NOT: Bir litre MYOB, 6 aya kadar 4 ° C'de saklanabilen ~ 250 plaka yapar. Her suş için üç replika kümesi ile replika başına en az 10 birey öneririz.</li>
	<li>Steril tekniği kullanarak, plakaları plakanın ortasında küçük bir nokta (yaklaşık 50 μL) OP50 bakterisi ile tohumlayın. NOT: Küçük çimler, çapraz döllenmeyi değerlendirmek için özellikle önemlidir, çünkü daha küçük nokta erkekler ve hermafroditler arasında daha fazla karşılaşmaya yol açar, böylece çiftleşme şansını arttırır.</li>
</ol>2. Embriyonik canlılık testleri (hermafrodit kendi kendine döllenme)
<ol><li>1. Gün<ol><li>Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun. NOT: Tercih edilen etiketleme tekniği-Gün 1: solucan 1, Gün 1: solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>Her plakaya ayrı bir L4 evre hermafrodit aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 ° C'lik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi kendine soy bırakmayın. Bu plakaları 3. günde puanlayın. NOT: Deneylerin sıcaklığı, sıcaklığa duyarlı mutasyonlar durumunda değiştirilebilir. Sıcaklığa duyarlı mutasyonlar için, embriyonik canlılık testleri hem izin verilen (15-16 ° C) hem de izin verilmeyen sıcaklıklarda (24-26 ° C) yapılmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin-Gün 2: solucan 1, Gün 2: solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>1. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın. NOT: Bu solucanlar yetişkinliğe ulaşmış olmalı ve vahşi tip solucanlar embriyo bırakmaya çoktan başlamış olmalıdır.</li>
		<li>Solucanların 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca embriyo bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin. 3. Gün: Solucan 1. Gün, 3. Gün: Solucan 2, ... ve saire.</li>
		<li>2. gün bireysel solucanları yeni plakalara aktarın. 20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca soy bırakmalarına izin verin. Bu plakaları 5. günde puanlayın. NOT: Düşük sıcaklıklarda, kuluçka süreleri artacaktır. Buna göre ayarlayın.</li>
		<li>İnce bir işaretleyici kullanarak 35 mm'lik bir kapak üzerine bir ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin (Şekil 1A-B).<ol><li>Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, döllerin varlığı veya yokluğu için 1. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayın. NOT: Bu noktada, herhangi bir canlı embriyonun yumurtadan çıkması gereken yeterli bir süre geçmiştir. Yumurtadan çıkmamış embriyoların öldüğü varsayılır.</li>
			<li>Tek bir kare içinde, tamamen kare içinde bulunan yumurtadan çıkmamış embriyoları ve canlı larvaları sayın (Şekil 1C-F).</li>
			<li>Kare kenarlıklarda bulunan solucanlar için, solucan kafasının konumuna göre sayın. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın (alt veya sağ kenarlara dokunanları saymayın; Şekil 1D). Bu tahlil için döllenmemiş oositleri saymayın (Şekil 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 2. gün plakalarını puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>5. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak 3. günü puanlayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemi kullanarak elde edilen verileri analiz edin. NOT: Bazı genetik mutantlar gecikmiş veya genişlemiş üreme döngüsüne sahip olabilir. 3. gün plakalarının ötesinde embriyoların devam eden döşemesi için bireysel suşları izleyin. Embriyo üretimi 4. güne kadar durmadıysa, yetişkinleri yeni plakalara aktarmaya devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Embriyonik canlılık testleri (erkek / hermafrodit çapraz döllenme)
<ol><li>1. Gün<ol><li>Her plakanın arkasını etiketleyin. Deney boyunca her plakayı ve ilgili solucanları takip ettiğinizden emin olun.</li>
		<li>Her plakaya ayrı bir L4 hermafrodit solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. NOT: Sperm üretmeyen fog-2 fonksiyon kaybı mutantları gibi dişileştirilmiş suşlar, hermafroditlerin yerine kullanılabilir.</li>
		<li>L4 hermafrodit içeren her etiketli plakaya tek bir L4 erkek solucanı aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. NOT: Plg-1 varyantı erkekler gibi suşlar, çiftleşmenin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için kullanılabilir, çünkü bu erkekler çiftleşmeden sonra hermafrodit vulva üzerinde bir çiftleşme tıkacı biriktirir.</li>
		<li>Solucanların çiftleşmesine ve 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 3. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 2. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Bu durumda, hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun. Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun.</li>
		<li>Hermafroditlerin 20 ° C'de 24 saat boyunca veya başka bir uygun sıcaklıkta soy bırakmasına izin verin. Bu plakaları 4. günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için puanlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve yukarıdaki 3. günde olduğu gibi solucanları aktarın. Hem hermafroditi hem de erkeği yeni plakalara aktardığınızdan emin olun.</li>
		<li>20 ° C'de veya başka bir uygun sıcaklıkta 24 saat boyunca döl bırakmasına izin verin. Bu plakaları 5. günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için puanlayın.</li>
		<li>Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 1. gün plakalarından sayın. NOT: 4. gün için gerekli oldukları için plakaları atmayın.</li>
		<li>Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, canlı soyu ve yumurtadan çıkmamış embriyoları 2. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin.</li>
		<li>Erkekler için gün 1 plakalarını kontrol edin. Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50:50 olmalıdır. 1. gün plakaları herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme meydana gelmemiştir. Bu çiftleşme çiftini atın ve bu gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>5. Gün<ol><li>Canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları, adım 2.3.3.1'de açıklandığı gibi, 3. gün plakalarından sayın. Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Veri analizinde açıklanan yöntemleri kullanarak elde edilen verileri analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Denklemi kullanarak bir suşun belirli bir biyolojik kopyasının embriyonik canlılık yüzdesini hesaplayın (1). NOT: Canlı soy ve yumurtadan çıkmamış embriyo sayıları, deney dönemi boyunca günlük sayımın toplamı ile elde edilir. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Ana hermafrodit tarafından üretilen döl sayısını (yumurtadan çıkmamış embriyolar ve larvalar) toplayarak belirli bir suşun solucanı başına yavru boyutunu hesaplayın. Denklemi kullanarak ortalama yavru boyutunu hesaplayın (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
	<li>Embriyonik canlılık yüzdesini ve ortalama yavru büyüklüğünü, biyolojik replikalar arasındaki ortalama ve standart sapma ile raporlayın. Kontrol ve deneysel verileri karşılaştıran Student'ın t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis.">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li><li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities:+aneuploidies.">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172 (2008).</li><li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization.">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li><li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans.">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li><li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oocyte-to-embryo+transition.">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS.">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li><li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis.">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li><li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis.">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans.">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li></ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Cinsel olarak üreyen türlerin çoğalması, mayoz yoluyla haploid gametlerin (yani yumurta ve sperm) oluşumunu gerektirir, bunlar daha sonra döllenmede birleştirilir, diploid kromozom sayısını geri kazandırır ve embriyonik gelişimi başlatır. Bu süreçlerden herhangi birindeki hatalar kısırlığa, embriyonik ölümcüllüğe ve / veya doğum kusurlarına yol açabilir. C. elegans, cinsel üremeyi incelemek için güçlü bir model sistemdir. Gen mutasyonlarının veya gen ekspresyonunun nakavtının (örneğin, RNA girişimi) etkileri, yukarıda açıklanan embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri kullanılarak nispeten hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilebilir. Bu yöntemleri, mayotik kromozom ayrışması ve döllenme/yumurta aktivasyonu10,11,12 ile ilgili genlerin ilk karakterizasyonu için kullandık. Embriyonik canlılıkta veya yavru boyutunda gözlenen bir azalma, mayoz, gametogenez, döllenme veya embriyogenezde bir bozulma olduğunu gösterir.
Embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma, soy sayımı ve basit bir matematiksel hesaplama yoluyla nispeten kolay bir şekilde değerlendirildiğinden, bunlar laboratuvarda veya sınıfta araştırma acemileri için en uygun giriş deneyleridir. C. elegans yetiştiriciliğinin kolaylığı ve ekonomik avantajları, onları deneysel biyoloji dersleri için özellikle uygun hale getirmektedir. Öğrenciler C. elegans hayvancılığı yoluyla değerli araştırma deneyimi kazanırlar, diseksiyon mikroskoplarını kullanmayı öğrenirler ve gelişimsel bir sistemde nispeten kısa sürede (bu makalede açıklanan protokolle yaklaşık 5 gün) cevaplanabilecek biyolojik sorular sorabilirler.
Embriyonik canlılık testleri için soy sayımlarının zamanlaması çok önemlidir. 20 ° C'de, embriyogenez yaklaşık 16 saat sürer ve üreme açısından olgun yetişkinler, L1 larvaları olarak yumurtadan çıktıktan yaklaşık 60 saat sonra yumurta bırakmaya başlar. Yaşam döngüsü hızlı olduğu için, embriyoların yumurtadan çıkması için yeterli zamana izin veren, ancak döllerin kendileri yumurta bırakmaya başlamadan önce uygun pencerede dölleri saymak önemlidir. Büyüme dönemlerinin sıcaklığa bağlı olarak değiştiğini de belirtmek önemlidir. Büyüme, 24-25 °C'de 15-16 °C'den yaklaşık 2,1 kat daha hızlıdır ve 20 °C'de 15-16°C'den yaklaşık 1,3 kat daha hızlıdır. Bu protokolde, yetişkinler taze bir tabağa yerleştirildikten 48 saat sonra sayımların yapılmasını öneririz. Bu zaman dilimi, vahşi tip gelişime sahip tüm embriyoların yumurtadan çıkmak için yeterli zamana (>16 saat) sahip olmasını, ancak üreme kabiliyeti noktasına kadar yaşlanmamasını sağlar. 20 ° C'den düşük sıcaklıklarda yapılan testlerin, embriyoların yumurtadan çıkması ve yumurtadan çıkan döllerin MYOB plakalarındaki bakteriler arasında gözlemlenmesi daha kolay olan larva aşamalarına (L3-L4 aşamaları) ulaşması için uzatılması (4 gün boyunca hayvanları transfer etmek) gerekebilir.
Embriyonik canlılık tahlilleri ve yavru boyutlandırma ile ilgili bir sınırlama, bozulan spesifik gelişimsel sürecin kolayca belirgin olmamasıdır. Bununla birlikte, bu ilk tahliller, hangi sürecin etkilendiğini belirlemek için sitolojik tekniklerle takip edilebilir. Örneğin, gonadı serbest bırakmak için yetişkin solucanların diseksiyonu, ardından 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyaması ve germ hattı içindeki DNA morfolojisinin dikkatli bir şekilde analiz edilmesi, mayotik süreçlerin bozulup bozulmadığını ortaya çıkarabilir. Ek olarak, embriyoların DAPI boyaması, embriyogenezin hangi aşamada durduğunu ortaya çıkarabilir.
Sonuç olarak, üretilen embriyo sayısını (yavru) ve çeşitli C. elegans mutantları için uygun embriyoların yüzdesini belirlemek için bir protokol tanımladık. Bu tahlil hem kendi kendine döllenen hermafroditler hem de erkek / hermafrodit haçları için kullanılabilir. C. elegans'ın kısa yaşam döngüsü ile bu protokol 1 haftadan daha kısa sürede tamamlanabilir. Embriyonik canlılık testleri ve yavru boyutları, mayoz, döllenme veya embriyonik gelişimde rol oynayan genlerin ilk analizleri olarak kullanılabilir ve daha gelişmiş araştırmacılar ve araştırma acemileri (lisans ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri) için uygun protokollerdir.

Ökaryotik organizmalarda cinsel üreme, döllenme süreci boyunca bir embriyo oluşturmak için birleşen fonksiyonel gametlerin üretimini gerektirir. Maternal ve paternal gametler, yumurta (yumurtalar) ve sperm, mayoz ve gametogenezin özelleşmiş hücre bölünmesi ve farklılaşma süreçleri yoluyla oluşturulur1. Mayoz, tek bir diploid hücre ile başlar ve orijinal ebeveyn hücrenin kromozom sayısının yarısını içeren yavru hücrelerin oluşumu ile sona erer. Ploidinin azaltılmasından, genetik materyalin bağımsız ürün çeşitliliği ve çapraz rekombinasyon yoluyla karıştırılmasına kadar, mayoz birçok önemli fonksiyona hizmet eder1. Mayoz içindeki hatalar, bir gamet içinde çok fazla veya çok az kromozom bulunan anöploidi ile sonuçlanabilir. Anöploidi insidansı insan sağlığı üzerinde muazzam etkilere sahiptir, çünkü kromozomal dengesizlikler düşüklerin ve Down sendromu ve Edwards sendromu gibi gelişimsel bozuklukların önemli bir nedenidir2.
Döllenme, anne ve baba gametlerinin yeni bir organizma oluşturmak için kaynaştığı süreçtir3. Gamet-gamet tanıma, gamet yüzeyindeki proteinler tarafından kolaylaştırılır3. Gamet uyumluluğu ile ilgili hatalar, sperm ve yumurta füzyonu ilerleyemediği için infertiliteye yol açar. Spermin bir oosit ile füzyonu, tek hücreli bir embriyodan mitotik bölünmeler yoluyla tamamen işlevsel çok hücreli bir organizmaya gelişimsel yolculuğa başlayabilen aktif bir embriyonun doğru oluşumuna yol açan bir dizi olayı tetikler4. Embriyogenez boyunca, gelişimi düzenleyen moleküler olaylar, organizmanın düzgün büyümesini sağlamak için sıkı bir şekilde düzenlenmeli ve hassas bir şekilde zamanlanmalıdır5. Erken gelişim sırasında uygun hücresel farklılaşma, organizma pluripotent bir embriyodan tam teşekküllü bir organizmaya geçerken çok önemlidir. Bu olayların karmaşıklığı nedeniyle, bozulmalar embriyonik ölümcüllükle sonuçlanan gelişimsel kusurlara yol açabilir.
Caenorhabditis elegans, mayoz, döllenme ve embriyonik gelişimi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans, erkek ve hermafrodit olmak üzere iki cinsiyeti olan şeffaf bir nematoddur. Kendi kendine döllenme yeteneğine sahip olan C. elegans hermafroditleri, baskın cinsiyettir 6,7. Hermafrodit gonad ilk olarak spermatheca'da depolanan dördüncü larva (L4) aşamasında sperm üretir. L4'ten yetişkinliğe geçişte, germ hattı oosit üretmeye geçer ve bunlar daha sonra depolanan sperm yoluyla döllenir. Hermafroditlerde% 0.2'den daha az bir oranda ortaya çıkan erkekler sadece sperm üretir ve hermafroditlerle çiftleşebilir. Çapraz döllenme üzerine, erkek spermi, oositlerin döllenmesinde hermafrodit spermini geride bırakır8. Bu, homozigot mutantların kendi kendine döllenen stoklar yoluyla nispeten kolay bir şekilde korunmasına ve genetik haçlar yoluyla genetik manipülasyonlara izin verir. İki cinsiyet, erkek ve dişi germ hatlarındaki mayoz arasındaki farkları araştıran çalışmalara izin verir. Ayrıca, C. elegans ve yumurtalarının şeffaf doğası nedeniyle, mayoz, gametogenez, döllenme ve embriyogenez süreçleri, floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak canlı, sağlam hayvanlarda incelenebilir.
C. elegans'ta mayoz, döllenme ve / veya embriyonik gelişimde rol oynayabilecek genlerdeki yeni mutasyonları analiz ederken, çok önemli bir ilk adım, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemektir, çünkü bu süreçlerdeki hatalar genellikle canlı döl üretiminde bir başarısızlığa veya azalmaya yol açar. Bu yazıda, kendi kendine döllenen hermafroditlerden veya hermafroditler ile erkekler arasındaki çaprazlardan doğurganlığı, embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü değerlendirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu klasik tahlil birçok C. elegans çalışmasında kullanılmış olsa da, kurulum ve doğru niceleme için standartlaştırılmış bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, çiftleşme ve soy üretimine izin vermek için bireysel solucanlar veya erkek / hermafrodit çiftleri izole edilir. Döl üretimi ve canlılığı, canlı soy ve canlı olmayan embriyoların sayısını belirlemek için bir dizi gün boyunca gözlemlenir. Deneyin sonunda, embriyonik canlılık yüzdesini ve toplam yavru boyutunu hesaplamak için bireysel yavrular analiz edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>T3501</td>
			<td>Semi-stackable, non-vented.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>211677</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholestrol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C8503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>FW 58.440</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>For MYOB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans wild type strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>him-5(e1490)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>DR466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spo-11(ok79)</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>AV106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential cell counter</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-670-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSoft Excel or Prism</td>
			<td>MicroSoft or GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>For recording and creating graphical representations of data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>platinum wire</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>PT9901</td>
			<td>For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-745</td>
			<td>Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>worm pick handle</td>
			<td>Tritech research</td>
			<td>TWPH1</td>
			<td>For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring embryonic viability and brood size in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans , mayoz, döllenme ve embriyonik gelişim çalışmaları için mükemmel bir model organizmadır. C. elegans , büyük yavru yavruları üreten kendi kendine döllenen hermafroditler olarak bulunur - erkekler mevcut olduğunda, daha büyük çapraz soy yavruları üretebilirler. Mayoz, döllenme ve embriyogenezdeki hatalar hızla sterilitenin fenotipleri, azalmış doğurganlık veya embriyonik ölümcüllük olarak değerlendirilebilir. Bu makalede, C. elegans'ta embriyonik canlılığı ve yavru büyüklüğünü belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bireysel bir Modifiye Youngren'ın, Sadece Bakto-pepton (MYOB) plakasına bir solucan toplayarak bu tahlilin nasıl kurulacağını gösteriyoruz, canlı soy ve canlı olmayan embriyoları saymak için uygun zaman dilimini oluşturuyoruz ve canlı solucan örneklerinin nasıl doğru bir şekilde sayılacağını açıklıyoruz. Bu teknik, kendi kendine döllenen hermafroditlerde canlılığı ve çiftleşme çiftleriyle çapraz döllenmeyi belirlemek için kullanılabilir. Bu nispeten basit deneyler, lisans öğrencileri ve birinci sınıf lisansüstü öğrencileri gibi yeni araştırmacılar için kolayca benimsenebilir.

N2 (vahşi tip) ve mayozda rol oynayan genlerde mutasyon barındıran iki suş, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) üzerinde embriyonik canlılık ve yavru boyutlandırma testleri yaptık. Hem him-5 hem de spo-11 mayotik çaprazlama oluşumunda rol oynadığından, bu iki gendeki mutasyonlar anöploid gametlerin oluşumuna neden olur. N2 için yapılan bu embriyonik canlılık testi, %98,9'luk bir canlılık yüzdesi sağlarken, hem him-5(e1490) hem de spo-11(ok79), sırasıyla %74,9 ve %0,8'lik bir yüzdeyle soy canlılığında bir azalma göstermiştir (Şekil 2A; p < 0.0005). Bu sonuçlar daha önce yayınlanmış sonuçlarla tutarlıdır 7,9. Ortalama yavru büyüklüğü N2, him-5(e1490) ve spo-11(ok79) sırasıyla 217, 105 ve 219 olarak belirlenmiştir (Şekil 2B). Önceki yayınlarla tutarlı olarak, him-5 (e1490) vahşi tipe kıyasla önemli ölçüde azaltılmış bir yavru boyutuna sahipken, spo-11 (ok79) 7,9 değildir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> Şekil 1: Plakalar üzerinde sayım düzeneğinin ve embriyo morfolojisinin gösterilmesi . (A) İnce bir keskinlik kullanılarak çizilmiş çapraz taranmış ızgara desenli bir kapağın görüntüsü. (B) Sayım için altında desenli kapağı olan 35 mm'lik bir MYOB plakası. (C) Izgaranın birden fazla kutusunu gösteren düşük büyütmeli (10x) görüş alanını gösteren görüntü. Beyaz ok uçları bu görüş alanındaki birkaç larvaya işaret eder. Sayım, hem larvaları hem de embriyoları gözlemlemek için daha yüksek bir büyütmede (alanda sadece bir kare) yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. (D) 35 mm'lik bir plakanın altına yerleştirilmiş ızgara desenli kapağın karikatürü. İç kısım, belirli bir karede hangi larvaların sayıldığını belirlemek için uygun tekniği gösterir. Yukarıdan aşağıya, soldan sağa sayın. Tamamen meydanın içinde olan solucanları sayın. Sınıra dokunan solucanlar, kuyruğun değil, solucan başının konumuna göre sayılmalıdır. Geçerli ızgaraya bakan solucanları veya daha önce sayılan ızgaraları (yani, üst ve sol kenarları) sayın. Kafaları alt veya sağ kenarlara değen solucanları saymayın. Girişten itibaren mavi solucanlar sayılırken, kırmızı solucanlar sayılmayacaktır. (E) Sağlıklı N2 L1 yumurtadan çıkmış larvaların temsili görüntüsü (beyaz ok ucu). (F) Döllenmemiş bir oositin (siyah ok ucu) ve yumurtadan çıkmamış bir embriyonun (kırmızı ok ucu) temsili görüntüsü. Döllenmemiş oositler bu tahlil için sayılmamalıdır. Ölçek çubukları (E,F) = (100 μm). Not: C, E ve F'deki görüntüler, solucan plakaları üzerindeki larvaların, embriyoların ve oositlerin görünümünü göstermek amacıyla takılı bir kamera ile bir Zeiss AxioZoom mikroskobu ile çekilmiştir. Embriyonik canlılık testleri için, plakaları bir stereomikroskop (kamera olmadan) kullanarak gözlemlerken sayımlar yapılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> Şekil 2: Embriyonik canlılık tahlillerinden ve yavru boyutlarından elde edilen sonuçları gösteren temsili grafikler. (A) 20 °C'de N2, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) embriyonik canlılık yüzdesi. (B) 20 °C'de N2, him-5 (e1490) ve spo-11 (ok79) yavru boyutları . Her suş için en az 28 hermafroditin soyu puanlandı. Toplam yumurtadan çıkmamış embriyo sayısı artı atılan larva sayısı N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2.945 ve spo-11 (ok79) = 7.230 idi. Hata çubukları, üç ayrı çoğaltmadaki standart sapmayı gösterir. İstatistikler Student's t-testi kullanılarak hesaplanmıştır, n.s. = not meaning, *p < 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Burada, C. elegans model organizmasını kullanarak embriyonik canlılığı ve üretilen toplam embriyo sayısını (kuluçka) belirlemek için genel bir yöntem sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Yavru büyüklüğünü ve embriyonik canlılığı belirlemek için kullanılan bu protokol birçok C.elegans laboratuvarı tarafından kullanılmaktadır. Kaba boyut ve embriyonik canlılıktaki azalmalar, miyoz, döllenme ve embriyogenez gibi önemli gelişimsel süreçlerdeki kusurları gösterebilir. Bu teknik, acemi C.elegans araştırmacıları için açık talimatlar sağlar.Kurulumu ve yürütülmesi nispeten basittir ve yeni mutant suşlarla çalışırken harika bir başlangıç noktasıdır. Bu teknik için en büyük zorluk, embriyoya karşı döllenmemiş embriyo tanımlamasıdır. Yeni araştırmacılar, bu deneylere başlamadan önce embriyoların, oositlerin ve farklı larva aşamalarının tanımlanması için pratik yapmalıdır.Başlamak için, plakanın arkasını etiketleyin, ayrı bir L4 aşamalı hermafroditi plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Solucanların yetişkinlere dönüşmesine izin verin ve 20 santigrat derecelik standart kültür sıcaklığında 24 saat boyunca kendi soylarını bırakın.Plakayı üçüncü günde puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve bir günlük solucanı yeni plakaya aktarın. Solucanların embriyoları 20 santigrat derecede 24 saat boyunca bırakmalarına izin verin.Plakayı dördüncü günde puanlayın. Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve ikinci gün bireysel solucanları yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin.Plakayı beşinci günde puanlayın. İnce bir işaretleyici kullanarak 35 milimetrelik bir kapak üzerine ızgara deseni çizin. Daha önce sayılan solucanları takip etmek için ızgaralı kapağı sayım için test plakasının altına yerleştirin.Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bireysel kare içinde sayın. Kare kenarlıklardaki solucanlar için solucan kafasının konumuna göre sayılır. Kafaları karenin üst ve sol kenarlarına dokunan solucanları sayın.Canlı larvaların ve yumurtadan çıkmamış embriyoların sayısını bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak ikinci gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları sayarak üçüncü gün plakasını puanlayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin.Plakanın arkasını etiketledikten sonra, tek bir L4 hermafrodit solucanını plakaya aktarın. Embriyo veya diğer solucanların plakaya transfer edilmediğinden emin olun. Tek bir L4 erkek solucanını bir L dört hermafrodit içeren plakaya aktarın.Solucanların çiftleşmesine ve 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Üçüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın. Ertesi gün, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın.Hermafroditin yetişkinliğe ulaştığından emin olun. Hermafroditlerin 20 santigrat derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Dördüncü günde yumurtadan çıkmamış embriyolara karşı canlı larvalar için plakayı puanlayın.Üçüncü günde, bir dizi yeni plakayı etiketleyin ve hermafrodit ve erkeği yeni plakaya aktarın. Solucanların 20 derecede 24 saat boyunca soy bırakmasına izin verin. Beşinci günde canlı ve yumurtadan çıkmamış embriyolar için plakayı puanlayın.Bir diferansiyel hücre sayacı kullanarak, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları bir plakadan itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Dördüncü günde, canlı soyları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları ikinci gün plakasından sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. Erkekler için bir gün tabağı kontrol edin.Çiftleşme meydana gelmişse, hermafroditlerin erkeklere beklenen genetik oranı 50 ila 50'dir. Bir gün plaka herhangi bir erkek içermiyorsa, erkek ve hermafrodit arasında çiftleşme gerçekleşmedi. Bu çiftleşme çiftini atın ve gözlemi laboratuvar defterine kaydedin.Beşinci günde, canlı larvaları ve yumurtadan çıkmamış embriyoları üçüncü günden itibaren sayın ve bunları bir laboratuvar defterine kaydedin. N2 için embriyonik canlılık testi% 98.9'luk bir canlılık yüzdesi verirken, hem him-5 (e1490) hem de spo-11 (ok79) sırasıyla % 74.9 ve% 0.8'lik bir yüzde ile embriyonik canlılıkta bir azalma göstermiştir. Ortalama yavru büyüklüğü N2, him-5(e1490) ve spo-11(ok79) sırasıyla 217, 105 ve 219 olarak belirlenmiştir.C.elegans gelişiminin çeşitli aşamalarının tanınması, doğru ve tekrarlanabilir veriler için önemlidir. Resimler ve diseksiyon mikroskobu kullanarak solucan gelişimine aşina olmanızı öneririz. Bu prosedür, bir genin gelişimsel bir sürece dahil olup olmadığını belirlemek için harika bir ilk adımdır ve hangi sürecin bozulduğunu belirlemek için sitolojik analizlerle takip edilebilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data

Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size LEfSe in Microbiome Data

Mikrobiyom Verilerinde Doğrusal Diskriminant Analizi Etki Boyutu (LEfSe) ile Biyobelirteçlerin Yardımlı Seçimi

There is growing attention toward closed biological genomes in the environment and in health. To explore and reveal the intergroup differences among ...

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Epigenetic Inheritance and ChIP in Caenorhabditis elegans

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

RNAi Inheritance and ChIP in C. elegans (Video) | JoVE

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...