Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

نشكر زملائنا في مركز الطب الجزيئي التابع للمركز الطبي الجامعي في أوتريخت على المناقشات والتعليقات المثمرة. نشكر الزملاء السابقين والحاليين في مختبر Klumperman لإجراء تحسينات مستمرة في تقنيات الفحص المجهري لدينا. البنية التحتية EM المستخدمة لهذا العمل هي جزء من برنامج البحث خارطة الطريق الوطنية للبنية التحتية للبحوث واسعة النطاق (NEMI) بتمويل من مجلس البحوث الهولندي (NWO) ، رقم المشروع 184.034.014 إلى JK.

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

تستفيد الطريقة المعروضة هنا من التطورات الحديثة في CLEM القائم على المقطع بالتبريد - الحساسية العالية لوضع العلامات IF والارتباط الدقيق (<خطأ 100 نانومتر) بين FM و EM14,24. ينتج عن هذا طريقة ذات حساسية لتسمية البروتينات النادرة والداخلية الفلورية والقدرة على تراكب ذلك بدقة عالية مع البنية التحتية EM. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تتجنب الحاجة إلى (إفراط) التعبير عن البروتينات الموسومة خارجيا واستخدام ملصقات EM أقل حساسية. تظهر جدوى الطريقة من خلال أمثلة CLEM على LC3 الداخلي في الخلايا الجائعة ، دون استخدام مثبطات الليزوزومات.
تعتبر عمليات التجميد المذابة التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة Tokuyasu عينات مثالية للمناعة EM ، على عكس أقسام الراتنج ، فهي قابلة للاختراق للأجسام المضادة. إلى جانب التثبيت المعتدل والإجراءات المتناقضة ، ينتج عن هذا بشكل عام كفاءة رائعة في وضع العلامات على الطرق الأخرى دون المساس بالبنية التحتية التفصيلية ، ويصور الأغشية الخلوية بشكل ممتاز12،25،26. علاوة على ذلك ، فإن عمليات التقطيع بالتبريد متوافقة للغاية مع الفحص المجهري الفلوري ، مما يجعلها ركائز قيمة ل CLEM. قدم كل من وضع العلامات المناعية الكلاسيكية و CLEM على عمليات التجميد رؤى أساسية في فهم التنظيم تحت الخلوي14،27،28،29،30.
في الوقت الحالي ، أصبحت تطبيقات CLEM على عمليات التجميد المذابة أكثر انتشارا ، نتيجة للتطورات والتحسينات المستمرة 14،20،24،31،32،33،34 التي حسنت جودة النهج وقابليته للتطبيق ودقته. الآن ، من خلال الارتباط الدقيق لمجموعات تجانب الصور الكبيرة IF و EM ، تسهل التقنية فحص البنية التحتية للمكونات الخلوية الداخلية ذات العلامات الفلورية14،32،33. هذه ميزة على EM المناعي الكلاسيكي ، حيث يتطلب البحث عن الهياكل ذات العلامات الذهبية عادة تكبيرا عاليا ، وبالتالي فهو أكثر شاقة ويستغرق وقتا طويلا. ولهذا السبب ، فإن توطين LC3 إلى البنية التحتية يستفيد بشكل كبير من CLEM. العضيات الإيجابية LC3 شائعة عندما يتم حظر إزالة الالتهام الذاتي (أي عندما يتم التعامل مع الخلايا ب BafA1 أو عوامل رفع الأس الهيدروجيني) ، في حين يتم إزالة عضيات الالتهام الذاتي بسرعة في الخلايا غير المتغيرة أو الجائعة ، مما يؤدي إلى مستويات منخفضة جدا من الحالة المستقرة. في مثل هذه الظروف ، قد يكون العثور على عضيات تحمل علامة LC3 باستخدام EM المناعي الكلاسيكي أمرا صعبا ، ويوفر CLEM ميزة واضحة.
في السابق ، تم تطبيق CLEM على أقسام الراتنج في الدراسات باستخدام التعبير خارج الرحم ل LC3-GFP أو مسبار ترادفي LC3-GFP-RFP35،36،37،38،39. في هذه الدراسات ، تم إجراء التصوير الفلوري قبل التضمين أو مباشرة في أقسام راتنج الأكريليك40 ، وتم فحص العينات لاحقا بواسطة EM. هناك العديد من المزايا لتضمين الراتنج. يتم الحفاظ على البنية التحتية البلعمية الذاتية بشكل جيد بشكل عام ، خاصة إذا كانت المادة مجمدة بضغط عال40. علاوة على ذلك ، فإن تباين المواد المدمجة في الراتنج الملطخة بالمعادن الثقيلة يكون بشكل عام أكثر وضوحا من تباين عمليات التجميد الملطخة باليورانيل. تتوافق المقاطع المضمنة بالراتنج مع طرق EM الحجمية ، مثل التصوير المقطعي للصفيف أو FIB-SEM أو SEM التسلسلي blockface ، في حين أن عمليات التقطيع بالتبريد ليست كذلك. في الأساليب التي تقوم بالتصوير قبل التضمين ، يعد تصوير الخلايا الحية خيارا41 غير متوفر في CLEM في عمليات الاستئصال بالتبريد. الميزة الرئيسية ل CLEM على عمليات التجميد على هذه البدائل هي إشارة IF العالية ، مما يسمح بالتوطين المناعي للبروتينات النادرة دون الحاجة إلى نفاذية الغشاء أو الإفراط في التعبير. هذا يتجنب استخراج الغشاء المحتمل ، والإفراط في التعبير عن المصنوعات اليدوية42 والتعديل الوراثي للموضوع ، والذي ، جنبا إلى جنب مع إمكانية ربط مساحات كبيرة في IF و EM ، يجعله أداة ممتازة لدراسة LC3 والالتهام الذاتي.
هنا ، كشف تطبيق CLEM على المقطع على خلايا HEPG2 الجائعة أن LC3 موضعي في الغالب إلى الهياكل التي تم تحديدها على أنها البلعمة الذاتية. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على عدد قليل من البقع الفلورية الضعيفة في التحلل الذاتي. هذا يتناقض بشكل مباشر مع الخلايا المعالجة ب BafA19 ويعكس التدهور السريع للبروتينات البلعمية الذاتية بمجرد اندماج البلعمة الذاتية مع الجسيمات الحالة. بشكل عام ، أظهرت البيانات أن CLEM للتشريح المذاب يمكن أن يوفر رؤى حول الالتهام الذاتي بوساطة LC3 في الظروف الأصلية. تسلط البيانات الضوء أيضا على حساسية التكنولوجيا ، حيث تم اكتشاف LC3 حتى في التحلل الذاتي الذي يحتوي فقط على مستويات منخفضة من حوائط LC3 السليمة. سيؤدي التطبيق الإضافي لهذه التقنية عن طريق تصوير LC3 في نماذج وظروف مختلفة إلى تحسين فهمنا للالتهام الذاتي والعمليات البيولوجية الأخرى بوساطة LC3 ، مثل البلعمة المرتبطة ب LC3 أو اقتران ATG8 بالأغشية المفردة.
بالإضافة إلى الالتهام الذاتي ، يمكن تطبيق CLEM على الأحداث أو الهياكل النادرة الأخرى ، مثل انقسام الخلايا ، أو العدوى ، أو أنواع الخلايا النادرة في الأنسجة ، أو الحركية ، أو الأهداب الأولية ، أو العضيات الخاصة بنوع الخلية. يمكن للفحص الفعال للموضوع محل الاهتمام من قبل IF أن يسهل إلى حد كبير دراسة البنية التحتية لهذه النوادر. علاوة على ذلك ، تبين14 أنه يمكن استخدام هذه التقنية لتوطين البروتينات بطريقة أكثر حساسية من المناعة الكهرومغناطيسية الكلاسيكية. يمكن أن يؤدي ضبط طول التثبيت إلى زيادة هذه الحساسية ، مما يسمح بتوطين البنية التحتية للبروتينات منخفضة الوفرة جدا أو المستضدات الضعيفة. أخيرا ، تسهل طريقة CLEM المقطعية الاختيار السريع لعدد كمي من العضيات ، مما يسهل إجراء تحليل أكثر قوة للتوزيع الفائق البنية لبروتين معين.
يتطلب CLEM على عمليات الاستئصال بالتبريد المعدات والخبرة اللازمة للتشريح بالتبريد. في المجموعات التي لديها إمكانية الوصول إلى هذه الأدوات (على سبيل المثال ، cryomicrotomes) ، يكون تنفيذ CLEM في المقطع أمرا بسيطا ولا يتطلب سوى توفر مجهر آلي واسع المجال ، وهو إعداد يمكن لمعظم المختبرات الوصول إليه. علاوة على ذلك ، فإن الطريقة متاحة في مرافق EM في جميع أنحاء العالم. نظرا لأن CLEM في المقطع يجمع بين تطبيق طرق IF و EM المعمول بها ، يمكن تكييف الطريقة بسهولة ويمكن دمجها ، على سبيل المثال ، التصوير المقطعي20،33،43 ، أو حجم المقطع التسلسلي EM لعدد محدود من الأقسام 44 ، أو الفحص المجهري فائق الدقة 45. يدعم هذا التنوع في الطريقة التطبيقات على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية.

الالتهام الذاتي هو عملية رئيسية لإزالة وإعادة تدوير البروتينات والعضيات السيتوبلازمية. تتضمن عملية الالتهام الذاتي الكلي (المشار إليها فيما يلي باسم الالتهام الذاتي) تكوين عضيات مزدوجة الغشاء ، البلعمة الذاتية ، والتي تسمح للخلايا بإحاطة الجزيئات السيتوبلازمية والعضيات لتدهور الليزوزومات. يحدث الالتهام الذاتي على المستوى القاعدي في معظم الخلايا ويتم تنظيمه استجابة للظروف الخلوية ، مثل الجوع أو الإجهاد الخلوي. يحدث الالتهام الذاتي إما بطريقة خاصة بالركيزة ، ويستهدف هياكل أو بروتينات محددة للتحلل ، أو كعملية سائبة غير انتقائية تشمل أجزاء من العصارة الخلوية. في الالتهام الذاتي الانتقائي ، تتشكل البلعمة الذاتية عن طريق اقتران بروتينات عائلة Atg8 (البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 1A / B سلسلة الضوء 3A / B / C [LC3] و GABARAPs) إلى الأغشية المشتقة من إعادة تدوير الإندوسومات ، و / أو جولجي ، و / أو الشبكة الإندوبلازمية (ER) 1. يتعرف LC3 على حمولة الالتهام الذاتي في السيتوسول مباشرة أو عبر محولات الالتهام الذاتي الانتقائية مثل P62 / SQSTM. يمكن بعد ذلك اقتران أغشية الالتهام الذاتي الجديدة ب LC3 ، وتوسيعها ، ودمجها لتشكيل غشاء مزدوج مكتمل يحيط بالشحنة يسمى البلعمة الذاتية. ينضج البلعمة الذاتية ويندمج في النهاية مع الإندوسوم أو الليزوزوم ، حيث تتحلل بعد ذلك البضائع والمحولات ذاتيةالالتهام 2.
غالبا ما تستخدم الدراسات حول تكوين البلعمة الذاتية والنضج والاندماج تقنيات الفحص المجهري الضوئي. يستخدم الفحص المجهري الفلوري ل LC3 بشكل عام لتقييم عدد البلعمة الذاتية وتوطينها الخلوي في ظل ظروف مختلفة. علاوة على ذلك ، من خلال اقتران LC3 ب GFP الحساس للأس الهيدروجيني و RFP المستقر للأس الهيدروجيني في ما يسمى بالمسبار الترادفي ، يمكن قياس التدفق الكلي للالتهام الذاتي في الخلايا الحية كدالة لفقدان مضان GFP3. هذه الأساليب هي أدوات قيمة للباحثين لفهم دور وآلية الالتهام الذاتي في ظل ظروف مختلفة. أداة أخرى لا تقدر بثمن هي المجهر الإلكتروني (EM) ، الذي يكشف عن البنية التحتية لعضيات الالتهام الذاتي في مراحل مختلفة من الالتهام الذاتي4،5،6،7،8. حتى الآن ، لا يزال EM هو الطريقة المفضلة لتحديد المراحل الدقيقة لتكوين البلعمة الذاتية عن طريق التمييز بين أغشية الالتهام الذاتي المختلفة عن طريق التشكل: البلعمة (غشاء مزدوج غير مغلق بالكامل) ، البلعمة الذاتية (غشاء مزدوج مغلق حول البضائع الخلوية) ، والتحلل الذاتي (فقدان [جزئي] للغشاء الذاتي الداخلي). ومع ذلك ، يمكن أن يكون التشكل بدون معلومات جزيئية عرضة للخطأ في التعرف أو الغموض. Immuno-EM هي الطريقة الأكثر شمولا للتوصيف الجزيئي المتزامن والتصنيف المورفولوجي لعضيات الالتهام الذاتي. على سبيل المثال ، يسمح وضع العلامات المناعية ل LC3 على عمليات التجميد المذابة بالتوطين الفائق ل LC3 والتحديد الدقيق للعضيات التي تحمل علامة LC39.
عيب EM هو مجال الرؤية الصغير الذي يأتي مع التكبير العالي المطلوب لمراقبة البنية التحتية الدقيقة للأغشية ذاتية الالتهام ، وفي حالة immuno-EM ، لتحديد الملصق الذي يميز البروتين محل الاهتمام. نظرا لندرتها وانخفاض مستويات البروتين ، فإن هذا يعيق بشكل عام التحليل الكمي EM للجسيمات الذاتية. لزيادة عدد البلعمة الذاتية ، غالبا ما يتم تجويع الخلايا ومعالجتها باستخدام Bafilomycin A1 (BafA1) ، وهو مثبط للتحمض الليزوزومي وتدهوره. بدون علاج BafA1 ، فإن البحث عن البلعمة الذاتية بواسطة EM يستغرق وقتا طويلا ، بسبب ندرة هذه العضيات. تعالج الطريقة المعروضة في هذه المخطوطة هذه المشكلة من خلال وضع العلامات الفلورية وتصوير LC3 الداخلي على عمليات التجميد المذابة في مجهر مضان قبل مزيد من التحضير ل EM. ثم توجه الصور الفلورية البحث عن الهياكل ذات العلامات LC3 في EM. بعد التجميع ، ترتبط صور EM بالصور الفلورية لإضافة معلومات جزيئية - وجود LC3 - إلى البنية التحتية للخلية. تزيد طريقة "CLEM المقطعية" هذه بشكل كبير من القدرة على العثور على الهياكل التي تحمل علامة LC3 ، خاصة في الحالات غير المعالجة ، لتحديد وتصنيف لاحقين بواسطة EM.
تم تطبيق هذه الطريقة على خلايا HEPG210 المشتقة من الورم الأرومي الكبدي الجائعة للعثور على البلعمة الذاتية في ظروف غير متغيرة (أي لم يتم استخدام BafA1). تم العثور على عدد قليل نسبيا من النقاط الفلورية (أقل من واحد لكل ملف تعريف خلية في قسم 90 نانومتر) ، وهو ما يتفق مع ارتفاع معدل دوران LC311. أكد هذا التباين في LC3-puncta على قيمة CLEM. من خلال اختيار المناطق التي تحتوي على العديد من النقاط الفلورية للتصوير في EM ، تم العثور على عضيات إيجابية LC3 وتميزت بطريقة أكثر فعالية بكثير من خلال EM المناعي التقليدي. كشف هذا أن غالبية العضيات الإيجابية ل LC3 كانت عبارة عن جسيمات بلعمية ذاتية ، كما هو محدد من خلال مورفولوجيتها ، وهو ما يتناقض مع النتائج التي تم الحصول عليها في الخلايا المعالجة ب BafA1 ، حيث تكون الليزوزومات الذاتية أكثر شيوعا9. تظهر هذه البيانات أنه مع CLEM على المقطع ، يمكن دراسة الالتهام الذاتي على مستوى البنية التحتية دون الحاجة إلى تثبيط تدفق الالتهام الذاتي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

يعد تصور عضيات الالتهام الذاتي على مستوى البنية التحتية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM) أمرا ضروريا لتحديد هويتها والكشف عن التفاصيل المهمة لفهم عملية الالتهام الذاتي. ومع ذلك ، غالبا ما تفتقر طرق EM إلى المعلومات الجزيئية ، مما يعيق ارتباط المعلومات الهيكلية الفائقة التي تحصل عليها EM بالتوطين القائم على الفحص المجهري الفلوري لبروتينات الالتهام الذاتي المحددة. علاوة على ذلك ، فإن ندرة البلعمة الذاتية في الظروف الخلوية غير المتغيرة تعيق التحقيق بواسطة EM ، الأمر الذي يتطلب تكبيرا عاليا ، وبالتالي يوفر مجال رؤية محدودا.
ردا على كلا التحديين ، تم تطبيق طريقة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط (CLEM) على المقطع بناء على وضع العلامات الفلورية لربط علامة البلعمة الذاتية الشائعة ، LC3 ، بالبنية الفائقة EM. تم استخدام الطريقة لفحص الخلايا بسرعة في الفحص المجهري الفلوري لوضع العلامات LC3 بالاشتراك مع العلامات الأخرى ذات الصلة. بعد ذلك ، تم تحديد السمات الهيكلية الأساسية للبقع المختارة التي تحمل علامة LC3 بواسطة CLEM. تم تطبيق الطريقة على الخلايا الجائعة دون إضافة مثبطات التحمض الليزوزومي.
في هذه الظروف ، تم العثور على LC3 في الغالب على البلعمة الذاتية ونادرا في autolysosomes ، حيث يتحلل LC3 بسرعة. تظهر هذه البيانات جدوى وحساسية هذا النهج ، مما يدل على أنه يمكن استخدام CLEM لتوفير رؤى هيكلية فائقة حول الالتهام الذاتي بوساطة LC3 في الظروف المحلية - بدون علاجات دوائية أو تعديلات جينية. بشكل عام ، تقدم هذه الطريقة أداة قيمة لدراسات توطين البنية التحتية لبروتينات الالتهام الذاتي والمستضدات النادرة الأخرى عن طريق ربط الفحص المجهري الضوئي ببيانات EM.

تم مؤخرا نشر بروتوكول EM المناعي الأمثل لوضع العلامات المناعية الذهبية ل LC3 على عمليات التجميد فائقة النحافة بواسطة De Maziere et al.9. تضمنت هذه الدراسة حالات الجوع بدون BafA1 ، حيث كان LC3 موجودا ولكنه نادر نسبيا ويصعب العثور عليه بواسطة EM. تم تقديم طريقة CLEM في المقطع في دراسة منفصلة ، والتي تستخدم حساسية وضع العلامات الفلورية لتصور البروتينات الداخلية النادرة نسبيا والمنخفضة التعبير عنها وربط ذلك بالبنية التحتية EM14. هنا ، يتم الجمع بين هذين النهجين من خلال استخدام بروتوكول وضع العلامات LC3 المحسن كجزء من نهج CLEM.
تم تجويع خلايا HEPG2 ، وهي خلايا مشتقة من الكبد ذات مستويات عالية نسبيا من الالتهام الذاتيالقاعدي 22 ، في الحد الأدنى من الوسط (محلول ملح إيرل المتوازن [EBSS]) لمدة 2 ساعة قبل التثبيت في 4٪ PFA. تبع ذلك تحضير العينة بطريقة توكوياسو للتقسيم بالتبريد فائق النحافة (الأقسام 1-3 ؛ انظر الفتحة و Geuze12) ، والتي تتوافق بشكل كبير مع CLEM14،23 في المقطع. تم تصنيف عمليات التجميد المذابة بشكل فلوري (قسم البروتوكول 4 والشكل 1) باستخدام الجسم المضاد الأساسي للفأرLC3 9. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الأرنب المضاد ل LAMP1 للإشارة إلى الجسيمات الداخلية ، تليها الأجسام المضادة المضادة للفأر AlexaFluor488 والأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب AlexaFluor568. كانت الشبكات محصورة بين غطاء وشريحة زجاجية وتم تصويرها في RT على مجهر واسع المجال (هدف زيت 100x 1.47 NA ، كاميرا sCMOS).
تتمثل ميزة وضع العلامات الفلورية للأقسام الرقيقة على IF التقليدية للخلية الكاملة في الدقة المتزايدة في Z ، نظرا لأن السماكة الفيزيائية للقسم هي 60-90 نانومتر. مع دقة Z المحسنة هذه ، يكشف وضع العلامات الفلورية ل LC3 و LAMP1 على المقاطع الرقيقة عن القليل جدا من التمركز المشترك (الشكل 2A). في الخلايا المعالجة بمثبطات الليزوزومات ، مثل BafA1 ، يحدث تمركز مشترك مرتفع ، حيث يظل LC3 المغلق بالليزوزوم غير متحلل9. في الخلايا غير المعالجة ، يتحلل LC3 بسرعة عند ملامسته للجسيمات الحالة النشطة إنزيميا والإيجابية LAMP1 ، وبالتالي فإن التوطين المشترك نادر في هذه الحالات. بشكل عام ، لوحظ أقل من نقطة LC3 واحدة لكل ملف تعريف خلية. يشير هذا إلى أنه حتى في ظروف الجوع ، يكون معدل دوران البلعمة الذاتية سريعا ، مما يحافظ على انخفاض أعداد البلعمة الذاتية. كما يسلط الضوء على أهمية استخدام CLEM للعثور على الهياكل النادرة التي تحمل علامة LC3 ، باستخدام مجال الرؤية الكبير الذي يوفره الفحص المجهري الضوئي. علاوة على ذلك ، فإن الحساسية العالية لوضع العلامات الفلورية مقارنة بوضع العلامات الذهبية تمكن من تحديد عضيات إيجابية LC3 أكثر من العضيات المناعية التقليدية ، مما يساعد على توصيفها.
بعد الحصول على مجموعة مربعات كاملة من شريط الأقسام ، تم استرداد الشبكات من المجهر وملطخة بعد EM باستخدام UA وطريقة الحلقة (خطوات البروتوكول 4.4-4.6 ؛ الشكل 1F ، G). تضمن طريقة "الحلقة الخروجية" هذه بقاء طبقة رقيقة من UA: methylcellulose على الشبكة ، مما يخلق التباين المطلوب في EM. يعتمد سمك الطبقة على السرعة والزاوية التي يتم بها مسح UA: methylcellulose على ورق الترشيح. يمكن أن يؤدي سحب الحلقة بسرعة كبيرة إلى ترك الكثير من UA: methylcellulose على الشبكة وتغميق مظهر الأقسام في EM. يمكن أن يؤدي السحب ببطء شديد إلى سحب الكثير من UA: methylcellulose بعيدا ، مما يؤدي إلى القليل جدا من التلوين وضعف التشكل ، ويخاطر بسقوط الشبكة خارج الحلقة. يشير تلوين "بقعة الزيت" (الشكل 1 ج) على الشبكات الجافة إلى سمك طبقة UA: ميثيل سلولوز مناسب.
بعد الخروج والتجفيف ، تم تصوير الشبكات في TEM عند عائد الاستثمار المحدد بواسطة التألق. تم ربط مجموعات بيانات IF و EM عن طريق تراكب إشارة DAPI على الخطوط العريضة للنوى المرئية في EM ، مما أدى إلى إنشاء صورة متكاملة تحتوي على معلومات عن كلتا الطريقتين.
قد يكون العثور على نفس المنطقة في EM كما هو محدد في IF أمرا صعبا. لذلك يوصى بالاحتفاظ بصورة عامة لمجموعة تجانب IF في متناول اليد أثناء البحث في EM. يجب على المستخدمين البحث عن ميزات يمكن التعرف عليها في كلتا الطريقتين ، مثل الطيات أو التمزقات في الأقسام أو أشرطة الشبكة أو ترتيب النوى. من المهم أيضا أن تضع في اعتبارك أن العينة يمكن أن تظهر دوارة ومعكوسة في EM. يمكن استخدام "شبكات الباحث" ذات الميزات المحددة لتحديد المناطق لتسهيل الارتباط (انظر جدول المواد).
كشف ارتباط العضيات الإيجابية LC3 بالبنية التحتية EM أن النقاط المختلفة تمثل مراحل متميزة من الالتهام الذاتي (الشكل 2B). على الرغم من أن الحفاظ على البنية التحتية البلعمية الذاتية يمثل تحديا في عمليات التجميد ، فقد لوحظ بشكل متكرر عضيات ذات محتوى سيتوبلازمي وأغشية مزدوجة (الشكل 2C ، الأسهم في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، الأسهم في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، السهام في العضيات 1-5 ؛ الشكل 2C ، الشكل التكميلي S1) ، والتي تحدد السمات المورفولوجية للجسيمات الذاتية. ومن المثير للاهتمام ، تم تحديد بقع الفلورسنت الضعيفة إلى حد ما بواسطة EM على أنها جسيمات ذاتية إيجابية LC3 (الشكل 2C ، عضية 6 ؛ يتم تمييز محتوى الالتهام الذاتي *) ، والتي تتميز بمحتوى كثيف وحويصلات داخل اللمعة. أظهر هذا أن كميات صغيرة جدا من LC3 مرئية في IF من عمليات التجميد فائقة النحافة ، وأشار إلى أنه على الرغم من الوسط المتحلل ، يمكن اكتشاف بعض LC3 في التحلل الذاتي في الحالة المستقرة. ومع ذلك ، فإن غالبية النقاط الموجبة ل LC3 تمثل البلعمة الذاتية ، في حين أن التحلل الذاتي كان نادرا جدا. هذا على النقيض من الخلايا المعالجة ب BafA1 ، والتي تتراكم بشكل أساسي التحلل الذاتي وليس البلعمةالذاتية 9.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة CLEM في المقطع لربط المعلومات الجزيئية التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري الفلوري بالبنية التحتية ل EM. تزيد هذه الطريقة من حساسية EM-EM المناعية ، حيث يتم استخدام الفلوروفورات فقط لوضع العلامات وهذه تعطي عموما إشارة أكثر من مجسات EM. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لاستخدام عمليات التجميد فائقة النحافة ، حيث يمكن الحصول على مستويات عالية من التألق النوعي على تلطيخ الخلفية المهمل. باستخدام التألق لفحص الهياكل أو الأحداث النادرة وربط عائد الاستثمار المحدد ب EM ، يمكن تقليل وقت تشغيل EM والتكاليف المرتبطة به بشكل كبير. تتجلى حساسية وجدوى الطريقة من خلال تصور LC3 في الخلايا الجائعة غير المعالجة ، مما يدل على أن LC3 يرتبط في الغالب بالبلعمة الذاتية في هذه الظروف ، مع وجود مستويات منخفضة جدا مرئية في التحلل الذاتي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على CLEM في المقطع . (أ) تجمع عمليات الاستئصال بالتبريد من الخلايا المدمجة في الجيلاتين على شبكة نحاسية مغلفة بالشكلفار. (ب) تتم معالجة الشبكات من قسم لأسفل على قطرات من المحاليل المناسبة. (ج) تلصق على الشبكات بأجسام مضادة أولية وفلورية ثانوية. (د) تقع الشبكات بين غطاء منزلق وشريحة زجاجية في 50٪ من الجلسرين. ه: تجمع الصور الفلورية في مجهر واسع المجال. (F) يتم استرداد الشبكات من الشريحة الزجاجية ومعالجتها بشكل أكبر عن طريق تلطيخ اليورانيل ل EM. (ز) بعد التجفيف ، يمكن تصوير الشبكات بواسطة TEM. (H) يتم الحصول على مجموعة تجانب صور TEM عالية التكبير من منطقة مختارة من بيانات التألق. (I) الصور من المجهر الفلوري و EM مترابطة ومتراكبة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> الشكل 2: CLEM من LC3 و LAMP1 في خلايا HEPG2 الجائعة. تم تجويع خلايا HEPG2 لمدة ساعتين في EBSS قبل التثبيت بنسبة 4٪ PFA لمدة ساعتين. (A) يكشف تصوير IF ل LC3 (أخضر) و LAMP1 (أحمر) على المقاطع عن عدد قليل نسبيا من نقاط LC3 والقليل من التمركز المشترك مع LAMP1. (ب) ربط المعلومات الجزيئية من IF (اللوحة اليسرى) بالمعلومات الهيكلية الفائقة التي تم الحصول عليها في EM (اللوحة الوسطى) عن طريق تراكب طريقتي التصوير على أساس DAPI والخطوط العريضة النووية (الخطوط المتقطعة ، اللوحة اليمنى). تظهر البنية التحتية للمقصورات الفردية التي تحمل علامة LC3 ، كما يتضح من المربع 1 (اللوحة اليمنى) ، في C. (ج) البنية التحتية للمقصورات الموجبة LC3. يتم عرض صور CLEM على اليسار وصور EM شبه الملونة (البيج) على اليمين (تظهر صور EM غير الملونة في الشكل التكميلي S1). يشار إلى الأغشية البلعمية الذاتية الداخلية والخارجية بواسطة رؤوس الأسهم البيضاء والسوداء ، على التوالي. يشار إلى محتوى الالتهام الذاتي داخل التحلل الذاتي في المثال 6 ب *. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر (أ) ، 1 ميكرومتر (ب) ، 200 نانومتر (ج). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي S1: صور EM غير ملونة للعضيات الإيجابية LC3. (أ-و) صور EM غير ملونة للأمثلة الزائفة الملونة 1-6 الموضحة في الشكل 2C. تم اختيار العضيات بواسطة مضان LC3 ، كما هو موضح في الشكل 2. يشار إلى الأغشية البلعمية الذاتية الداخلية والخارجية بواسطة رؤوس الأسهم البيضاء والسوداء ، على التوالي. يشار إلى محتوى الالتهام الذاتي داخل التحلل الذاتي في المثال 6 ب *. أشرطة المقياس = 200 نانومتر. الاختصارات: AL = التحلل الذاتي. AP = البلعمة الذاتية. م = الميتوكوندريا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذه الدراسة. يحتوي هذا الملف التكميلي على الوصفات والبروتوكولات اللازمة لعمل المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذه الدراسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

هنا ، نقدم بروتوكولا للفحص المجهري الإلكتروني الضوئي المترابط على المقطع بناء على الملصقات الفلورية الداخلية كأداة للتحقيق في توطين البروتينات النادرة فيما يتعلق بالبنية الخلوية الفائقة. تتجلى قوة هذا النهج من خلال توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي في الخلايا الجائعة دون علاج بافيلوميسين.

توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي بواسطة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط في المقطع

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

كان توطين البروتينات في سياق البنية التحتية للخلية أداة بحثية قوية لعقود. باستخدام هذا البروتوكول ، قمنا بتوسيع البروتينات منخفضة الوفرة أو يصعب تحديد موقعها. نحن نستخدم المجهر الفلوري لتسمية البروتينات بطريقة حساسة وقابلة للفحص ودمجها مع المجهر الإلكتروني لإعادة ملء البنية التحتية للخلية.سنعرض هنا CLEM في المقطع على بروتينات الالتهام الذاتي ، ولكن يمكن تطبيقه حقا على أي سؤال بيولوجي حيث تكون البنية التحتية للخلية ذات أهمية ، خاصة في دراسة الأحداث النادرة. سيوضح الإجراء معي Tineke Veenendaal ، فني أبحاث أول من مختبرنا. للبدء ، استبدل برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.15٪ جليكاين ب 1٪ جيلاتين في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية.كشط ونقل الخلايا في الجيلاتين إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. بيليه الخلايا في 6،000 غرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي دقيق ثم قم بإزالة الجيلاتين دون إزعاج الحبيبات. أضف 12٪ جيلاتين دافئ إلى 37 درجة مئوية إلى الحبيبات وأعد تعليقه برفق عن طريق السحب بأطراف ماصة أو ماصات المراعي الزجاجية المسخنة مسبقا إلى نفس درجة الحرارة.احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم حبيبات الخلايا في 6،000 غرام لمدة دقيقة واحدة. تصلب الجيلاتين على الجليد لمدة 30 دقيقة. لإزالة خلايا الجيلاتين المدمجة من الأنبوب ، اقطع طرف الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات من بقية الأنبوب بشفرة حلاقة.ثم قطع نهاية الأنبوب مع بيليه الخلية في نصف عمودي على القطع الأول. ضع نصفي طرفي الأنبوب اللذين يحتويان على حبيبات الخلية في 2.3 سكروز مولاري واحتضانها لمدة 10 دقائق عند أربع درجات سلزية. يؤدي هذا إلى تقلص نصفي حبيبات الخلية قليلا وإزاحتها من الأنبوب البلاستيكي.قم بإزالة نصفي الأنبوب باستخدام حبيبات الخلية المدمجة في الجيلاتين من السكروز ، ثم قم بإزالة نصفي حبيبات الخلية من نصفي الأنبوب البلاستيكي بالملاقط. قم بقص الحبيبات يدويا إلى كتل ذات حجم مناسب بشفرة حلاقة ، واستخدم مجهر تشريح ستيريو لتكبير الهدف أثناء القطع. احتضان كتل الخلية طوال الليل في 2.3 سكروز مولي عند أربع درجات مئوية.ضعها على دبوس حامل عينة من الألومنيوم. اترك ما يكفي من السكروز حول حواف الكتلة بحيث تشكل طوقا رفيعا بين الكتلة والدبوس. قم بتجميده وتخزينه في النيتروجين السائل.قم بقص الجزء الأمامي من الكتلة لتسطيح سطحها للحصول على أقسام بسمك 250 نانومتر. ثم قم بقص جوانب الكتلة عن طريق تقسيم 50 إلى 100 ميكرومتر في جانب وجه كتلة العينة بزاوية السكين. سيؤدي تقليم أربعة جوانب من وجه كتلة العينة إلى إنشاء مستطيل بارز حوالي 250 × 375 ميكرومتر.قسم شريطا من المستطيل البارز لضمان أن يتراوح سمك المقاطع بين 70 و 90 نانومتر ولها لمعان ذهبي فضي. قم بتوجيه الأقسام بعيدا عن حافة السكين الماسي بشعر على عصا لإنشاء شريط طويل. التقط الشريط عن طريق غمس حلقة الالتقاط الثلاثة ملليمترات في خليط واحد لواحد من 2.3 سكروز مولي و 2٪ ميثيل سلولوز.أدخل الحلقة في حجرة التبريد في الميكروتوم ، وبمجرد أن تبدأ القطرة في التجمد ، التقط الأقسام على الفور عن طريق الضغط برفق على القطرة ضدها. قم بإزالة الحلقة من غرفة التبريد. انتظر حتى تذوب القطرة تماما واضغط على القطرة على شبكة معدة.ضع الشبكات ذات المقاطع على حوالي ملليلتر واحد من PBS في طبق صغير أو طبق متعدد الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بمعالجة الشبكات على حوالي 75 ميكرولترا من القطرات على Parafilm وابدأ بغسل الجلايسين PBS في درجة حرارة الغرفة. احتضن الشبكات بمخزن مؤقت مانع مصنوع من 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار C و 0.5٪ جيلاتين جلد السمك في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة كخطوة مانعة.تمييع الأجسام المضادة الأولية في منع المخزن المؤقت في برنامج تلفزيوني واحتضان الشبكات على حوالي 10 قطرات ميكرولتر من هذا الحل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشبكات في 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار في برنامج تلفزيوني خمس مرات في درجة حرارة الغرفة. تمييع الأجسام المضادة الثانوية و DAPI في المخزن المؤقت للحظر في PBS.ثم احتضان الشبكات على حوالي 10 قطرات ميكرولتر من هذا المحلول لمدة 30 دقيقة أو أكثر في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشبكات في PBS خمس مرات كما هو موضح سابقا. لتركيب العينات للفحص المجهري الضوئي ، اغمر الشبكات في 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع شبكة واحدة لكل زلة غطاء بين شريحة زجاجية وقسيمة غطاء في 50٪ من الجلسرين ، مع التأكد من أن الأقسام تواجه انزلاق الغطاء.للفحص المجهري الضوئي ، خذ شريحة زجاجية مع الشبكات المحصورة إلى مجهر واسع المجال مع مرحلة آلية. حدد هدف زيت عالي التكبير وقم بإنشاء مجموعة تجانب صورة من شريط المقاطع. بعد ذلك ، للفك والمجهر الإلكتروني أو تباين EM ، أضف 10 ميكرولترات من الماء المقطر إلى جانب شطيرة انزلاق غطاء الشريحة الزجاجية ، وانتظر العمل الشعري لملء واجهة شطيرة انزلاق الغطاء الزجاجي.قم بإزالة زلة الغطاء بعناية دون خلط زيت الغمر في الجلسرين. استرجع الشبكات بالملاقط واغمرها في الماء المقطر ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لغسل 50٪ من الجلسرين. جفف الجزء الخلفي من الشبكة بعناية باستخدام مناديل ورقية خالية من النسالة وضع جانب قسم الشبكات لأسفل على قطرات الماء المقطر.لتلطيخ الأقسام للتباين في المجهر الإلكتروني ، قم باحتضانها بأسيتات اليورانيل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتبريد محلول ميثيل سلولوز أسيتات اليورانيل عن طريق وضع القطرات على Parafilm على صفيحة معدنية على الجليد. ثم اغسل الشبكات بهذا المحلول البارد المثلج مرتين واحتضانها في المحلول لمدة 10 دقائق.قم بإخراج الشبكات عن طريق إدخال حلقة تجفيف شبكية في قطرة ميثيل سلولوز أسيتات اليورانيل أسفل كل شبكة ورفعها برفق حتى يتم سحب الشبكة من القطرة. لمسح المحلول الزائد ، المس الحلقة بزاوية 60 درجة تقريبا على ورق الترشيح الخالي من النسالة واسحبه ببطء على طول الورق حتى لا يتم امتصاص المزيد من المحلول. ضع الحلقة مع الشبكة في رف مناسب ، واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقائق.استخدم النظرة العامة التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر الضوئي لتحديد منطقة الاهتمام للتصوير في المجهر الإلكتروني النافذ أو TEM ، وقم بالتعليق على عائد الاستثمار على مجموعة بيانات الفحص المجهري الضوئي. بمجرد تحديد منطقة، احصل على تجانب صورة تم تعيينه عند تكبير 20,000x إلى 50,000x في TEM. أعد إنشاء لوحة الصورة التي تم تعيينها في برنامج ما بعد المعالجة.إجراء الارتباط بناء على إشارة DAPI والخطوط الفلورية والنووية في المجهر الإلكتروني. قم بتحويل الصور لتراكبها بدقة وقم بإجراء الارتباط اليدوي بدقة. تم تجويع خلايا HEPG2 المشتقة من الورم الأرومي الكبدي لمدة ساعتين في EBSS قبل التثبيت ب 4٪ paraldehyde لمدة ساعتين.يكشف تصوير IF ل LC3 و LAMP1 على الأقسام عن عدد قليل نسبيا من نقاط LC3 والقليل من التمركز المشترك مع LAMP1. تم ربط المعلومات الجزيئية من IF بالمعلومات الهيكلية الفائقة التي تم الحصول عليها في المجهر الإلكتروني عن طريق تراكب طريقتي التصوير على أساس DAPI والخطوط العريضة النووية. كشف ارتباط العضيات الإيجابية LC3 بالبنية التحتية EM أن النقاط المختلفة تمثل مراحل متميزة من الالتهام الذاتي.يتم عرض البنية التحتية للمقصورات الفردية المسماة LC3 كما يتضح من المربع الأول هنا. تظهر صور المجهر الإلكتروني الضوئي المتلازم على اليسار ، وتظهر صور المجهر الإلكتروني الملون الزائف على اليمين. يشار إلى الأغشية البلعمية الذاتية الداخلية والخارجية برؤوس سهام بيضاء وسوداء.ومن المثير للاهتمام ، أن EM حددت بقع الفلورسنت الضعيفة نسبيا على أنها جسيمات ذاتية إيجابية LC3 ، والتي تتميز بمحتوى كثيف وحويصلات داخل اللمعة. يكشف هذا عن الحد الأدنى من رؤية LC3 في IF لأقسام التبريد الرقيقة للغاية ، مما يشير إلى LC3 القابل للكشف في الحالة الذاتية المستقرة على الرغم من البيئة المتحللة. ومع ذلك ، فإن النقط الموجبة LC3 تمثل بشكل أساسي البلعمة الذاتية مع القليل منها يمثل التحلل الذاتي.بالنسبة للباحثين الذين يرغبون في وضع العلامات المناعية بدلا من CLEM في المقطع ، فإن البروتوكولات والنصائح الموضحة هنا قابلة للتطبيق تماما لوضع العلامات المناعية أيضا. قمنا في البداية بتطبيق CLEM على المقطع على البروتينات التنظيمية الاندوسومية ذات الوفرة المنخفضة وأظهرنا لأول مرة توطينها الداخلي البنيوي.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

التجميد السريع باستخدام جهاز تجميد ساندويتش للحفاظ على البنية الفائقة جيدة من العينات البيولوجية في المجهر الإلكترون

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy