Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Vi takker vores kolleger på Center for Molekylær Medicin ved University Medical Center Utrecht for frugtbare diskussioner og feedback. Vi takker tidligere og nuværende kolleger i Klumperman-laboratoriet for løbende forbedringer i vores mikroskopiteknologier. EM-infrastrukturen, der anvendes til dette arbejde, er en del af forskningsprogrammet National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansieret af det hollandske forskningsråd (NWO), projektnummer 184.034.014 til JK.

1. Fremstilling af værktøj og reagenser
BEMÆRK: For nødvendige reagenser, buffere og opløsninger, se Supplerende fil 1 eller 12 for at få flere oplysninger. For detaljer relateret til alle materialer, reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol, se Tabel over materialer.
<ol><li>Fikseringsmidler<ol><li>Forbered 0,2 M fosfatbuffer (PB) eller 0,2 M RØR, HEPES, EGTA,MgSO4 (PHEM) buffer, som beskrevet i supplerende fil 1, til brug som base for fikseringsopløsninger. BEMÆRK: Fikseringsmidler bufferes rutinemæssigt i 0,1 M PB eller PHEM-buffer for at buffere mod forsuring forårsaget af aldehydreaktionen med det biologiske materiale.</li>
		<li>Da kvaliteten af paraformaldehyd (PFA) er nøglen til pålidelig fiksering af prøvernes ultrastruktur, skal du bruge EM-grade PFA. For at følge denne protokol skal du bruge 16 % stamopløsninger, fremstillet af PFA-piller af høj kvalitet (se supplerende fil 1). FORSIGTIG: Paraformaldehyd er et farligt kemikalie (faresætningerne H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Når du arbejder med PFA, skal du bære beskyttelsesudstyr (handsker, laboratoriefrakke og beskyttelsesbriller) og arbejde i en kemisk hætte. Affald, der indeholder PFA, skal indsamles og bortskaffes efter institutternes retningslinjer og regler.</li>
		<li>Kombiner 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (i demineraliseret vand [dH 2 O]) og 5 ml dH2O for at fremstille en fikseringsopløsning på 4% PFA.</li>
		<li>Valgfrit: Tilsætning af 0,02% -0,5% glutaraldehyd (GA) til den fikserende opløsning fra trin 1.1.3 forbedrer bevarelsen af ultrastrukturen, men reducerer prøvens antigenicitet mod mange antistoffer. BEMÆRK: Når GA-fiksering ønskes, skal du bruge EM-grade GA fra en passende leverandør. FORSIGTIG: Glutaraldehyd er et farligt kemikalie (faresætningerne H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Arbejd i en kemisk hætte og brug beskyttelsesudstyr (handsker, laboratoriefrakke og beskyttelsesbriller), når du manipulerer GA. Affald, der indeholder GA, skal indsamles og bortskaffes i henhold til institutternes retningslinjer og regler.</li>
	</ol></li>
	<li>Værktøj og materialer<ol><li>Rids overfladen af aluminiumsprøveholderstifter og soniker dem i ethanol 3 x 10 min for at fjerne metalrester og sikre optimal vedhæftning, når gelatineindlejrede celleblokke er monteret på stifterne.</li>
		<li>Brug en opbevaringsbeholder, der er egnet til at opbevare aluminiumsprøveholderstifterne med deres prøver i flydende nitrogen (LN2).</li>
		<li>Lav en manipulator ved at fastgøre et enkelt hår eller øjenvipper til enden af et træspyd ved hjælp af neglelak.</li>
		<li>Lav en afhentningsløjfe. Bøj en 0,3 mm tyk rustfri ståltråd omkring en rund stang med en diameter på 3 mm, og drej enderne sammen, så der dannes en løkke i den ene ende. Indsæt de snoede ender i en pipettespids. Indsæt et træspyd fra den anden ende og fastgør med lim eller harpiks. BEMÆRK: En pickup-sløjfe er også kommercielt tilgængelig (se materialetabel).</li>
		<li>For at forberede gittertørringssløjferne skal du følge de samme trin for at lave pickup-sløjfer: Dann en rustfri ståltråd i en 4 mm løkke og fastgør på en stor pipettespids med lim eller harpiks.</li>
		<li>Overtræk gitterene ved hjælp af en tynd understøttende film såsom formvar (protokol i supplerende fil 1). Før brug skal du belægge gitterne med et tyndt lag kulstof. BEMÆRK: Brugsklare gitre er kommercielt tilgængelige (se materialetabel). Formvar-coatede gitre kan opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur (RT); kulstofbelagte gitre kan opbevares i flere måneder hos RT.</li>
		<li>Forbered rene glasskinner og store dæksler (24 mm x 24 mm er ideel med 25 mm brede glasskinner), som i 13.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fastgørelse og prøveforberedelse
<ol><li>Fiksation<ol><li>Brug fikseringsmidlet fremstillet i trin 1.1.3 (4% PFA i 0,1 M PB). For klæbende cellelinjer dyrkes kultur 1-5 × 10 6 celler i6 cm skåle. Tilsæt fikseringsmidlet til dyrkningsmediet i forholdet 1:1 og inkuber prøven i 5 minutter ved RT. Derefter udskiftes den mediumfikserende blanding kun med fikseringsmiddel og inkuberes i 2 timer ved RT. BEMÆRK: Nøjagtige celletal, sammenløb og dyrkningsbetingelser kan variere afhængigt af det anvendte modelsystem.</li>
		<li>Opbevar prøverne natten over eller i op til 3-4 uger i 0,5 % PFA i 0,1 M PB ved 4 °C. BEMÆRK: GA kan føjes til fikseringen (se trin 1.1.4), og fikseringslængden kan ændres for at finde en optimal balance mellem bevarelsen af morfologi og antigenicitet, som varierer pr. prøve og mærkning. Du kan finde flere oplysninger under14.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksempel på integrering<ol><li>Vask fadet med faste celler 3x med PBS ved RT. Udskift derefter med PBS indeholdende 0,15% glycin og inkuber i 10 minutter ved RT.</li>
		<li>Udskift PBS indeholdende 0,15% glycin med 1% gelatine i PBS forvarmet til 37 °C, og skrab og overfør cellerne i 1% gelatine til et mikrocentrifugerør. Pellet cellerne ved 6.000 × g i 1 min ved RT i en mikrocentrifuge. Fjern derefter 1% gelatinen uden at forstyrre pelleten, og tilsæt 12% gelatine opvarmet til 37 ° C. Opslæmm cellepillen igen ved forsigtigt pipettering op og ned med pipettespidser eller Pasteur-pipetter af glas, der er forvarmet til 37 °C.</li>
		<li>Der inkuberes ved 37 °C i 10 minutter; Pellet derefter cellerne ved 6.000 × g i 1 min. Størkn gelatinen på is i 30 min.</li>
		<li>For at fjerne de gelatineindlejrede celler fra røret skal du skære rørenden, der indeholder pelleten, fra resten af røret med et barberblad. Skær derefter vinkelret på det første snit rørenden med cellepillen i halvdelen.</li>
		<li>De to rørendehalvdele, der indeholder den gelatineindlejrede cellepellet, inkuberes i 2,3 M saccharose i 10 minutter ved 4 °C. Dette får de gelatineindlejrede cellepillehalvdele til at krympe lidt og løsne sig fra plastrøret. BEMÆRK: De gelatineindlejrede cellepiller skal opbevares ved 4 °C eller iskolde så meget som muligt for at undgå, at 2,3 M-saccharose bliver for tyktflydende og gelatinen for blød. Under manipulation af de gelatineindlejrede cellepiller i de næste trin skal du kun arbejde med en prøve ad gangen og holde de andre på is eller arbejde i et koldt rum (~ 4 ° C). Undgå overophedning af de gelatineindlejrede cellepiller ved sollys, varme mikroskoplamper eller andre varmekilder.</li>
		<li>Rørhalvdelene fjernes med den gelatineindlejrede cellepille fra 2,3 M saccharose. Fjern derefter de gelatineindlejrede cellepillehalvdele fra plastrørhalvdelene med pincet. Skær pillen manuelt til blokke af en passende størrelse (~ 1 mm3) med et barberblad. Brug et stereodissekeringsmikroskop til at forstørre motivet under skæringen.</li>
		<li>De gelatineindlejrede celleblokke tilføres 2,3 M saccharose i 3-16 timer, og ende-over-ende drejes i en rotor ved 4 °C.</li>
		<li>Anbring en gelatineindlejret celleblok på en aluminiumsprøveholderstift (se trin 1.2.1). Lad nok 2,3 M saccharose rundt om blokkens kanter, så den danner en tynd 'krave' mellem blokken og stiften. Undgå for meget 2,3 M saccharose, der dækker toppen af blokken. Snap-frys og opbevar i LN2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sektionering
<ol><li>Beskæring (se også12)<ol><li>Tag en stift med en blok gelatineindlejrede celler ud af LN2-lageret , og placer den i et kryomikrotom, der er indstillet til -80 °C.</li>
		<li>Trim forsiden af blokken for at flade overfladen og opnå ~ 250 nm sektioner. Dyp 3 mm sløjfen i opsamlingsopløsningen (1:1 2,3 M saccharose og 2% methylcellulose), indsæt løkken i mikrotomets kryokammer, og vent, indtil der begynder at dannes is i dråben (typisk 5-7 s). Tag derefter straks sektionen op ved hurtigt, men forsigtigt at trykke dråben mod dem. Fjern løkken fra kryokammeret, vent, indtil dråben er optøet helt, og tryk dråben på et glasglas.</li>
		<li>Kontroller celleorienteringen ved toluidinblå farvning af sektionerne.<ol><li>En dråbe toluidinblåt opløsning (se supplerende fil 1) anbringes oven på sektionerne på et glasglas og tørres på en 80 °C varmeplade, indtil dråbens kanter er tørre.</li>
			<li>Fjern glasglasset fra varmepladen, og skyl forsigtigt toluidinblåt væk med dH2O, og saml det i en egnet affaldsbeholder.</li>
			<li>Tør glasglasset og kontroller celleretningen i sektionerne gennem et simpelt bordlysmikroskop.</li>
		</ol></li>
		<li>Trim siderne af blokken ved at skære 50-100 μm ind i siden af prøveblokkens overflade med knivhjørnet. Trim fire sider af prøveblokkens overflade ved at dreje prøveholderen 90° efter trimning af hver side for at skabe et fremspringende ~250 μm x 375 μm rektangel. Vælg det fremspringende område baseret på celleretningen, der blev bestemt i det foregående trin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sektionering og afhentning<ol><li>Kryomikrotomet afkøles til -100 °C. Snit et bånd fra det fremspringende rektangel, sektionerne er 70-90 nm tykke og med en sølvfarvet gylden glans. Før sektionerne væk fra diamantknivens kant med et hår på en pind (se punkt 1.2.3) for at skabe et langt bånd (2-5 mm).</li>
		<li>Når der er dannet et passende bånd, skal du stoppe sektioneringen for at hente båndet. Dyp 3 mm opsamlingssløjfen i 2,3 M saccharose og 2% methylcellulose blandet 1:1, indsæt løkken i mikrotomets kryokammer, og vent, indtil dråben begynder at fryse (typisk 5-7 s). Derefter skal du straks samle sektionerne op ved hurtigt men forsigtigt at trykke dråben mod dem. Sløjfen fjernes fra kryokammeret, vent til dråben er optøet helt, og tryk dråben på et forberedt gitter (trin 1.2.6). BEMÆRK: Gitre med sektioner kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Mærkning og lysmikroskopi
<ol><li>Mærkning<ol><li>Placer gitterene med sektioner (figur 1A) med sektionssiden nedad på ~ 1 ml PBS i en lille skål eller multibrøndplade. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. BEMÆRK: Dette trin fjerner gelatinen, der er mellem cellerne; Gelatine er ikke nødvendig efter sektionering og forstyrrer den resterende protokol.</li>
		<li>Behandl gitterets sektionsside nedad på ~75 μL dråber på parafilm (se figur 1B). Start med PBS + 0,15% glycinvask (3 x 2 min) ved RT. Derefter inkuberes gitterene med 0,1% bovin serumalbumin (BSA)-c + 0,5% fiskeskindsgelatine (FSG) i PBS i 10 minutter ved RT som blokeringstrin. Fortynd primære antistoffer i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuber gitterene på ~ 10 μL dråber af denne opløsning i 1 time ved RT (figur 1C).</li>
		<li>Vask nettene i 0,1% BSA i PBS 5x ved RT. Derefter fortyndes sekundære antistoffer og 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; 10 μg/ml) i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuberes gitterene på ~10 μL dråber af denne opløsning i 30+ min ved RT (figur 1C). Vask ristene i PBS 5x ved RT. BEMÆRK: Eventuelt kan et sekundært antistof mærkes med 5, 10, 15 eller 20 nm kolloide guldpartikler konjugeret med protein A (PAG) til lokalisering af proteinet af interesse i EM. Hvis dette ønskes, inkuberes ristene med PAG i 20 minutter ved RT efter trin 4.1.3. Vask derefter 5x med PBS ved RT. Undgå samtidig brug af flere primære antistoffer, og vær opmærksom på PAG's reaktivitet over for forskellige arters IgG'er for at forhindre uønskede krydsreaktioner. Du kan finde flere oplysninger under12.</li>
	</ol></li>
	<li>Monteringsprøver til lysmikroskopi<ol><li>Nedsænk gitterene i 50% glycerol i dH 2 O2x 5 min ved RT. Sandwich gitterene mellem et glasglas og dæksel i 50% glycerol, et gitter pr. dækseddel, med sektioner mod dæksedlen (figur 1D). BEMÆRK: Kvaliteten af mærkningen kan forringes, når gitter holdes monteret i 50% glycerol i mere end 30 min. Det anbefales derfor at montere og afbilde to eller tre gitre ad gangen og lade de andre ligge på den sekundære mærkningsløsning.</li>
	</ol></li>
	<li>Lysmikroskopi<ol><li>Tag et glasglas med sandwichede gitre til et widefield-mikroskop med et automatiseret trin. Vælg et oliemål med høj forstørrelse (63x eller 100x). Opret et billedflisesæt af (en del af) båndet af sektioner (figur 1E). BEMÆRK: Nogle sekundære antistoffer kan danne fluorescerende aggregater på gitter, især omkring folder eller rifter i sektionerne. Derudover indeholder nogle celletyper og væv autofluorescerende strukturer. Hvis sådanne problemer forventes, anbefales det at inkludere et negativt kontrolgitter, der ikke er inkuberet med primært antistof.</li>
	</ol></li>
	<li>Afmontering og EM kontrasterende<ol><li>Der tilsættes 10 μL dH2O på siden af glasglide-coverslip-sandwichen, og vent på, at kapillærvirkningen fylder glasdækslets sandwichgrænseflade. Fjern forsigtigt dækslet uden at blande nedsænkningsolie i glycerolen. Hent ristene med pincet og nedsænk i dH2O 3x ved RT for at vaske 50% glycerol af. BEMÆRK: Olie kan forstyrre uranylfarvning og forringe EM-kontrast.</li>
		<li>Tør forsigtigt bagsiden af gitteret med fnugfrit silkepapir. BEMÆRK: Hvis prøven også var mærket med kolloide guldpartikler, skal du udføre følgende trin: Placer gitteret med sektioner med sektionssiden nedad på PBS-dråber og vask 2x ved RT. Postfix i 1% GA i 5 minutter ved RT (se forsigtighedsbemærkning under 1.1.4). Vask i PBS 2x hos RT.</li>
		<li>Placer gitterets sektionsside nedad på dH2O-dråber og vask 8x ved RT.</li>
		<li>For at plette sektionerne for kontrast i EM inkuberes med uranylacetat (UA), pH 7, i 5 minutter ved RT (figur 1F).</li>
		<li>Før gitterene placeres, afkøles UA:methylcellulose, pH 4, ved at placere dråber på parafilm på en metalplade på is. Derefter vaskes ristene med iskold UA:methylcellulose, pH 4, 2x og inkuberes med iskold UA:methylcellulose, pH 4, i 10 minutter (figur 1F). FORSIGTIG: Uranylacetat er et farligt kemikalie (faresætningerne H300, H330, H373, H411). I trin, der kræver UA, skal du arbejde i en kemisk hætte og bære beskyttelsesudstyr (laboratoriefrakke, handsker og beskyttelsesbriller). Indsamle og bortskaffe affald, der indeholder UA i henhold til institutternes retningslinjer og regler.</li>
		<li>Loop gitterene ud ved at indsætte en gittertørringssløjfe i UA: methylcellulosedråben under gitteret og løft den forsigtigt, indtil gitteret trækkes af dråben12. Tør det overskydende UA:methylcellulose væk ved at berøre løkken i en ~60° vinkel (sektioner nedad) på fnugfrit filterpapir (se materialetabel) og trække det langsomt langs papiret, indtil der ikke absorberes mere UA:methylcellulose. Anbring derefter løkken med gitteret i et passende stativ og lad det tørre i >10 minutter ved RT (figur 1G).</li>
	</ol></li>
</ol>5. EM
<ol><li>Brug oversigten opnået ved lysmikroskopi til at lokalisere et område af interesse (ROI) til billeddannelse i transmissionselektronmikroskopet (TEM; Figur 1H). Anmærk ROI på lysmikroskopidatasættet. Når et område er valgt, skal du hente et billedfelt med 20.000x-50.000x forstørrelse i TEM. Rekonstruer billedflisesættet i efterbehandlingssoftware15,16.</li>
</ol>6. Korrelation og analyse
<ol><li>Indlæs lysmikroskopien og EM-datasættet i passende billedbehandlingssoftware, f.eks. ImageJ/Fiji17, ec-CLEM-ekstramodulet i Icy18 eller Photoshop. Beskær og roter lysmikroskopidatasættet, så det passer til EM-feltet.<ol><li>Udfør korrelationen baseret på DAPI-signal i fluorescens og nukleare konturer i EM (figur 1I). Skift billederne for at overlejre dem præcist og udfør den manuelle korrelation nøjagtigt. For at gøre tilgangen mere præcis skal du anvende landemærkebaseret korrelation gennem for eksempel ec-CLEM-pluginet i Icy eller BigWarp-pluginet i ImageJ for at korrelere billederne gennem manuelt valg af tilsvarende punkter. En detaljeret, trinvis protokol for korrelation med ec-CLEM er tilgængelig19. BEMÆRK: Denne fremgangsmåde fungerer også godt ved brug af bimodale fiduciale sonder20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysér de korrelerede billeder ved at vælge ROI'er baseret på fluorescerende signal i et passende program (f.eks. ImageJ). Til kvantitativ analyse skal du oprette en samling ROI'er for alle mærkede organeller. Kontroller derefter den tilsvarende ultrastruktur af de enkelte ROI'er og klassificer dem baseret på morfologiske elementer.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Metoden, der præsenteres her, drager fordel af de seneste fremskridt inden for kryosektionsbaseret CLEM på sektion - den høje følsomhed af IF-mærkning og nøjagtig (<100 nm fejl) korrelation mellem FM og EM14,24. Dette resulterer i en metode med følsomhed over for fluorescerende mærkning knappe, endogene proteiner og evnen til at overlejre dette med høj præcision til EM-ultrastrukturen. Med denne metode undgår man således behovet for (over)ekspression af eksogent mærkede proteiner og brugen af mindre følsomme EM-etiketter. Metodens gennemførlighed er vist ved eksempler på CLEM på endogene LC3 i udsultede celler uden brug af lysosomale hæmmere.
Optøede kryosektioner opnået med Tokuyasu-metoden er ideelle prøver til immuno-EM, da de i modsætning til harpikssektioner er gennemtrængelige for antistoffer. Kombineret med mild fiksering og kontrasterende procedurer giver dette generelt fremragende mærkningseffektivitet i forhold til andre metoder uden at gå på kompromis med den detaljerede ultrastruktur og visualiserer fremragende cellemembraner 12,25,26. Desuden er kryosektioner meget kompatible med fluorescensmikroskopi, hvilket gør dem værdifulde substrater for CLEM. Både klassisk immunguldmærkning og CLEM på kryosektioner har givet skelsættende indsigt i forståelsen af subcellulær organisation 14,27,28,29,30.
I øjeblikket bliver anvendelser af CLEM på optøede kryosektioner mere udbredt som et resultat af løbende udviklinger og optimeringer 14,20,24,31,32,33,34, der har forbedret kvaliteten, anvendeligheden og nøjagtigheden af tilgangen. Nu, ved nøjagtig korrelation af store IF- og EM-billedfliser, letter teknikken screening for ultrastrukturen af fluorescerende mærkede endogene cellulære komponenter 14,32,33. Dette er en fordel i forhold til klassisk immun-EM, hvor søgningen efter guldmærkede strukturer typisk kræver høj forstørrelse og derfor er mere besværlig og tidskrævende. Det er derfor, at lokalisering af LC3 til ultrastrukturen i høj grad drager fordel af CLEM. LC3-positive organeller er almindelige, når autofagisk clearance er blokeret (dvs. når celler behandles med BafA1 eller pH-hævende midler), mens autofagiske organeller hurtigt ryddes i uændrede eller sultede celler, hvilket resulterer i meget lave steady-state-niveauer. Under sådanne forhold kan det være udfordrende at finde LC3-mærkede organeller ved hjælp af klassisk immun-EM, og CLEM giver en klar fordel.
Tidligere blev CLEM på harpikssektioner anvendt i studier med ektopisk ekspression af LC3-GFP eller en LC3-GFP-RFP tandemsonde 35,36,37,38,39. I disse undersøgelser blev fluorescensbilleddannelse udført før indlejring eller direkte i akrylharpiksafsnit40, og prøver blev efterfølgende screenet af EM. Der er flere fordele ved harpiksindlejring; Den autofagosomale ultrastruktur er generelt velbevaret, især hvis materialet er højtryksfrosset40. Desuden er kontrasten mellem tungmetalfarvet harpiksindlejret materiale generelt mere udtalt end uranylfarvede kryosektioner. Harpiksindlejrede sektioner er kompatible med volumetriske EM-metoder, såsom arraytomografi, FIB-SEM eller seriel blockface SEM, mens kryosektioner ikke er det. I tilgange, der udfører billeddannelse før indlejring, er levende cellebilleddannelse en mulighed41, der ikke er tilgængelig i CLEM på kryosektioner. Den vigtigste fordel ved CLEM på kryosektioner i forhold til disse alternativer er det høje IF-signal, hvilket muliggør immunlokalisering af sjældne proteiner uden behov for membranpermeabilisering eller overekspression. Dette undgår potentiel membranekstraktion, overekspressionsartefakter42 og genetisk modifikation af emnet, hvilket kombineret med muligheden for at korrelere store områder i IF og EM gør det til et fremragende værktøj til at studere LC3 og autofagi.
Her afslørede anvendelsen af CLEM på sektion på udsultede HEPG2-celler, at LC3 overvejende lokaliserede til strukturer identificeret som autofagosomer. Derudover blev der fundet nogle få svagt fluorescerende pletter i autolysosomer. Dette er i direkte modsætning til celler behandlet med BafA19 og afspejler den hurtige nedbrydning af autofagosomale proteiner, når autofagosomet smelter sammen med lysosomer. Samlet set viste dataene, at CLEM af optøede kryosektioner kan give indsigt i LC3-medieret autofagi under indfødte forhold. Dataene fremhæver også teknologiens følsomhed, da LC3 blev detekteret selv i autolysosomer, der kun indeholder lave niveauer af intakte LC3-epitoper. Yderligere anvendelse af denne teknik ved billeddannelse af LC3 i forskellige modeller og betingelser vil forbedre vores forståelse af autofagi og andre LC3-medierede biologiske processer, såsom LC3-associeret fagocytose eller konjugering af ATG8 til enkeltmembraner.
Ud over autofagi kan CLEM på sektion anvendes på andre sjældne hændelser eller strukturer, såsom celledeling, infektion, sjældne celletyper i væv, kinetochores, primære cilier eller celletypespecifikke organeller. Effektiv screening for emnet af interesse af IF kan i høj grad lette den ultrastrukturelle undersøgelse af disse sjældenheder. Desuden blev det vist14 , at teknikken kan bruges til at lokalisere proteiner på en mere følsom måde end klassisk immun-EM. Justering af fikseringslængden kan yderligere udvide denne følsomhed, hvilket muliggør ultrastrukturel lokalisering af meget lave rigelige eller dårligt antigene proteiner. Endelig letter CLEM-metoden hurtig udvælgelse af et kvantitativt antal organeller, hvilket letter en mere robust analyse af den ultrastrukturelle fordeling af et givet protein.
CLEM på kryosektioner kræver udstyr og ekspertise til kryosektionering. I grupper med adgang til disse værktøjer (f.eks. kryomikrotomer) er implementeringen af CLEM på sektionen ligetil og kræver kun tilgængeligheden af et automatiseret widefield-mikroskop, en opsætning, som de fleste laboratorier har adgang til. Desuden er metoden tilgængelig i EM-faciliteter over hele verden. Da on-section CLEM kombinerer anvendelsen af etablerede IF- og EM-metoder, er metoden let at tilpasse og kan kombineres med for eksempel tomografi 20,33,43, serielt sektionsvolumen EM i et begrænset antal sektioner 44 eller superopløsningsmikroskopi 45. Denne alsidighed i metoden understøtter anvendelser på en lang række biologiske spørgsmål.

Autofagi er en nøgleproces til clearance og genanvendelse af cytoplasmatiske proteiner og organeller. Processen med makroautofagi (i det følgende kaldet autofagi) involverer dannelsen af dobbeltmembranorganeller, autofagosomer, som gør det muligt for celler at omslutte cytoplasmatiske molekyler og organeller til lysosomal nedbrydning. Autofagi forekommer på et basalt niveau i de fleste celler og opreguleres som reaktion på cellulære tilstande, såsom sult eller cellulær stress. Autofagi forekommer enten på en substratspecifik måde, rettet mod specifikke strukturer eller proteiner til nedbrydning eller som en ikke-selektiv bulkproces, der omfatter dele af cytosolen. I selektiv autofagi dannes autofagosomer ved konjugering af Atg8-familieproteiner (mikrotubulusassocierede proteiner 1A / B lyskæde 3A/B/C [LC3] og GABARAP'er) til membraner afledt af genanvendelse af endosomer, Golgi og / eller endoplasmatisk retikulum (ER)1. LC3 genkender autofagisk last i cytosolen direkte eller via selektive autofagiadaptere såsom P62 / SQSTM. Nye autofagiske membraner kan derefter konjugeres til LC3, udvides og smelte sammen til dannelse af en færdig dobbeltmembran, der omslutter lasten - kaldet autofagosomet. Autofagosomet modnes og smelter til sidst sammen med et endosom eller lysosom, hvorefter den autofagiske last og adaptere nedbrydes2.
Undersøgelser af autofagosomdannelse, modning og fusion gør ofte brug af lysmikroskopiteknologier. Fluorescensmikroskopi af LC3 anvendes generelt til at vurdere antallet og cellulær lokalisering af autofagosomer under forskellige forhold. Ved at koble LC3 til pH-følsom GFP og pH-stabil RFP i en såkaldt tandemsonde kan den samlede strøm af autofagi måles i levende celler som en funktion af GFP-fluorescenstab3. Disse tilgange er værdifulde værktøjer for forskere til at forstå autofagiens rolle og mekanisme under forskellige forhold. Et andet uvurderligt værktøj er elektronmikroskopi (EM), som afslører ultrastrukturen af autofagiske organeller på forskellige stadier af autofagi 4,5,6,7,8. Til dato er EM stadig den valgte metode til at identificere de præcise stadier af autofagosomdannelse ved at skelne forskellige autofagiske membraner ved morfologi: fagopfor (dobbeltmembran ikke helt lukket), autofagosomet (lukket dobbeltmembran omkring cytosolisk last) og autolysosomet ([delvist] tab af den indre autofagiske membran). Morfologi uden molekylær information kan imidlertid være tilbøjelig til fejlidentifikation eller tvetydighed. Immuno-EM er den mest omfattende metode til samtidig molekylær karakterisering og morfologisk klassificering af autofagiske organeller. For eksempel tillader immunoguldmærkning af LC3 på optøede kryosektioner ultrastrukturel lokalisering af LC3 og præcis identifikation af LC3-mærkede organeller9.
En ulempe ved EM er det lille synsfelt, der følger med den høje forstørrelse, der kræves for at observere den fine ultrastruktur af autofagiske membraner og, i tilfælde af immuno-EM, at lokalisere etiketten, der markerer proteinet af interesse. På grund af deres knaphed og lave proteinniveauer hæmmer dette generelt den kvantitative EM-analyse af autofagosomer. For at øge antallet af autofagosomer sultes celler ofte og behandles med Bafilomycin A1 (BafA1), en hæmmer af lysosomal forsuring og nedbrydning. Uden BafA1-behandling er søgningen efter autofagosomer af EM tidskrævende på grund af manglen på disse organeller. Metoden præsenteret i dette manuskript løser dette problem gennem fluorescerende mærkning og billeddannelse af endogen LC3 på optøede kryosektioner i et fluorescensmikroskop før yderligere forberedelse til EM. De fluorescerende billeder styrer derefter søgningen efter LC3-mærkede strukturer i EM. Efter indsamling korreleres EM-billeder med fluorescensbillederne for at tilføje molekylær information - tilstedeværelsen af LC3 - til cellens ultrastruktur. Denne 'on-section CLEM' metode øger i høj grad evnen til at finde LC3-mærkede strukturer, især under ubehandlede forhold, til efterfølgende identifikation og klassificering af EM.
Denne metode blev anvendt på udsultede hepatoblastomafledte HEPG210-celler for at finde autofagosomer under uændrede (dvs. ingen BafA1 blev brugt) betingelser. Der blev fundet relativt få fluorescerende punkter, hvilket stemmer overens med den høje omsætning af LC311. Denne sparsomhed af LC3-punktik understregede værdien af CLEM; ved at vælge regioner med flere fluorescerende punkter, til billeddannelse i EM, blev LC3-positive organeller fundet og karakteriseret på en meget mere effektiv måde end gennem konventionel immun-EM. Dette afslørede, at størstedelen af LC3-positive organeller var autofagosomer, som defineret af deres morfologi, hvilket er i modsætning til resultaterne opnået i BafA1-behandlede celler, hvor autolysosomer er mere almindelige9. Disse data viser, at autofagi med CTEM på sektion kan studeres på ultrastrukturelt niveau uden behov for at hæmme autofagisk strømning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

Visualiseringen af autofagiske organeller på ultrastrukturelt niveau ved elektronmikroskopi (EM) er afgørende for at fastslå deres identitet og afsløre detaljer, der er vigtige for forståelsen af den autofagiske proces. Imidlertid mangler EM-metoder ofte molekylær information, hvilket forhindrer korrelationen mellem ultrastrukturel information opnået af EM til fluorescensmikroskopibaseret lokalisering af specifikke autofagiproteiner. Desuden hæmmer sjældenheden af autofagosomer i uændrede cellulære tilstande undersøgelse af EM, hvilket kræver høj forstørrelse og derfor giver et begrænset synsfelt.
Som svar på begge udfordringer blev en on-section korrelativ lyselektronmikroskopi (CLEM) metode baseret på fluorescerende mærkning anvendt til at korrelere en fælles autofagosomal markør, LC3, til EM ultrastruktur. Metoden blev brugt til hurtigt at screene celler i fluorescensmikroskopi for LC3-mærkning i kombination med andre relevante markører. Derefter blev de underliggende ultrastrukturelle træk ved udvalgte LC3-mærkede pletter identificeret af CLEM. Metoden blev anvendt på sultede celler uden tilsætning af inhibitorer af lysosomal forsuring.
Under disse forhold blev LC3 overvejende fundet på autofagosomer og sjældent i autolysosomer, hvor LC3 hurtigt nedbrydes. Disse data viser både gennemførligheden og følsomheden af denne tilgang, hvilket viser, at CLEM kan bruges til at give ultrastrukturel indsigt i LC3-medieret autofagi under indfødte forhold - uden lægemiddelbehandlinger eller genetiske ændringer. Samlet set præsenterer denne metode et værdifuldt værktøj til ultrastrukturelle lokaliseringsundersøgelser af autofagiproteiner og andre knappe antigener ved at bygge bro mellem lysmikroskopi og EM-data.

En optimeret immun-EM-protokol til immun-guldmærkning af LC3 på ultratynde kryosektioner blev for nylig offentliggjort af De Maziere et al.9. Denne undersøgelse omfattede udsultede forhold uden BafA1, hvor LC3 var til stede, men relativt sjælden og vanskelig at finde ved EM. En on-section CLEM-metode blev introduceret i en separat undersøgelse, der bruger følsomheden af fluorescensmærkning til at visualisere relativt sjældne og lavt udtrykte endogene proteiner og korrelere dette med EM-ultrastruktur14. Her kombineres disse to tilgange ved brug af den optimerede LC3-mærkningsprotokol som en del af en CLEM-tilgang.
HEPG2-celler, leverafledte celler med relativt høje niveauer af basal autofagi22, blev sultet i minimalt medium (Earles afbalancerede saltopløsning [EBSS]) i 2 timer før fiksering i 4% PFA. Dette blev efterfulgt af prøveforberedelse ved Tokuyasu-metoden til ultratynd kryosektion (afsnit 1-3; se Slot og Geuze12), som er meget kompatibel med CLEM 14,23 på sektionen. Optøede kryosektioner blev fluorescerende mærket (protokolafsnit 4 og figur 1) ved hjælp af museanti-LC3 primært antistof9. Derudover blev kanin-anti-LAMP1 brugt til at indikere endo-lysosomer, efterfulgt af anti-mus AlexaFluor488 og anti-kanin AlexaFluor568 sekundære antistoffer. Gitre blev klemt inde mellem et dæksel og glasglas og fotograferet på RT på et widefieldmikroskop (100x 1,47 NA oliemål, sCMOS-kamera).
En fordel ved fluorescensmærkning af tynde sektioner i forhold til konventionel helcelle IF er den øgede opløsning i Z, da sektionens fysiske tykkelse er 60-90 nm. Med denne forbedrede Z-opløsning afslører fluorescensmærkningen af LC3 og LAMP1 på tynde sektioner meget lidt colokalisering (figur 2A). I celler behandlet med lysosomale hæmmere, såsom BafA1, forekommer høj colokalisering, da lysosomalt lukket LC3 forbliver unedbrudt9. I ubehandlede celler nedbrydes LC3 hurtigt ved kontakt med enzymatisk aktive, LAMP1-positive lysosomer, og derfor er co-lokalisering sjælden under disse forhold. Generelt blev der observeret mindre end ét LC3-punctum pr. celleprofil. Dette indikerer, at selv under sultede forhold er omsætningen af autofagosomer hurtig, hvilket holder autofagosomtallene lave. Det fremhæver også vigtigheden af at bruge CLEM til at finde de sjældne LC3-mærkede strukturer ved hjælp af det store synsfelt, der leveres af lysmikroskopi. Desuden muliggør den højere følsomhed af fluorescensmærkning sammenlignet med guldmærkning identifikation af flere LC3-positive organeller end i konventionel immun-EM, hvilket yderligere hjælper deres karakterisering.
Efter at have erhvervet et fuldt flisesæt af båndet af sektioner, blev gitterene hentet fra mikroskopet og efterfarvet til EM ved hjælp af UA og loop-out-metoden (protokoltrin 4.4-4.6; Figur 1F,G). Denne "loop-out"-metode sikrer, at der forbliver et tyndt lag UA:methylcellulose på gitteret, hvilket skaber den ønskede kontrast i EM. Lagets tykkelse afhænger af den hastighed og vinkel, hvormed UA:methylcellulose blottes af på filtrerpapiret. Hvis du trækker sløjfen for hurtigt, kan det efterlade for meget UA:methylcellulose på gitteret og mørkere udseendet af sektionerne i EM. Hvis du trækker for langsomt, kan det trække for meget UA:methylcellulose væk, hvilket resulterer i for lidt farvning og dårlig morfologi og risikerer, at gitteret falder ud af løkken. Farven »olieforurening« (figur 1G) på tørre riste angiver en passende lagtykkelse på UA:methylcellulose.
Efter loop-out og tørring blev gitterene afbildet i en TEM ved ROI'er valgt ved fluorescens. IF- og EM-datasættene blev korreleret ved at overlejre DAPI-signalet til konturerne af kerner, der var synlige i EM, hvilket genererede et integreret billede, der indeholder information om begge modaliteter.
At finde det samme område i EM som valgt i IF kan være udfordrende. Det anbefales derfor at have et oversigtsbillede af IF-flisesættet ved hånden, mens du søger i EM. Brugere skal kigge efter genkendelige funktioner i begge modaliteter, såsom folder eller tårer i sektionerne, gitterstænger eller arrangement af kerner. Det er også vigtigt at huske på, at prøven kan fremstå roteret og spejlet i EM. 'Finder grids' med specifikke funktioner til at identificere områder kan bruges til at lette korrelationen (se materialetabel).
Korrelation mellem de LC3-positive organeller og EM-ultrastrukturen afslørede, at de forskellige punkterede repræsenterede forskellige stadier af autofagi (figur 2B). Selvom bevarelsen af autofagosomal ultrastruktur er udfordrende i kryosektioner, blev organeller med cytoplasmatisk indhold og dobbeltmembraner ofte observeret (figur 2C, pile i organeller 1-5; Supplerende figur S1), som definerer morfologiske træk ved autofagosomer. Interessant nok blev temmelig svage fluorescerende pletter identificeret af EM som LC3-positive autolysosomer (figur 2C, organel 6; autofagisk indhold er markeret *), kendetegnet ved tæt indhold og intraluminale vesikler. Dette viste, at meget små mængder LC3 er synlige i IF af ultratynde kryosektioner, og indikerede, at på trods af det nedbrydende miljø kan nogle LC3 påvises i steady-state autolysosomer. Størstedelen af LC3-positive punkter, repræsenterede imidlertid autofagosomer, mens autolysosomer var meget sjældne. Dette er i modsætning til BafA1-behandlede celler, som primært akkumulerer autolysosomer og ikke autofagosomer9.
Sammenfattende beskriver denne protokol en CLEM-metode på sektionen til sammenkædning af molekylær information opnået ved fluorescensmikroskopi til ultrastrukturen af EM. Denne metode øger følsomheden af immun-EM, da kun fluoroforer anvendes til mærkning, og disse giver generelt mere signal end EM-sonder. Metoden er især velegnet til anvendelse af ultratynde kryosektioner, hvor der kan opnås høje niveauer af specifik fluorescens over ubetydelig baggrundsfarvning. Ved at bruge fluorescens til at screene for sjældne strukturer eller hændelser og korrelere udvalgte ROI'er til EM, kan EM-driftstiden og tilknyttede omkostninger reduceres betydeligt. Metodens følsomhed og gennemførlighed demonstreres ved visualisering af LC3 i ubehandlede, udsultede celler, hvilket viser, at LC3 overvejende associerer til autofagosomer under disse forhold, med meget lave niveauer synlige i autolysosomer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over CLEM. (A) Kryosektioner fra gelatineindlejrede celler samles på et formvarbelagt kobbergitter. (B) Gitre behandles nedskæring på dråber af de relevante opløsninger. (C) Gitre er mærket med primære og fluorescerende sekundære antistoffer. (D) Gitre er klemt inde mellem en dæksel og glasglas i 50% glycerol. (E) Fluorescensbilleder indsamles i et widefieldmikroskop. (F) Gitre udtages fra glasglasset og viderebehandles ved uranylfarvning til EM. (G) Efter tørring kan gitterene afbildes af TEM. (H) TEM-billedflisesæt med høj forstørrelse hentes fra et område, der er valgt ud fra fluorescensdata. (I) Billeder fra fluorescensmikroskopi og EM er korrelerede og overlejrede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figur 2: CLEM af LC3 og LAMP1 i udsultede HEPG2-celler. HEPG2-celler blev sultet i 2 timer i EBSS før fiksering med 4% PFA i 2 timer. (A) IF-billeddannelse af LC3 (grøn) og LAMP1 (rød) på sektioner afslører relativt få LC3-punktering og lidt colokalisering med LAMP1. (B) Sammenkædning af molekylær information fra IF (venstre panel) til den ultrastrukturelle information opnået i EM (midterste panel) ved at overlejre de to billeddannelsesmodaliteter baseret på DAPI og nukleare konturer (stiplede linjer, højre panel). Ultrastrukturen af de enkelte LC3-mærkede rum, som eksemplificeret ved boks 1 (højre panel), er vist i C. (C) Ultrastruktur af LC3-positive rum. CLEM-billeder vises til venstre og pseudofarvede (beige) EM-billeder til højre (ufarvede EM-billeder vises i supplerende figur S1). Indre og ydre autofagosommembraner er angivet med henholdsvis hvide og sorte pilespidser. Det autofagiske indhold inde i autolysosomet i eksempel 6 er angivet med *. Skalastænger = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur S1: Ufarvede EM-billeder af LC3-positive organeller. (A-F) Ufarvede EM-billeder af pseudofarvede eksempler 1-6 vist i figur 2C. Organellerne blev udvalgt ved LC3-fluorescens, som beskrevet i figur 2. Indre og ydre autofagosommembraner er angivet med henholdsvis hvide og sorte pilespidser. Det autofagiske indhold inde i autolysosomet i eksempel 6 er angivet med *. Skalastænger = 200 nm. Forkortelser: AL = autolysosom; AP = autofagosom; M = mitokondrier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: Buffere og opløsninger, der anvendes i denne undersøgelse. Denne supplerende fil indeholder de opskrifter og protokoller, der er nødvendige for at gøre buffere og løsninger, der anvendes i denne undersøgelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Her præsenterer vi en protokol til optimeret on-section korrelativ lyselektronmikroskopi baseret på endogen, fluorescerende mærkning som et værktøj til at undersøge lokaliseringen af sjældne proteiner i forhold til cellulær ultrastruktur. Kraften i denne tilgang demonstreres ved ultrastrukturel lokalisering af endogene LC3 i udsultede celler uden Bafilomycin-behandling.

Ultrastrukturel lokalisering af endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på sektionen

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Lokalisering af proteiner i forbindelse med cellens ultrastruktur har været et stærkt forskningsværktøj i årtier. Med denne protokol udvidede vi de proteiner, der er lave i overflod eller vanskelige at finde. Vi bruger fluorescensmikroskopi til at mærke proteiner på en følsom og screenbar måde og kombinere det med elektronmikroskopi for at genopfylde cellens ultrastruktur.Her vil vi demonstrere på sektion CLEM om autofagiproteiner, men det kan virkelig anvendes på ethvert biologisk spørgsmål, hvor cellens ultrastruktur er af interesse, især i undersøgelsen af sjældne begivenheder. Tineke Veenendaal, seniorforsker fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren sammen med mig. Til at begynde med skal du udskifte PBS indeholdende 0,15% glycin med 1% gelatine i PBS forvarmet til 37 grader Celsius.Skrab og overfør cellerne i gelatine til et mikrocentrifugerør. Pellet cellerne ved 6.000 G i et minut ved stuetemperatur i en mikrocentrifuge og fjern derefter gelatinen uden at forstyrre pelleten. Tilsæt 12% gelatine opvarmet til 37 grader Celsius til pellet og resuspender forsigtigt ved pipettering med pipettespidser eller glasgræspipetter forvarmet til samme temperatur.Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter og pellet derefter cellerne ved 6.000 G i et minut. Størkn gelatinen på is i 30 minutter. For at fjerne de gelatineindlejrede celler fra røret skal du skære rørenden, der indeholder pelleten, af fra resten af røret med et barberblad.Skær derefter rørenden med cellepillen i halv vinkelret på det første snit. De to rørendehalvdele, der indeholder cellepelleten, anbringes i 2,3 molær saccharose og inkuberes i 10 minutter ved fire grader Celsius. Dette får cellepillehalvdelene til at krympe lidt og løsne sig fra plastrøret.Fjern rørhalvdelene med den gelatineindlejrede cellepille fra saccharose, og fjern derefter cellepillehalvdelene fra plastrørhalvdelene med pincet. Skær pillen manuelt i blokke af en passende størrelse med et barberblad, og brug et stereodissekeringsmikroskop til at forstørre motivet under skæringen. Inkuber celleblokkene natten over i 2,3 molær saccharose ved fire grader Celsius.Placer dem på en aluminiumsprøveholderstift. Efterlad nok saccharose rundt om kanterne af blokken, så den danner en tynd krave mellem blokken og stiften. Snap fryse og opbevar det i flydende nitrogen.Trim forsiden af blokken for at flade overfladen for at opnå omkring 250 nanometer tykke sektioner. Trim derefter siderne af blokken ved at skære 50 til 100 mikrometer ind i siden af prøveblokfladen med knivhjørnet. Trimning af fire sider af prøveblokfladen vil skabe et fremspringende rektangel omkring 250 x 375 mikrometer.Sektion et bånd fra det fremspringende rektangel, der sikrer, at sektionerne er mellem 70 og 90 nanometer tykke og har en sølvfarvet gylden glans. Før sektionerne væk fra diamantknivens kant med et hår på en pind for at skabe et langt bånd. Tag båndet op ved at dyppe den tre millimeter opsamlingssløjfe i en en-til-en-blanding af 2,3 molær saccharose og 2% methylcellulose.Indsæt løkken i mikrotomets kryokammer, og når dråben begynder at fryse, skal du straks samle sektionerne op ved forsigtigt at trykke dråben mod dem. Fjern løkken fra kryokammeret. Vent, indtil dråben er optøet helt, og tryk dråben på et forberedt gitter.Placer gitterene med sektioner på omkring en milliliter PBS i en lille skål eller multibrøndplade og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Behandl gitterene på omkring 75 mikroliter dråber på Parafilm og start med PBS-glycinvask ved stuetemperatur. Der inkuberes ristene med en blokerende buffer fremstillet af 0,1 % bovin serumalbumin C og 0,5 % gelatine af fiskeskind i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur som blokeringstrin.Fortynd primære antistoffer i blokerende buffer i PBS og inkuber gitterene på omkring 10 mikroliter dråber af denne opløsning i en time ved stuetemperatur. Ristene vaskes i 0,1 % bovin serumalbumin i PBS fem gange ved stuetemperatur. Fortynd de sekundære antistoffer og DAPI i blokeringsbufferen i PBS.Derefter inkuberes ristene på ca. 10 mikroliter dråber af denne opløsning i 30 minutter eller længere ved stuetemperatur, før ristene vaskes i PBS fem gange som vist tidligere. For at montere prøverne til lysmikroskopi nedsænkes gitterene i 50% glycerol i destilleret vand to gange i fem minutter ved stuetemperatur. Placer et gitter pr. dæksel mellem et glasglas og en dæksel i 50% glycerol, og sørg for, at sektionerne vender mod dækselsedlen.Til lysmikroskopi skal du tage et glasglas med de sandwichede gitter til et bredt feltmikroskop med et automatiseret trin. Vælg et oliemål med høj forstørrelse, og opret et billedflisesæt af båndet med sektioner. Dernæst tilsættes 10 mikroliter destilleret vand til siden af glasglidedækslets slipsandwich til afmontering og elektronmikroskopi eller EM-kontrast, og vent på, at kapillær handling fylder glasdækslets sandwichgrænseflade.Fjern forsigtigt dækslet uden at blande nedsænkningsolie i glycerolen. Hent ristene med pincet og nedsænk dem i destilleret vand tre gange ved stuetemperatur for at vaske 50% glycerol af. Tør forsigtigt bagsiden af gitteret med et fnugfrit silkepapir, og placer gittersektionssiden nedad på destillerede vanddråber.For at plette sektionerne for kontrast i elektronmikroskopi inkuberes dem med uranylacetat i fem minutter ved stuetemperatur. Opløsningen af uranylacetatmethylcellulose afkøles ved at placere dråberne på Parafilm på en metalplade på is. Vask derefter gitterene med denne iskolde opløsning to gange og inkuber dem i opløsningen i 10 minutter.Loop gitterene ud ved at indsætte en gittertørringssløjfe i uranylacetatmethylcellulosedråben under hvert gitter og løft den forsigtigt, indtil gitteret trækkes af dråben. For at fjerne den overskydende opløsning skal du røre løkken i en vinkel på ca. 60 grader på det fnugfri filterpapir og trække det langsomt langs papiret, indtil der ikke absorberes mere opløsning. Placer løkken med gitteret i et passende stativ, og lad det tørre ved stuetemperatur i mere end 10 minutter.Brug oversigten opnået ved lysmikroskopi til at lokalisere et område af interesse for billeddannelse i transmissionselektronmikroskopet eller TEM, og anmærk ROI på lysmikroskopidatasættet. Når en region er valgt, skal du få en billedflise indstillet til 20.000x til 50.000x forstørrelse i TEM. Rekonstruer billedflisesættet i efterbehandlingssoftware.Udfør korrelationen baseret på DAPI-signal og fluorescens og nukleare konturer i elektronmikroskopi. Skift billederne for at overlejre dem præcist og udfør den manuelle korrelation nøjagtigt. Hepatoblastomafledte HEPG2-celler blev sultet i to timer i EBSS før fiksering med 4% paraldehyd i to timer.IF-billeddannelse af LC3 og LAMP1 på sektioner afslører relativt få LC3-punkter, og lidt colokalisering med LAMP1. Molekylær information fra IF var knyttet til den ultrastrukturelle information opnået i elektronmikroskopi ved at overlejre de to billeddannelsesmetoder baseret på DAPI og nukleare konturer. Korrelationen mellem LC3-positive organeller og EM-ultrastruktur afslørede, at de forskellige punkterede repræsenterede forskellige stadier af autofagi.Ultrastrukturen af de enkelte LC3-mærkede rum som eksemplificeret ved boks et er vist her. De korrelative lyselektronmikroskopibilleder vises til venstre, og de pseudofarvede elektronmikroskopibilleder vises til højre. Indre og ydre autofagosomale membraner er angivet med hvide og sorte pilespidser.Interessant nok identificerede EM relativt svage fluorescerende pletter som LC3-positive autolysosomer, som er kendetegnet ved tæt indhold og intraluminale vesikler. Dette afslører minimal LC3-synlighed i IF af ultratynde kryosektioner, hvilket tyder på detekterbar LC3 i steady state-autolysosomer på trods af det nedbrydende miljø. LC3-positiv punktering repræsenterer dog hovedsageligt autofagosomer, hvor få repræsenterer autolysosomer.For forskere, der ønsker at lave immunguldmærkning i stedet for CLEM, er protokollerne og tipene beskrevet her også fuldt anvendelige til immunguldmærkning. Vi anvendte oprindeligt CLEM på sektion til endosomale regulatoriske proteiner med lav overflod og viste for første gang deres endogene ultrastrukturelle lokalisering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor Imaging af biologiske strukturer med Fluorescence Fotoaktivering Lokalisering Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Korrelative Confocal og 3D Electron Microscopy af et specifikt Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tre-dimensionel Super Resolution Mikroskopi af F-actinfilamenter af Interferometrisk fotoaktiverede Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Nedfrysning: Et værktøj for Ultrastrukturelle og immunlokalisering Studier af Suspension Celler i Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Vurdering af autofagisk fluks ved at måle LC3-, p62- og LAMP1-co-lokalisering ved anvendelse af multispektral billedflowcytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Hurtig frysning ved hjælp af Sandwich Frysning Device for god ultrastrukturel bevarelse af biologiske prøver i ElektronMikroskopi

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisering af subcellulær lokalisering af et protein i hjertet ved hjælp af kvanteprikker-medieret immunmærkning efterfulgt af transmissionselektronmikroskopi