Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
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我们感谢乌得勒支大学医学中心分子医学中心的同事们进行了富有成效的讨论和反馈。我们感谢Klumperman实验室过去和现在的同事，他们不断改进我们的显微镜技术。用于这项工作的 EM 基础设施是由荷兰研究委员会 （NWO） 资助的研究计划国家大规模研究基础设施路线图 （NEMI） 的一部分，项目编号为 184.034.014 到 JK。

1. 工具和试剂的制备
注：有关所需的试剂、缓冲液和溶液，请参阅 补充文件 1 或 12 了解更多信息。有关本协议中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表。
<ol><li>固定剂<ol><li>如补充文件 1 中所述，准备 0.2 M 磷酸盐缓冲液 （PB） 或 0.2 M 管道、HEPES、EGTA、MgSO4 （PHEM） 缓冲液，用作固定液的基础。 注：固定剂通常缓冲在0.1M PB或PHEM缓冲液中，以缓冲由醛与生物材料反应引起的酸化。</li>
		<li>由于多聚甲醛 （PFA） 的质量是可靠固定样品超微结构的关键，因此请使用 EM 级 PFA。要遵循该方案，请使用由高质量PFA颗粒制备的16%储备溶液（参见 补充文件1）。 注意： 多聚甲醛是一种危险化学品（危险说明 H228、H301、H302、H311、H314、H315、H317、H318、H331、H332、H335、H341、H350）。使用 PFA 时，请穿戴防护设备（手套、实验室外套和防护眼镜）并在化学罩中工作。含有PFA的废物应根据机构的指导方针和规定进行收集和处置。</li>
		<li>将 10 mL 的 0.2 M PB、5 mL 的 16% PFA（在软化水 [dH 2 O] 中）和 5 mL 的 dH2O 混合，制备 4% PFA 的固定溶液。</li>
		<li>可选：在步骤 1.1.3 中的固定液中加入 0.02%-0.5% 戊二醛 （GA） 可改善超微结构的保存，但会降低样品对许多抗体的抗原性。 注意： 当需要 GA 固定时，请使用合适供应商提供的 EM 级 GA。 注意：戊二醛是一种危险化学品（危险说明 H301、H302、H314、H317、H330、H332、H334、H335、H400、H411）。操作 GA 时，在化学罩中工作并佩戴防护设备（手套、实验室外套和防护眼镜）。 含有 GA 的废物应根据研究所的指南和规定进行收集和处置。</li>
	</ol></li>
	<li>工具和材料<ol><li>划伤铝制样品架引脚的表面，并在乙醇中超声处理3 x 10分钟，以去除金属残留物，并确保在明胶包埋的细胞块安装在引脚上时具有最佳粘附性。</li>
		<li>使用适合将铝制样品架销及其样品储存在液氮 （LN2） 中的储存罐。</li>
		<li>用指甲油将一根头发或睫毛固定在木串的末端，制作一个操纵器。</li>
		<li>制作一个拾音循环。将一根 0.3 毫米厚的不锈钢丝绕在直径为 3 毫米的圆棒上弯曲，并将两端扭在一起，在一端形成一个环。将扭曲的两端插入移液器吸头。从另一端插入木签，并用胶水或树脂固定。 注意： 拾音回路也可在市售（参见 材料表）。</li>
		<li>要准备网格干燥环，请按照相同的步骤制作拾取环：在 4 毫米的环中形成不锈钢丝，然后用胶水或树脂固定在大移液器吸头上。</li>
		<li>使用薄支撑膜（如formvar）涂覆网格（ 补充文件1中的方案）。使用前，在网格上涂上一层薄薄的碳。 注意：即用型网格是市售的（参见 材料表）。Formvar涂层网格可以在室温（RT）下无限期储存;碳涂层网格可以在室温下储存数月。</li>
		<li>准备干净的载玻片和大盖玻片（24 mm x 24 mm 是 25 mm 宽载玻片的理想选择），如 13 所示。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 固定和样品制备
<ol><li>固定<ol><li>使用在步骤1.1.3中制备的固定剂（4%PFA在0.1M PB中）。对于贴壁细胞系，在 6 cm 培养皿中培养 1-5 个× 10 个6 个 细胞。将固定剂以 1：1 的比例加入培养基中，并在室温下孵育样品 5 分钟。然后，仅用固定剂替换介质固定剂混合物，并在室温下孵育2小时。 注：确切的细胞计数、汇合度和培养条件可能因所使用的模型系统而异。</li>
		<li>将样品在0.5%PFA中在0.1M PB中在4°C下储存过夜或长达3-4周。 注意：GA可以添加到固定物中（参见步骤1.1.4），并且可以改变固定长度以在形态和抗原性的保存之间找到最佳平衡，这因标本和标记而异。有关详细信息，请参阅14。</li>
	</ol></li>
	<li>示例嵌入<ol><li>在室温下用PBS用固定细胞洗涤3次。然后，用含有0.15%甘氨酸的PBS代替，并在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>在预热至37°C的PBS中用1%明胶代替含有0.15%甘氨酸的PBS，并将1%明胶中的细胞刮擦并转移到微量离心管中。在微量离心机中以6,000× g 沉淀细胞，在室温下沉淀1分钟。然后，在不干扰颗粒的情况下除去1%明胶，并加入加热至37°C的12%明胶。 通过用预热至37°C的移液器吸头或玻璃巴斯德移液器轻轻上下移液，重悬细胞沉淀。</li>
		<li>在37°C孵育10分钟;然后，以6,000× g 沉淀细胞1分钟。将明胶在冰上固化30分钟。</li>
		<li>要从试管中取出明胶包埋的细胞，请用剃须刀片将含有沉淀的管端从试管的其余部分切下。然后，垂直于第一个切口，将带有细胞沉淀的管端切成两半。</li>
		<li>将含有明胶包埋的细胞沉淀的两个管端半部分在2.3M蔗糖中在4°C下孵育10分钟。 这导致明胶包埋的细胞沉淀部分略微收缩并从塑料管中脱落。 注意：明胶包埋的细胞沉淀应尽可能保持在4°C或冰冷，以避免2.3M蔗糖变得太粘稠和明胶太软。在接下来的步骤中操作明胶包埋的细胞沉淀时，一次只处理一个样品，并将其他样品放在冰上，或在寒冷（~4°C）的房间中工作。避免明胶包埋的细胞沉淀因阳光、热显微镜灯或其他热源而过热。</li>
		<li>从2.3M蔗糖中取出带有明胶包埋的细胞沉淀的管半部分。然后，用镊子从塑料管中取出明胶包埋的细胞沉淀一半。用剃须刀片手动将颗粒切割成适当尺寸（~1mm3）的块。在切割过程中使用立体解剖显微镜放大被摄体。</li>
		<li>用2.3M蔗糖注入明胶包埋的细胞块3-16小时，在4°C的转子中首尾相接。</li>
		<li>将明胶包埋的细胞块放在铝制样品架销上（参见步骤 1.2.1）。在块的边缘留出足够的 2.3 M 蔗糖，使其在块和销钉之间形成一个薄的“项圈”。避免过多的 2.3 M 蔗糖覆盖块的顶部。快速冻结并储存在 LN2 中。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 切片
<ol><li>修剪（另见12）<ol><li>从LN2 储存中取出带有明胶包埋细胞块的别针，并将其置于-80°C的冷冻切片机中。</li>
		<li>修剪块的前部以使其表面变平并获得 ~250 nm 切片。将3mm环浸入拾取溶液（1：1 2.3M蔗糖和2%甲基纤维素）中，将环插入切片机的冷冻室中，并等待液滴中开始形成冰（通常为5-7秒）。然后，立即快速但轻轻地将液滴压在它们身上，从而捡起该部分。从冷冻室中取出环，等待液滴完全解冻，然后将液滴压在载玻片上。</li>
		<li>通过切片的甲苯胺蓝染色检查细胞方向。<ol><li>将一滴甲苯胺蓝色溶液（参见 补充文件1）放在载玻片上各部分的顶部，并在80°C加热板上干燥，直到液滴的边缘干燥。</li>
			<li>从加热板上取下载玻片，用dH2O轻轻冲洗甲苯胺蓝，将其收集在合适的废物容器中。</li>
			<li>干燥载玻片，并通过简单的台式光学显微镜检查切片中的细胞方向。</li>
		</ol></li>
		<li>用刀角将50-100μm切入样品块面的侧面，修剪块的侧面。修剪每侧后，通过将样品架旋转 90° 来修剪样品块面的四个侧面，以形成一个突出的 ~250 μm x 375 μm 矩形。根据上一步中确定的单元格方向选择突出区域。</li>
	</ol></li>
	<li>切片和拾取<ol><li>将冷冻切片机冷却至-100°C。 从突出的矩形切开一条带状，切片厚度为 70-90 nm，具有银金色光泽。用一根棍子上的毛发引导部分远离金刚石刀的边缘（参见第 1.2.3 节），以形成一条长（2-5 毫米）的色带。</li>
		<li>形成合适的色带后，停止切片以拾取色带。将 3 mm 拾取环浸入 2.3 M 蔗糖和 2% 甲基纤维素 1：1 混合中，将环插入切片机的冷冻室中，并等待液滴开始冻结（通常为 5-7 秒）。然后，立即快速但轻轻地将液滴压在它们上面，从而捡起这些部分。从冷冻室中取出环，等待液滴完全解冻，然后将液滴压在准备好的网格上（步骤1.2.6）。 注意：带有截面的网格可以在4°C下储存数月。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 标签和光学显微镜
<ol><li>标签<ol><li>将切片（图1A）切片面朝下放置在小培养皿或多孔板中的~1mL PBS上。在37°C孵育30分钟。 注意：此步骤去除细胞之间的明胶;切片后不需要明胶，并且会干扰剩余的方案。</li>
		<li>在封口膜上的~75μL液滴上处理网格面朝下（见 图1B）。从室温下PBS + 0.15%甘氨酸洗涤液（3 x 2分钟）开始。然后，在室温下用 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA）-c + 0.5% 鱼皮明胶 （FSG） 在 PBS 中孵育网格 10 分钟作为阻断步骤。在PBS中的0.1%BSA-c + 0.5%FSG中稀释一抗，并在室温下在~10μL液滴上孵育网格1小时（图1C）。</li>
		<li>在室温下用 0.1% BSA 在 PBS 中 5 次洗涤网格。然后，在PBS中的0.1%BSA-c + 0.5%FSG中稀释二抗和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;10μg/ mL），并在室温下在~10μL液滴上孵育网格30 +分钟（图1C）。在室温下在PBS 5x中清洗网格。 注：可选地，二抗可以用与蛋白 A （PAG） 偶联的 5、10、15 或 20 nm 胶体金颗粒标记，以在 EM 中定位目标蛋白。如果需要，在步骤4.1.3之后，在室温下用PAG孵育网格20分钟。然后，在室温下用PBS洗涤5次。 避免同时使用多种一抗，并注意PAG对不同物种IgG的反应性，以防止不必要的交叉反应。有关详细信息，请参阅12。</li>
	</ol></li>
	<li>用于光学显微镜的安装样品<ol><li>在室温下将网格浸没在dH2O2 x 5分钟的50%甘油中，将网格夹在50%甘油中，每个盖玻片一个网格，部分朝向盖玻片（图1D）。 注意：当网格安装在 50% 甘油中超过 30 分钟时，标签质量会下降。因此，建议一次安装两个或三个网格并成像，并将其他网格保留在二次标记溶液上。</li>
	</ol></li>
	<li>光学显微镜<ol><li>将带有夹层网格的载玻片放到带有自动载物台的宽视场显微镜上。选择高放大倍率（63 倍或 100 倍）油物镜。创建部分功能区（部分）的图像图块集（图 1E）。 注意：一些二抗可以在网格上形成荧光聚集体，尤其是在切片的褶皱或撕裂周围。此外，一些细胞类型和组织含有自发荧光结构。如果预计会出现此类问题，建议包括未与一抗孵育的阴性对照网格。</li>
	</ol></li>
	<li>拆卸和 EM 对比<ol><li>向载玻片-盖玻片夹层的侧面加入 10 μL dH2O，等待毛细管作用填充玻璃-盖玻片夹层界面。小心地取下盖玻片，不要将浸油混合到甘油中。用镊子取出网格，并在室温下浸没在dH2O 3x中以洗去50%甘油。 注意：油会干扰铀酰染色并降低 EM 对比度。</li>
		<li>用无绒纸巾小心地擦干网格的背面。 注意：如果样品也用胶体金颗粒标记，请执行以下步骤：将部分面朝下的网格放在PBS液滴上，并在室温下洗涤2次。 在室温下在1%GA中后缀5分钟（参见1.1.4下的警告说明）。在室温下在PBS 2x中洗涤。</li>
		<li>将网格部分面朝下放在dH2O液滴上，并在室温下洗涤8次。</li>
		<li>为了在EM中染色造影剂切片，在室温下与pH 7的醋酸铀酰（UA）孵育5分钟（图1F）。</li>
		<li>在放置网格之前，通过将液滴放在冰上金属板上的石蜡膜上来冷却 UA：甲基纤维素 pH 4。然后，用冰冷的UA：甲基纤维素（pH 4,2x）洗涤网格，并与冰冷的UA：甲基纤维素（pH 4）孵育10分钟（图1F）。 注意：醋酸铀酰是一种危险化学品（危险说明 H300、H330、H373、H411）。在需要 UA 的步骤中，在化学罩中工作并穿戴防护设备（实验室外套、手套和防护眼镜）。根据研究所的指导方针和规定收集和处置含有 UA 的废物。</li>
		<li>通过将网格干燥环插入网格下方的 UA：甲基纤维素液滴中并轻轻提起它直到网格从液滴12 上拉出，从而环出网格。将多余的UA：甲基纤维素以~60°角（部分朝下）接触到无绒滤纸上（参见 材料表），然后沿着纸缓慢拖动，直到不再吸收UA：甲基纤维素。然后，将带有网格的环放在合适的架子中，并在室温下干燥>10分钟（图1G）。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 电磁
<ol><li>使用光学显微镜获得的概览来定位感兴趣区域 （ROI），以便在透射电子显微镜 （TEM;图1H）。在光学显微镜数据集上注释 ROI。选择区域后，在 TEM 中获取放大倍率为 20,000x-50,000 倍的图像图块集。在后处理软件15,16中重建图像图块集。</li>
</ol>6. 相关性和分析
<ol><li>将光学显微镜和 EM 数据集加载到合适的图像处理软件中，例如 ImageJ/Fiji17、Icy18 中的 ec-CLEM 插件或 Photoshop。裁剪并旋转光学显微镜数据集以匹配 EM 图块集。<ol><li>根据荧光中的DAPI信号和EM中的核轮廓进行相关性（图1I）。移动图像以精确叠加它们并准确执行手动关联。为了使方法更精确，例如，通过Icy中的ec-CLEM插件或ImageJ中的BigWarp插件应用基于地标的关联，通过手动选择相应的点来关联图像。与ec-CLEM相关的详细分步协议可用19。 注：这种方法也适用于使用双峰基准探头20,21。</li>
	</ol></li>
	<li>通过在合适的程序（例如，ImageJ）中根据荧光信号选择ROI来分析相关图像。对于定量分析，为所有标记的细胞器创建ROI集合。然后，检查各个ROI的相应超微结构，并根据形态元素对其进行分类。</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文介绍的方法利用了基于冷冻切片的切片 CLEM 的最新进展 - IF 标记的高灵敏度以及 FM 和 EM 14,24 之间的准确（<100 nm 误差）相关性。这导致了一种方法对荧光标记稀缺的内源性蛋白质具有灵敏度，并且能够将其高精度地覆盖到 EM 超微结构上。因此，该方法避免了外源性标记蛋白的（过度）表达和使用灵敏度较低的EM标记的需要。CLEM在饥饿细胞中内源性LC3上的实例显示了该方法的可行性，而无需使用溶酶体抑制剂。
使用 Tokuyasu 方法获得的解冻冷冻切片是免疫电镜的理想样品，因为与树脂切片不同，它们对抗体具有渗透性。结合温和的固定和对比程序，这通常比其他方法产生卓越的标记效率，而不会影响详细的超微结构，并且出色地可视化细胞膜 12,25,26。此外，冷冻切片与荧光显微镜高度兼容，这使其成为CLEM的宝贵底物。经典的免疫金标记和冷冻切片上的CLEM都为理解亚细胞组织提供了开创性的见解14,27,28,29,30。
目前，由于不断发展和优化 14,20,24,31,32,33,34 提高了该方法的质量、适用性和准确性，CLEM 在解冻冷冻切片上的应用正变得越来越普遍。现在，通过对大型IF和EM图像图块集进行精确关联，该技术有助于筛选荧光标记的内源性细胞成分的超微结构14,32,33。与传统的免疫电镜相比，这是一个优势，在传统的免疫电镜中，寻找金标记结构通常需要高放大倍率，因此更加费力和耗时。正是由于这个原因，LC3 对超微结构的定位极大地受益于 CLEM。LC3阳性细胞器常见于自噬清除受阻时（即，当细胞用BafA1或pH升值剂处理时），而自噬细胞器在未改变或饥饿的细胞中迅速清除，导致非常低的稳态水平。在这种情况下，使用经典免疫电镜寻找LC3标记的细胞器可能具有挑战性，而CLEM具有明显的优势。
以前，树脂切片上的CLEM应用于使用LC3-GFP异位表达或LC3-GFP-RFP串联探针35,36,37,38,39的研究。在这些研究中，荧光成像在包埋之前或直接在丙烯酸树脂部分40中进行，随后通过EM筛选样品。树脂包埋有几个优点;自噬体超微结构通常保存完好，特别是如果材料是高压冷冻的 40.此外，重金属染色树脂包埋材料的对比度通常比铀基染色的冷冻切片更明显。树脂包埋切片与容积电镜方法兼容，例如阵列断层扫描、FIB-SEM 或连续块面 SEM，而冷冻切片则不兼容。在包埋前进行成像的方法中，活细胞成像是冷冻切片的 CLEM 中不可用的选项41。与这些替代方案相比，CLEM在冷冻切片上的主要优势是高IF信号，允许稀有蛋白质的免疫定位，而无需膜通透或过表达。这避免了潜在的膜提取、过表达伪影42 和受试者的基因修饰，再加上 IF 和 EM 中大面积相关的可能性，使其成为研究 LC3 和自噬的绝佳工具。
在这里，将切面 CLEM 应用于饥饿的 HEPG2 细胞表明，LC3 主要定位于被鉴定为自噬体的结构。此外，在自体溶酶体中发现了一些弱荧光斑点。这与用 BafA19 处理的细胞形成鲜明对比，反映了一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体蛋白就会迅速降解。总体而言，数据表明，解冻冷冻切片的 CLEM 可以提供有关天然条件下 LC3 介导的自噬的见解。该数据还突出了该技术的灵敏度，因为即使在仅含有低水平完整LC3表位的自体溶酶体中也能检测到LC3。通过在不同模型和条件下对 LC3 进行成像来进一步应用该技术将提高我们对自噬和其他 LC3 介导的生物过程的理解，例如 LC3 相关的吞噬作用或 ATG8 与单膜的结合。
除自噬外，切面CLEM还可应用于其他罕见事件或结构，如细胞分裂、感染、组织中的罕见细胞类型、动粒、原代纤毛或细胞类型特异性细胞器。IF对感兴趣的受试者进行有效筛选可以极大地促进这些稀有物质的超微结构研究。此外，研究表明14 该技术可用于以比经典免疫电镜更灵敏的方式定位蛋白质。调整固定长度可以进一步扩展这种灵敏度，从而允许对丰度非常低或抗原性差的蛋白质进行超微结构定位。最后，切片CLEM方法简化了定量细胞器的快速选择，有助于对给定蛋白质的超微结构分布进行更稳健的分析。
冷冻切片的CLEM需要冷冻切片的设备和专业知识。在可以使用这些工具（例如冷冻切片机）的组中，剖面CLEM的实施非常简单，只需要使用自动宽视场显微镜即可使用，这是大多数实验室都可以使用的设置。此外，该方法在全球的EM设施中可用。由于截面CLEM结合了已建立的IF和EM方法的应用，因此该方法很容易适应，并且可以与例如断层扫描20,33,43，有限数量的切片44的连续切片体积EM或超分辨率显微镜45结合使用。该方法的这种多功能性支持应用于广泛的生物学问题。

自噬是细胞质蛋白和细胞器清除和再循环的关键过程。大自噬（以下简称自噬）的过程涉及双膜细胞器、自噬体的形成，它允许细胞包围细胞质分子和细胞器以进行溶酶体降解。在大多数细胞中，自噬发生在基础水平，并响应细胞条件（如饥饿或细胞应激）而上调。自噬要么以底物特异性方式发生，靶向特定结构或蛋白质进行降解，要么作为包含部分胞质溶胶的非选择性本体过程发生。在选择性自噬中，自噬体是通过将 Atg8 家族蛋白（微管相关蛋白 1A/B 轻链 3A/B/C [LC3] 和 GABARAP）与来自回收内体、高尔基体和/或内质网 （ER） 的膜结合而形成的1。LC3 直接或 通过 选择性自噬接头（如 P62/SQSTM）识别胞质溶胶中的自噬货物。然后，新的自噬膜可以与LC3结合，膨胀并融合，形成一个完整的双膜，包裹货物，称为自噬体。自噬体成熟并最终与内体或溶酶体融合，此后自噬货物和接头被降解2.
关于自噬体形成、成熟和融合的研究通常利用光学显微镜技术。LC3的荧光显微镜通常用于评估不同条件下自噬体的数量和细胞定位。此外，通过在所谓的串联探针中将 LC3 偶联到 pH 敏感的 GFP 和 pH 稳定的 RFP，可以测量活细胞中自噬的总通量作为 GFP 荧光损失的函数3。这些方法是研究人员了解不同条件下自噬的作用和机制的宝贵工具。另一个宝贵的工具是电子显微镜 （EM），它揭示了自噬细胞器在自噬不同阶段的超微结构 4,5,6,7,8。迄今为止，EM 仍然是通过形态区分不同的自噬膜来识别自噬体形成的精确阶段的首选方法：吞噬体（双膜未完全闭合）、自噬体（胞质货物周围的闭合双膜）和自噬酶体（[部分] 自噬膜丢失）。然而，没有分子信息的形态学容易出现错误识别或歧义。免疫电镜是同时对自噬细胞器进行分子表征和形态学分类的最全面方法。例如，在解冻的冷冻切片上对 LC3 进行免疫金标记，可以对 LC3 进行超微结构定位，并精确鉴定 LC3 标记的细胞器9。
EM 的一个缺点是视野小，需要高放大倍率来观察自噬膜的精细超微结构，并且在免疫 EM 的情况下，需要定位标记目标蛋白质的标记。由于它们的稀缺性和低蛋白质水平，这通常会阻碍自噬体的定量 EM 分析。为了增加自噬体的数量，细胞通常被饿死并用巴弗洛霉素A1（BafA1）处理，BafA1是一种溶酶体酸化和降解的抑制剂。如果没有 BafA1 处理，由于这些细胞器的稀缺性，通过 EM 寻找自噬体是耗时的。本文中介绍的方法通过荧光标记和在荧光显微镜中解冻的冷冻切片上对内源性LC3进行成像来解决这个问题，然后再进一步准备EM。然后，荧光图像引导在EM中寻找LC3标记的结构。采集后，将EM图像与荧光图像相关联，以将分子信息（LC3的存在）添加到细胞的超微结构中。这种“截面CLEM”方法大大提高了发现LC3标记结构的能力，特别是在未经处理的条件下，以便随后通过EM进行鉴定和分类。
该方法应用于饥饿的肝母细胞瘤衍生的HEPG210 细胞，以在未改变（即未使用BafA1）条件下寻找自噬体。发现的荧光点相对较少（在 90 nm 切片中每个细胞图谱少于一个），这与 LC311 的高周转率一致。LC3-puncta 的这种稀疏性强调了 CLEM 的价值;通过选择具有多个荧光点的区域在电镜中成像，以比传统免疫电镜更有效的方式发现和表征LC3阳性细胞器。这表明，大多数 LC3 阳性细胞器是自噬体，由它们的形态定义，这与在 BafA1 处理的细胞中获得的结果形成鲜明对比，其中自溶酶体更常见9。这些数据表明，使用截面CLEM，可以在超微结构水平上研究自噬，而无需抑制自噬流动。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

通过电子显微镜 （EM） 在超微结构水平上可视化自噬细胞器对于确定其身份和揭示对理解自噬过程很重要的细节至关重要。然而，电镜方法通常缺乏分子信息，阻碍了电镜获得的超微结构信息与基于荧光显微镜的特定自噬蛋白定位的相关性。此外，在未改变的细胞条件下，自噬体的稀有性阻碍了电镜的研究，这需要高放大倍率，因此提供了有限的视野。
为了应对这两个挑战，应用了一种基于荧光标记的截面相关光电子显微镜 （CLEM） 方法将常见的自噬体标记物 LC3 与 EM 超微结构相关联。该方法用于在荧光显微镜下快速筛选细胞，结合其他相关标记物进行LC3标记。随后，通过CLEM鉴定选定的LC3标记斑点的潜在超微结构特征。该方法应用于饥饿的细胞，而不添加溶酶体酸化抑制剂。
在这些条件下，LC3 主要存在于自噬体上，很少存在于自溶酶体中，其中 LC3 迅速降解。这些数据显示了这种方法的可行性和敏感性，表明CLEM可用于在天然条件下提供LC3介导的自噬的超微结构见解，而无需药物治疗或遗传改变。总体而言，该方法通过将光学显微镜与EM数据桥接起来，为自噬蛋白和其他稀缺抗原的超微结构定位研究提供了有价值的工具。

De Maziere等人最近发表了一种优化的免疫电镜方案，用于在超薄冷冻切片上标记LC3的免疫金。这项研究包括没有 BafA1 的饥饿条件，其中存在 LC3，但相对罕见且难以通过 EM 发现。在另一项研究中引入了一种切面 CLEM 方法，该方法使用荧光标记的灵敏度来可视化相对罕见和低表达的内源性蛋白质，并将其与 EM 超微结构14 相关联。在这里，通过使用优化的LC3标记方案作为CLEM方法的一部分，将这两种方法结合起来。
HEPG2细胞是具有相对较高水平基础自噬22的肝源性细胞，在固定在4%PFA中之前，在最小培养基（厄尔平衡盐溶液[EBSS]）中饥饿2小时。随后通过Tokuyasu超薄冷冻切片方法（第1-3节;参见Slot和Geuze12）进行样品制备，该方法与截面CLEM 14,23高度兼容。使用小鼠抗LC3一抗9对解冻的冷冻切片进行荧光标记（方案第4部分和图1）。此外，兔抗LAMP1用于指示内切溶酶体，其次是抗小鼠AlexaFluor488和抗兔AlexaFluor568二抗。将网格夹在盖玻片和载玻片之间，并在室温下在宽视场显微镜（100x 1.47 NA油物镜，sCMOS相机）上成像。
与传统的全细胞IF相比，薄切片荧光标记的一个优点是Z轴分辨率更高，因为切片的物理厚度为60-90 nm。随着Z分辨率的提高，LC3和LAMP1在薄片上的荧光标记显示出非常少的共定位（图2A）。在用溶酶体抑制剂（如 BafA1）处理的细胞中，发生高共定位，因为溶酶体封闭的 LC3 保持未降解9。在未经处理的细胞中，LC3 在与酶活性的 LAMP1 阳性溶酶体接触后迅速降解，因此在这些条件下共定位很少见。通常，观察到每个细胞谱少于一个LC3点。这表明即使在饥饿的条件下，自噬体的周转也很快，使自噬体数量保持在较低水平。它还强调了使用CLEM寻找罕见的LC3标记结构的重要性，利用光学显微镜提供的大视场。此外，与金标记相比，荧光标记具有更高的灵敏度，能够识别出比传统免疫电镜更多的LC3阳性细胞器，进一步有助于其表征。
在获得完整的切片带状图块集后，从显微镜中检索网格，并使用UA和环出方法进行EM后染色（协议步骤4.4-4.6;图1F，G）。这种“环出”方法可确保网格上保留一层薄薄的UA：甲基纤维素，从而在EM中产生所需的对比度。层的厚度取决于UA：甲基纤维素吸干到滤纸上的速度和角度。拖动环路的速度过快会在网格上留下过多的 UA：甲基纤维素，并使 EM 中部分的外观变暗。拖动太慢会吸走过多的UA：甲基纤维素，导致染色太少和形态不良，并有网格掉出环路的风险。干网格上的“浮油”着色（图1G）表明合适的UA：甲基纤维素层厚度。
在循环和干燥后，网格在透射电镜中以荧光选择的ROI进行成像。通过将DAPI信号叠加到EM中可见的细胞核轮廓上，将IF和EM数据集相关联，从而生成包含两种模态信息的集成图像。
在 EM 中查找与在 IF 中选择的相同区域可能具有挑战性。因此，建议在 EM 中搜索时保留手头 IF 图块集的概览图像。用户应该在这两种模式中寻找可识别的特征，例如截面中的褶皱或撕裂、网格条或细胞核的排列。同样重要的是要记住，样品在 EM 中可能会旋转和镜像。具有特定功能的“取景器网格”可用于识别区域，以简化相关性（参见材料表）。
LC3阳性细胞器与EM超微结构的相关性表明，不同的点代表自噬的不同阶段（图2B）。尽管在冷冻切片中自噬体超微结构的保存具有挑战性，但经常观察到具有细胞质含量和双膜的细胞器（图2C，细胞器1-5中的箭头; 补充图S1），它们定义了自噬体的形态学特征。有趣的是，EM将相当弱的荧光斑点鉴定为LC3阳性自溶酶体（图2C，细胞器6;自噬内容标记为*），其特征是内容物致密和腔内囊泡。这表明在超薄冷冻切片的IF中可以看到非常少量的LC3，并表明尽管存在降解环境，但在稳态自溶酶体中可以检测到一些LC3。然而，大多数 LC3 阳性点状体代表自噬体，而自溶酶体非常罕见。这与 BafA1 处理的细胞形成鲜明对比，后者主要积累自溶酶体而不是自噬体9。
总之，该协议描述了一种截面CLEM方法，用于将荧光显微镜获得的分子信息与EM的超微结构联系起来。这种方法提高了免疫电镜的灵敏度，因为只有荧光团用于标记，而且荧光团通常比电镜探针产生更多的信号。该方法特别适用于使用超薄冷冻切片，在超薄冷冻切片中，可以获得比背景染色更高水平的特异性荧光。通过使用荧光来筛选罕见的结构或事件，并将选定的ROI与EM相关联，可以大大减少EM操作时间和相关成本。在未经处理的饥饿细胞中可视化LC3证明了该方法的灵敏度和可行性，表明LC3在这些条件下主要与自噬体结合，在自溶酶体中可见的水平非常低。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> 图 1：截面 CLEM 的示意图。 （A） 将明胶包埋细胞的冷冻切片收集在涂有 formvar 的铜网格上。（B） 网格在适当溶液的液滴上进行切片处理。（C） 网格用一抗和荧光二抗标记。（D） 网格夹在盖玻片和载玻片之间，溶于 50% 甘油中。（E）在宽视场显微镜中收集荧光图像。（F）从载玻片中取出网格，并通过铀酰染色进一步处理EM。（G） 干燥后，可以通过TEM对网格进行成像。（H）高倍率TEM图像图块集是从荧光数据中选择的区域获取的。（I）荧光显微镜和电镜的图像被关联和叠加。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> 图 2：饥饿的 HEPG2 细胞中 LC3 和 LAMP1 的 CLEM。 HEPG2细胞在EBSS中饥饿2小时，然后用4%PFA固定2小时。 （A）切片上LC3（绿色）和LAMP1（红色）的IF成像显示LC3点相对较少，与LAMP1的共定位很少。（B） 通过叠加基于 DAPI 和核轮廓的两种成像模式（虚线，右图），将来自 IF（左图）的分子信息与 EM（中图）中获得的超微结构信息联系起来。如方框1（右图）所示，各个LC3标记区室的超微 结构如C所示。（C） LC3阳性隔室的超微结构。左侧显示CLEM图像，右侧显示伪彩色（米色）EM图像（未彩色EM图像显示在 补充图S1中）。内自噬体膜和外自噬体膜分别用白色和黑色箭头表示。实施例6中自溶酶体内的自噬内容用*表示。比例尺 = 10 μm （A）、1 μm （B）、200 nm （C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
补充图S1：LC3阳性细胞器的无色EM图像。 （A-F）伪彩色示例1-6的无色EM图像如图 2C所示。通过LC3荧光选择细胞器， 如图2所示。内自噬体膜和外自噬体膜分别用白色和黑色箭头表示。实施例6中自溶酶体内的自噬内容用*表示。比例尺 = 200 nm。缩写：AL = 自溶酶体;AP = 自噬体;M = 线粒体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充文件 1：本研究中使用的缓冲液和溶液。 本补充文件包含制作本研究中使用的缓冲液和溶液所需的配方和方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>

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Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

在这里，我们提出了一种基于内源性荧光标记的优化截面相关光电子显微镜的方案，作为研究稀有蛋白质与细胞超微结构相关的定位的工具。这种方法的力量通过内源性LC3在饥饿细胞中的超微结构定位而得到证明，而没有巴弗洛霉素处理。

内源性LC3的超微结构定位-截面相关光电子显微镜

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

几十年来，在细胞超微结构的背景下定位蛋白质一直是一种强大的研究工具。通过该协议，我们扩展了丰度低或难以定位的蛋白质。我们使用荧光显微镜以灵敏和可筛选的方式标记蛋白质，并将其与电子显微镜相结合以重新填充细胞的超微结构。在这里，我们将展示自噬蛋白的截面CLEM，但它实际上可以应用于任何对细胞超微结构感兴趣的生物学问题，特别是在罕见事件的研究中。与我一起演示该程序的是我们实验室的高级研究技术人员 Tineke Veenendaal。首先，在预热至37摄氏度的PBS中，用1%明胶代替含有0.15%甘氨酸的PBS。刮取明胶中的细胞并将其转移到微量离心管中。在室温下在微量离心机中以6,000G沉淀细胞一分钟，然后在不干扰沉淀的情况下除去明胶。将加热至37摄氏度的12%明胶加入沉淀中，并用移液器吸头或预热至相同温度的玻璃牧场移液器轻轻重悬。在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后在 6， 000 G 下沉淀细胞一分钟。将明胶在冰上凝固 30 分钟。要从试管中取出明胶包埋的细胞，请用剃须刀片将含有沉淀的管端从试管的其余部分切下。然后用细胞沉淀垂直于第一次切口将管端切成两半。将含有细胞沉淀的两个管端半部分放入 2.3 摩尔蔗糖中，并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。这导致细胞沉淀的一半略微收缩并从塑料管中脱落。从蔗糖中取出带有明胶包埋细胞沉淀的管半部分，然后用镊子从塑料管中取出细胞沉淀半部分。用剃须刀片手动将颗粒切成适当大小的块，并在切割过程中使用立体解剖显微镜放大受试者。将细胞块在 4 摄氏度的 2.3 摩尔蔗糖中孵育过夜。将它们放在铝制样品架销上。在块的边缘留下足够的蔗糖，使其在块和销钉之间形成一个薄环。快速冷冻并将其储存在液氮中。修剪块的前部以使其表面变平，以获得大约 250 纳米厚的截面。然后用刀角将 50 到 100 微米切入样品块面的侧面，修剪块的侧面。修剪样品块面的四个边将形成一个大约 250 x 375 微米的矩形。从突出的矩形中切开一条带状，确保切片的厚度在 70 到 90 纳米之间，并具有银金色光泽。用一根棍子上的一根头发引导部分远离金刚石刀的边缘，形成一条长丝带。通过将 3 毫米的拾音环浸入 2.3 摩尔蔗糖和 2% 甲基纤维素的一对一混合物中来拾取色带。将环插入切片机的冷冻室中，一旦液滴开始冻结，立即将液滴轻轻按压在切片上，将其拾取。从冷冻室中取出环。等到液滴完全解冻，然后将液滴压在准备好的网格上。将带有切片的网格放在大约 1 毫升的 PBS 中，放入小培养皿或多孔板中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在石蜡膜上处理约75微升液滴上的网格，并在室温下开始PBS甘氨酸洗涤。在室温下，用由 0.1% 牛血清白蛋白 C 和 0.5% 鱼皮明胶制成的封闭缓冲液在 PBS 中孵育网格 10 分钟作为封闭步骤。在PBS的封闭缓冲液中稀释一抗，并在室温下将网格在约10微升液滴上孵育1小时。在室温下用PBS中的0.1%牛血清白蛋白洗涤网格五次。稀释PBS中封闭缓冲液中的二抗和DAPI。然后将网格在大约 10 微升液滴上在室温下孵育 30 分钟或更长时间，然后在 PBS 中洗涤网格五次，如前所述。为了安装用于光学显微镜的样品，在室温下将网格浸入蒸馏水中的50%甘油中两次，持续五分钟。在50%甘油中，在载玻片和盖玻片之间放置一个盖玻片，确保各部分朝向盖玻片。对于光学显微镜，将带有夹层网格的载玻片带到带有自动载物台的宽视场显微镜上。选择一个高放大倍率油物镜，并创建截面带的图像平铺集。接下来，对于拆卸和电子显微镜或电镜对比，在载玻片盖玻片夹层的侧面加入10微升蒸馏水，等待毛细管作用填充玻璃盖玻片夹层界面。小心地取下盖玻片，不要将浸油混合到甘油中。用镊子取出网格，并在室温下将它们浸入蒸馏水中三次，以洗掉50%的甘油。用无绒纸巾小心地擦干网格的背面，并将网格部分面朝下放在蒸馏水滴上。为了在电子显微镜下对切片进行染色以进行对比，请在室温下将它们与醋酸铀酰孵育五分钟。通过将液滴放在冰上金属板上的石蜡膜上来冷却醋酸铀酰甲基纤维素溶液。然后用这种冰冷的溶液清洗网格两次，并将它们在溶液中孵育 10 分钟。通过将网格干燥环插入每个网格下方的醋酸铀酰甲基纤维素液滴中并轻轻提起，直到网格从液滴上拉出，从而将网格拉出网格。要吸干多余的溶液，请以大约 60 度角将环接触到无绒滤纸上，然后沿着滤纸缓慢拖动，直到不再吸收溶液。将带有网格的环放在合适的架子上，并在室温下干燥 10 分钟以上。使用光学显微镜获得的概览，在透射电子显微镜或TEM中定位成像的感兴趣区域，并在光学显微镜数据集上注释ROI。选择区域后，在 TEM 中获取放大倍率为 20， 000 倍至 50， 000 倍的图像图块。在后处理软件中重建图像图块集。在电子显微镜下根据DAPI信号和荧光以及核轮廓进行相关性。移动图像以精确叠加它们并准确执行手动关联。肝母细胞瘤衍生的HEPG2细胞在EBSS中饥饿2小时，然后用4%三聚乙醛固定2小时。切片上 LC3 和 LAMP1 的 IF 成像显示 LC3 点相对较少，并且与 LAMP1 的共定位很少。通过叠加基于DAPI和核轮廓的两种成像模式，将IF的分子信息与电子显微镜中获得的超微结构信息联系起来。LC3阳性细胞器与EM超微结构的相关性表明，不同的点代表自噬的不同阶段。此处显示了各个LC3标记隔室的超微结构，如图1所示。左图为相关光电子显微镜图像，右图为伪彩色电子显微镜图像。内外自噬体膜由白色和黑色箭头表示。有趣的是，EM 将相对较弱的荧光斑点鉴定为 LC3 阳性自溶酶体，其特征是内容物密集和腔内囊泡。这揭示了超薄冷冻切片的 IF 中 LC3 可见度极小，这表明尽管存在降解环境，但在稳态自溶酶体中仍可检测到 LC3。然而，LC3阳性点主要代表自噬体，少数代表自溶酶体。对于想要进行免疫金标记而不是切片 CLEM 的研究人员，此处描述的方案和提示也完全适用于免疫金标记。我们最初将切片CLEM应用于低丰度的内体调节蛋白，并首次显示了它们的内源性超微结构定位。

Research

JoVE Journal

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纳米有限元分析：蛋白质定位的光激活定位显微镜和电子显微镜

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