Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

We danken onze collega's van het Centrum voor Moleculaire Geneeskunde van het Universitair Medisch Centrum Utrecht voor vruchtbare discussies en feedback. We danken de vroegere en huidige collega's van het Klumperman-lab voor het voortdurend verbeteren van onze microscopietechnologieën. De EM-infrastructuur die hiervoor wordt gebruikt, maakt deel uit van het onderzoeksprogramma National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI), gefinancierd door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), projectnummer 184.034.014 aan JK.

1. Voorbereiding van gereedschappen en reagentia
OPMERKING: Voor vereiste reagentia, buffers en oplossingen, zie Aanvullend bestand 1 of 12 voor meer informatie. Voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt, raadpleegt u de Tabel met materialen.
<ol><li>Fixeermiddelen<ol><li>Bereid 0,2 M fosfaatbuffer (PB) of 0,2 M PIJPEN, HEPES, EGTA, MgSO4 (PHEM) buffer voor, zoals beschreven in aanvullend bestand 1, om te gebruiken als basis voor fixerende oplossingen. OPMERKING: Fixeermiddelen worden routinematig gebufferd in 0,1 M PB of PHEM-buffer om te bufferen tegen verzuring veroorzaakt door de aldehydereactie met het biologische materiaal.</li>
		<li>Aangezien de kwaliteit van de paraformaldehyde (PFA) de sleutel is tot een betrouwbare fixatie van de ultrastructuur van de monsters, moet PFA van EM-kwaliteit worden gebruikt. Om dit protocol te volgen, gebruikt u 16% voorraadoplossingen, bereid uit hoogwaardige PFA-prils (zie aanvullend bestand 1). LET OP: Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof (gevarenaanduidingen H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Draag bij het werken met PFA beschermende uitrusting (handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril) en werk in een chemische kap. Afval dat PFA bevat, moet worden ingezameld en afgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de instituten.</li>
		<li>Combineer 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (in gedemineraliseerd water [dH 2 O]) en 5 ml dH2O om een fixerende oplossing van 4% PFA tebereiden.</li>
		<li>Optioneel: Het toevoegen van 0,02%-0,5% glutaaraldehyde (GA) aan de fixeeroplossing uit stap 1.1.3 verbetert het behoud van de ultrastructuur, maar vermindert de antigeniciteit van het monster tegen veel antilichamen. OPMERKING: Wanneer GA-fixatie gewenst is, gebruik dan GA van EM-kwaliteit van een geschikte leverancier. LET OP: Glutaaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof (gevarenaanduidingen H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Werk in een chemische kap en draag beschermende uitrusting (handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril) bij het manipuleren van GA. Afval dat GA bevat, moet worden verzameld en verwijderd volgens de richtlijnen en voorschriften van de instituten.</li>
	</ol></li>
	<li>Gereedschappen en materialen<ol><li>Kras op het oppervlak van aluminium monsterhouderpennen en sonificeer ze 3 x 10 minuten in ethanol om metaalresten te verwijderen en een optimale hechting te garanderen wanneer in gelatine ingebedde celblokken op de pinnen zijn gemonteerd.</li>
		<li>Gebruik een voorraadbus die geschikt is om de aluminium monsterhouderpennen met hun monsters in vloeibare stikstof (LN2) op te bergen.</li>
		<li>Maak een manipulator door een enkele haar of wimper met nagellak aan het uiteinde van een houten spies te bevestigen.</li>
		<li>Maak een ophaallus. Buig een 0,3 mm dikke roestvrijstalen draad rond een ronde staaf met een diameter van 3 mm en draai de uiteinden in elkaar, zodat er aan één uiteinde een lus ontstaat. Steek de gedraaide uiteinden in de punt van een pipet. Steek een houten spies aan het andere uiteinde en bevestig met lijm of hars. OPMERKING: Een pick-uplus is ook in de handel verkrijgbaar (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Om de roosterdrooglussen voor te bereiden, volgt u dezelfde stappen voor het maken van opnamelussen: vorm een roestvrijstalen draad in een lus van 4 mm en bevestig deze met lijm of hars op een grote pipetpunt.</li>
		<li>Smeer de roosters in met een dunne ondersteunende film zoals formvar (protocol in aanvullend bestand 1). Smeer de roosters voor gebruik in met een dun laagje koolstof. OPMERKING: Kant-en-klare roosters zijn in de handel verkrijgbaar (zie Materiaaltabel). Formvar-gecoate roosters kunnen onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur (RT); Met koolstof beklede roosters kunnen bij RT enkele maanden worden opgeslagen.</li>
		<li>Bereid schone glasplaatjes en grote dekglaasjes voor (24 mm x 24 mm is ideaal bij glasplaatjes van 25 mm breed), zoals in 13.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixatie en monstervoorbereiding
<ol><li>Fixatie<ol><li>Gebruik het fixeermiddel dat in stap 1.1.3 is bereid (4% PFA in 0,1 M PB). Kweek voor hechtende cellijnen 1-5 × 10 6 cellen in schaaltjes van6 cm. Voeg het fixeermiddel toe aan het kweekmedium in een verhouding van 1:1 en incubeer het monster gedurende 5 minuten bij RT. Vervang vervolgens het medium-fixeermengsel door alleen fixeermiddel en incubeer gedurende 2 uur bij RT. OPMERKING: Het exacte celgetal, de samenvloeiing en de kweekomstandigheden kunnen variëren, afhankelijk van het gebruikte modelsysteem.</li>
		<li>Bewaar de monsters 's nachts of maximaal 3-4 weken in 0,5% PFA in 0,1 M PB bij 4 °C. OPMERKING: GA kan worden toegevoegd aan de fixatie (zie stap 1.1.4) en de fixatielengte kan worden gewijzigd om een optimale balans te vinden tussen het behoud van morfologie en antigeniciteit, die per monster en etikettering verschilt. Zie14 voor meer informatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbeeld van insluiten<ol><li>Was de schaal met vaste cellen 3x met PBS op RT. Vervang vervolgens door PBS met 0,15% glycine en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.</li>
		<li>Vervang de PBS met 0,15% glycine door 1% gelatine in PBS voorverwarmd tot 37 °C, schraap en breng de cellen in 1% gelatine over in een microcentrifugebuisje. Pelleteer de cellen bij 6.000 × g gedurende 1 minuut bij RT in een microcentrifuge. Verwijder vervolgens de 1% gelatine zonder de pellet te verstoren en voeg 12% gelatine toe die is opgewarmd tot 37 °C. Resuspendeer de celpellet door voorzichtig op en neer te pipetteren met pipetpunten of glazen pasteurpipetten die zijn voorverwarmd tot 37 °C.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min; Pelleteer de cellen vervolgens gedurende 1 minuut op 6.000 × g . Laat de gelatine 30 minuten stollen op ijs.</li>
		<li>Om de in gelatine ingebedde cellen uit de buis te verwijderen, snijdt u het buisuiteinde met de pellet met een scheermesje af van de rest van de buis. Snijd vervolgens, loodrecht op de eerste snede, het buisuiteinde met de celpellet doormidden.</li>
		<li>Incubeer de twee buiseindhelften met de in gelatine ingebedde celpellet in 2,3 M sacharose gedurende 10 minuten bij 4 °C. Dit zorgt ervoor dat de in gelatine ingebedde celpellethelften iets krimpen en loskomen van de plastic buis. OPMERKING: De in gelatine ingebedde celpellets moeten zoveel mogelijk op 4 °C of ijskoud worden bewaard om te voorkomen dat de 2,3 M sucrose te stroperig en de gelatine te zacht wordt. Werk tijdens het manipuleren van de in gelatine ingebedde celpellets in de volgende stappen met slechts één monster tegelijk en bewaar de andere op ijs, of werk in een koude (~4 °C) ruimte. Vermijd oververhitting van de in gelatine ingebedde celpellets door zonlicht, hete microscooplampen of andere warmtebronnen.</li>
		<li>Verwijder de buishelften met de in gelatine ingebedde celpellet van de 2,3 M sucrose. Verwijder vervolgens met een pincet de in gelatine ingebedde celpellethelften van de plastic buishelften. Snijd de pellet handmatig in blokken van de juiste grootte (~1mm3) met een scheermesje. Gebruik een stereo-ontleedmicroscoop om het onderwerp tijdens het snijden te vergroten.</li>
		<li>Laat de in gelatine ingebedde celblokken gedurende 3-16 uur trekken met 2,3 M sacharose en draai ze end-over-end in een rotor bij 4 °C.</li>
		<li>Plaats een in gelatine ingebedde celblok op een aluminium monsterhouderpen (zie stap 1.2.1). Laat voldoende 2,3 M sacharose over langs de randen van het blok zodat het een dunne 'kraag' vormt tussen het blok en de speld. Vermijd te veel 2,3 M sucrose die de bovenkant van het blok bedekt. Vries snel in en bewaar in LN2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Secties
<ol><li>Trimmen (zieook 12)<ol><li>Neem een speld met een blok in gelatine ingebedde cellen uit de LN2-opslag en plaats deze in een cryomicrotoom dat is ingesteld op -80 °C.</li>
		<li>Snijd de voorkant van het blok af om het oppervlak af te vlakken en secties van ~250 nm te verkrijgen. Dompel de lus van 3 mm in de opnameoplossing (1:1 2,3 M sucrose en 2% methylcellulose), steek de lus in de cryokamer van de microtoom en wacht tot er zich ijs begint te vormen in de druppel (meestal 5-7 s). Pak vervolgens onmiddellijk de sectie op door de druppel er snel maar voorzichtig tegenaan te drukken. Haal de lus uit de cryokamer, wacht tot de druppel volledig is ontdooid en druk de druppel op een glasplaatje.</li>
		<li>Controleer de celoriëntatie door toluïdineblauwe kleuring van de secties.<ol><li>Breng een druppel toluïdineblauwoplossing (zie aanvullend bestand 1) op de secties op een glasplaatje en droog op een verwarmingsplaat van 80 °C tot de randen van de druppel droog zijn.</li>
			<li>Verwijder het glasplaatje van de verwarmingsplaat en spoel het toluïdineblauw voorzichtig weg met dH2O en vang het op in een geschikte afvalcontainer.</li>
			<li>Droog het objectglaasje en controleer de celoriëntatie in de secties met een eenvoudige lichtmicroscoop.</li>
		</ol></li>
		<li>Snijd de zijkanten van het blok af door met de meshoek 50-100 μm in de zijkant van het monsterblok te snijden. Snijd vier zijden van het oppervlak van het monsterblok bij door de monsterhouder 90° te draaien na het bijsnijden van elke kant om een uitstekende rechthoek van ~250 μm x 375 μm te creëren. Selecteer het uitstekende gebied op basis van de celoriëntatie die in de vorige stap is bepaald.</li>
	</ol></li>
	<li>Secties en pick-up<ol><li>Koel de cryomicrotoom af tot -100 °C. Doorsnede een lint van de uitstekende rechthoek, de secties zijn 70-90 nm dik en met een zilvergouden glans. Leid de secties weg van de rand van het diamantmes met een haar op een stok (zie paragraaf 1.2.3) om een lang (2-5 mm) lint te maken.</li>
		<li>Zodra een geschikt lint is gevormd, stopt u met het opdelen van secties om het lint op te pakken. Doop de 3 mm pick-uplus in 2,3 M sucrose en 2% methylcellulose 1:1 gemengd, steek de lus in de cryokamer van de microtoom en wacht tot de druppel begint te bevriezen (meestal 5-7 s). Pak vervolgens onmiddellijk de secties op door de druppel er snel maar voorzichtig tegenaan te drukken. Haal de lus uit de cryokamer, wacht tot de druppel volledig is ontdooid en druk de druppel op een voorbereid rooster (stap 1.2.6). OPMERKING: Roosters met secties kunnen enkele maanden bij 4 °C worden opgeslagen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Etikettering en lichtmicroscopie
<ol><li>Labeling<ol><li>Leg de roosters met secties (Figuur 1A) met de sectiekant naar beneden op ~1 ml PBS in een schaaltje of bord met meerdere putjes. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. OPMERKING: Deze stap verwijdert de gelatine die zich tussen de cellen bevindt; Gelatine is niet nodig na het in secties snijden en verstoort het resterende protocol.</li>
		<li>Verwerk de roosters met de snijkant naar beneden op druppels van ~75 μL op parafilm (zie figuur 1B). Begin met PBS + 0,15% glycine wasbeurten (3 x 2 min) bij RT. Incubeer vervolgens de roosters met 0,1% runderserumalbumine (BSA)-c + 0,5% vishuidgelatine (FSG) in PBS gedurende 10 minuten bij RT als blokkeerstap. Verdun primaire antilichamen in 0,1% BSA-c + 0,5% FSG in PBS en incubeer de roosters op ~10 μL druppeltjes van deze oplossing gedurende 1 uur bij RT (Figuur 1C).</li>
		<li>Was de roosters in 0,1% BSA in PBS 5x op RT. Verdun vervolgens secundaire antilichamen en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; 10 μg/ml) in 0,1% BSA-c + 0,5% FSG in PBS en incubeer de roosters op ~10 μL druppeltjes van deze oplossing gedurende 30+ minuten bij RT (Figuur 1C). Was de roosters in PBS 5x op RT. OPMERKING: Optioneel kan een secundair antilichaam worden gelabeld met colloïdale gouddeeltjes van 5, 10, 15 of 20 nm geconjugeerd aan proteïne A (PAG) voor lokalisatie van het eiwit van belang in EM. Indien dit gewenst is, incubeer de roosters met PAG gedurende 20 minuten bij RT na stap 4.1.3. Was vervolgens 5x met PBS bij RT. Vermijd het gelijktijdige gebruik van meerdere primaire antilichamen en let op de reactiviteit van PAG op de IgG's van verschillende soorten om ongewenste kruisreacties te voorkomen. Zie12 voor meer informatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagemonsters voor lichtmicroscopie<ol><li>Dompel de roosters onder in 50% glycerol in dH 2 Ø2x 5 min bij RT. Klem de roosters tussen een glasglaasje en dekglaasje in 50% glycerol, één rooster per dekglaasje, met secties die naar het dekglaasje zijn gericht (Figuur 1D). OPMERKING: De kwaliteit van de etikettering kan verslechteren wanneer roosters langer dan 30 minuten in 50% glycerol worden gemonteerd. Het wordt daarom aanbevolen om twee of drie rasters tegelijk te monteren en af te beelden en de andere op de secundaire etiketteringsoplossing te laten.</li>
	</ol></li>
	<li>Lichtmicroscopie<ol><li>Breng een glasplaatje met ingeklemde roosters naar een breedveldmicroscoop met een geautomatiseerde tafel. Selecteer een sterk vergrote (63x of 100x) olie-objectief. Maak een afbeeldingstegelset van (een deel van) het lint van secties (Figuur 1E). OPMERKING: Sommige secundaire antilichamen kunnen fluorescerende aggregaten vormen op roosters, vooral rond plooien of scheuren in de secties. Bovendien bevatten sommige celtypen en weefsels autofluorescerende structuren. Als dergelijke problemen worden verwacht, wordt geadviseerd om een negatief controlerooster op te nemen dat niet is geïncubeerd met primair antilichaam.</li>
	</ol></li>
	<li>Demontage en EM contrasterend<ol><li>Voeg 10 μL dH2O toe aan de zijkant van de sandwich met glasglaasje en dekglaasje en wacht tot de capillaire werking de interface van de sandwich tussen glas en dekglaasje vult. Verwijder voorzichtig het dekglaasje zonder immersieolie in de glycerol te mengen. Pak de roosters op met een pincet en dompel ze 3x onder in dH2O bij RT om de 50% glycerol af te wassen. OPMERKING: Olie kan de uranylkleuring verstoren en het EM-contrast verslechteren.</li>
		<li>Droog de achterkant van het rooster voorzichtig af met pluisvrij vloeipapier. OPMERKING: Als het monster ook is gelabeld met colloïdale gouddeeltjes, voer dan de volgende stappen uit: plaats het rooster met secties met de sectiezijde naar beneden op PBS-druppels en was 2x op RT. Postfix in 1% GA gedurende 5 minuten bij RT (zie voorzichtigheidsopmerking onder 1.1.4). Wassen in PBS 2x op RT.</li>
		<li>Leg de roosters met de snijkant naar beneden op dH2O druppels en was 8x op RT.</li>
		<li>Om de secties te kleuren voor contrast in EM, incubeer met uranylacetaat (UA), pH 7, gedurende 5 minuten bij RT (Figuur 1F).</li>
		<li>Koel voor het plaatsen van de roosters de UA:methylcellulose, pH 4, af door druppeltjes op parafilm op een metalen plaat op ijs te leggen. Was de roosters vervolgens met ijskoude UA:methylcellulose, pH 4, 2x en incubeer met ijskoude UA:methylcellulose, pH 4, gedurende 10 minuten (Figuur 1F). LET OP: Uranylacetaat is een gevaarlijke chemische stof (gevarenaanduidingen H300, H330, H373, H411). Werk in stappen die UA vereisen in een chemische kap en draag beschermende uitrusting (laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril). Verzamel en voer afval met UA af volgens de richtlijnen en voorschriften van de instituten.</li>
		<li>Maak een lus van de roosters door een roosterdrooglus in de UA:methylcellulosedruppel onder het rooster te steken en deze voorzichtig op te tillen totdat het rooster van de druppel12 wordt getrokken. Dep de overtollige UA:methylcellulose weg door de lus in een hoek van ~60° (secties naar beneden) op pluisvrij filtreerpapier te leggen (zie Materiaaltabel) en deze langzaam langs het papier te slepen totdat er geen UA:methylcellulose meer wordt geabsorbeerd. Plaats vervolgens de lus met het rooster in een geschikt rek en laat >10 min drogen bij RT (Figuur 1G).</li>
	</ol></li>
</ol>5. EM
<ol><li>Gebruik het overzicht verkregen door lichtmicroscopie om een interessegebied (ROI) te lokaliseren voor beeldvorming in de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM; Figuur 1H). Annoteer de ROI op de dataset van de lichtmicroscopie. Zodra een gebied is geselecteerd, verkrijgt u een afbeeldingstegelset met een vergroting van 20.000x-50.000x in de TEM. Reconstrueer de afbeeldingstegelset in nabewerkingssoftware15,16.</li>
</ol>6. Correlatie en analyse
<ol><li>Laad de lichtmicroscopie- en EM-dataset in geschikte beeldverwerkingssoftware, zoals ImageJ/Fiji17, de ec-CLEM plug-in in Icy18 of Photoshop. Snijd de dataset van de lichtmicroscopie bij en roteer deze zodat deze overeenkomt met de EM-tegelset.<ol><li>Voer de correlatie uit op basis van het DAPI-signaal in fluorescentie en nucleaire contouren in EM (Figuur 1I). Verschuif de afbeeldingen om ze precies over elkaar heen te leggen en voer de handmatige correlatie nauwkeurig uit. Om de aanpak nauwkeuriger te maken, past u op oriëntatiepunten gebaseerde correlatie toe via bijvoorbeeld de ec-CLEM-plug-in in Icy of de BigWarp-plug-in in ImageJ, om de afbeeldingen te correleren door handmatige selectie van overeenkomstige punten. Er is een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor correlatie met ec-CLEM beschikbaar19. OPMERKING: Deze aanpak werkt ook goed met het gebruik van bimodale fiduciale sondes20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de gecorreleerde beelden door ROI's te selecteren op basis van fluorescerend signaal in een geschikt programma (bijv. ImageJ). Maak voor kwantitatieve analyse een verzameling ROI's voor alle gelabelde organellen. Inspecteer vervolgens de overeenkomstige ultrastructuur van de individuele ROI's en classificeer ze op basis van morfologische elementen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van recente ontwikkelingen op het gebied van cryosectie-gebaseerde CLEM op basis van doorsnede - de hoge gevoeligheid van IF-etikettering en nauwkeurige (<100 nm fout) correlatie tussen FM en EM14,24. Dit resulteert in een methode met de gevoeligheid voor het fluorescerend labelen van schaarse, endogene eiwitten en de mogelijkheid om deze met hoge precisie over de EM-ultrastructuur heen te leggen. Deze methode vermijdt dus de noodzaak van (over)expressie van exogeen gelabelde eiwitten en het gebruik van minder gevoelige EM-labels. De haalbaarheid van de methode wordt aangetoond door voorbeelden van CLEM op endogene LC3 in uitgehongerde cellen, zonder het gebruik van lysosomale remmers.
Ontdooide cryosecties verkregen met de Tokuyasu-methode zijn ideale monsters voor immuno-EM, omdat ze, in tegenstelling tot harssecties, doorlaatbaar zijn voor antilichamen. In combinatie met milde fixatie en contrasterende procedures, levert dit over het algemeen een uitstekende etiketteringsefficiëntie op ten opzichte van andere methoden zonder afbreuk te doen aan de gedetailleerde ultrastructuur, en visualiseert het de celmembranen uitstekend 12,25,26. Bovendien zijn cryosecties zeer compatibel met fluorescentiemicroscopie, waardoor ze waardevolle substraten zijn voor CLEM. Zowel klassieke immunogold-etikettering als CLEM op cryosecties hebben baanbrekende inzichten opgeleverd in het begrijpen van subcellulaire organisatie 14,27,28,29,30.
Momenteel komen toepassingen van CLEM op ontdooide cryosecties steeds vaker voor, als gevolg van voortdurende ontwikkelingen en optimalisaties 14,20,24,31,32,33,34 die de kwaliteit, toepasbaarheid en nauwkeurigheid van de aanpak hebben verbeterd. Nu, door nauwkeurige correlatie van grote IF- en EM-beeldtegelsets, vergemakkelijkt de techniek het screenen van de ultrastructuur van fluorescerend gelabelde endogene cellulaire componenten 14,32,33. Dit is een voordeel ten opzichte van klassieke immuno-EM, waarbij het zoeken naar goudgelabelde structuren doorgaans een hoge vergroting vereist en daarom arbeidsintensiever en tijdrovender is. Het is om deze reden dat de lokalisatie van LC3 naar de ultrastructuur veel baat heeft bij CLEM. LC3-positieve organellen komen vaak voor wanneer autofagische klaring wordt geblokkeerd (d.w.z. wanneer cellen worden behandeld met BafA1 of pH-verhogende middelen), terwijl autofagische organellen snel worden geklaard in ongewijzigde of uitgehongerde cellen, wat resulteert in zeer lage steady-state niveaus. In dergelijke omstandigheden kan het vinden van LC3-gelabelde organellen met behulp van klassieke immuno-EM een uitdaging zijn, en CLEM biedt een duidelijk voordeel.
Voorheen werd CLEM op harssecties toegepast in onderzoeken met ectopische expressie van LC3-GFP of een LC3-GFP-RFP-tandemsonde 35,36,37,38,39. In deze onderzoeken werd fluorescentiebeeldvorming uitgevoerd voorafgaand aan het inbedden of direct in acrylharssecties40, en monsters werden vervolgens gescreend door EM. Er zijn verschillende voordelen van het inbedden van hars; De autofagosomale ultrastructuur is over het algemeen goed bewaard gebleven, vooral als het materiaal onder hoge druk is ingevroren40. Bovendien is het contrast van met hars ingebed materiaal met zware metalen over het algemeen meer uitgesproken dan dat van met uranyl gekleurde cryosecties. In hars ingebedde secties zijn compatibel met volumetrische EM-methoden, zoals array-tomografie, FIB-SEM of seriële blockface SEM, terwijl cryosecties dat niet zijn. Bij benaderingen die beeldvorming uitvoeren voordat ze worden ingebed, is beeldvorming van levende cellen een optie41 die niet beschikbaar is in CLEM op cryosecties. Het belangrijkste voordeel van CLEM op cryosecties ten opzichte van deze alternatieven is het hoge IF-signaal, waardoor immunolokalisatie van zeldzame eiwitten mogelijk is zonder de noodzaak van membraanpermeabilisatie of overexpressie. Dit vermijdt mogelijke membraanextractie, overexpressie-artefacten42 en genetische modificatie van het onderwerp, wat, in combinatie met de mogelijkheid om grote gebieden in IF en EM te correleren, het een uitstekend hulpmiddel maakt om LC3 en autofagie te bestuderen.
Hier onthulde de toepassing van CLEM op uitgehongerde HEPG2-cellen dat LC3 voornamelijk gelokaliseerd was in structuren die werden geïdentificeerd als autofagosomen. Bovendien werden enkele zwak fluorescerende vlekken gevonden in autolysosomen. Dit staat in schril contrast met cellen die worden behandeld met BafA19 en weerspiegelt de snelle afbraak van autofagosomale eiwitten zodra het autofagosoom samensmelt met lysosomen. Over het algemeen toonden de gegevens aan dat CLEM van ontdooide cryosecties inzicht kan geven in LC3-gemedieerde autofagie in inheemse omstandigheden. De gegevens benadrukken ook de gevoeligheid van de technologie, aangezien LC3 zelfs werd gedetecteerd in autolysosomen die slechts lage niveaus van intacte LC3-epitopen bevatten. Verdere toepassing van deze techniek door LC3 in verschillende modellen en omstandigheden in beeld te brengen, zal ons begrip van autofagie en andere LC3-gemedieerde biologische processen, zoals LC3-geassocieerde fagocytose of conjugatie van ATG8 naar enkele membranen, verbeteren.
Naast autofagie kan CLEM op sectie worden toegepast op andere zeldzame gebeurtenissen of structuren, zoals celdeling, infectie, zeldzame celtypen in weefsels, kinetochoren, primaire cilia of celtypespecifieke organellen. Effectieve screening van het onderwerp van belang door IF kan de ultrastructurele studie van deze zeldzaamheden aanzienlijk vergemakkelijken. Verder werd aangetoond14 dat de techniek kan worden gebruikt om eiwitten op een gevoeligere manier te lokaliseren dan klassieke immuno-EM. Door de fixatielengte aan te passen, kan deze gevoeligheid verder worden uitgebreid, waardoor de ultrastructurele lokalisatie van zeer laag-overvloedige of slecht antigene eiwitten mogelijk wordt. Ten slotte vergemakkelijkt de CLEM-methode op sectie de snelle selectie van een kwantitatief aantal organellen, waardoor een robuustere analyse van de ultrastructurele verdeling van een bepaald eiwit mogelijk wordt.
CLEM op cryosecties vereist de apparatuur en expertise voor cryosectie. In groepen met toegang tot deze tools (bijv. cryomicrotomen) is de implementatie van CLEM op sectie eenvoudig en vereist alleen de beschikbaarheid van een geautomatiseerde breedveldmicroscoop, een opstelling waar de meeste laboratoria toegang toe hebben. Bovendien is de methode beschikbaar in EM-faciliteiten over de hele wereld. Aangezien CLEM op doorsnede de toepassing van gevestigde IF- en EM-methoden combineert, is de methode gemakkelijk aan te passen en kan deze worden gecombineerd met bijvoorbeeld tomografie 20,33,43, serieel sectievolume EM van een beperkt aantal secties 44, of superresolutiemicroscopie 45. Deze veelzijdigheid van de methode ondersteunt toepassingen voor een breed scala aan biologische vragen.

Autofagie is een belangrijk proces voor de klaring en recycling van cytoplasmatische eiwitten en organellen. Het proces van macro-autofagie (hierna autofagie genoemd) omvat de vorming van dubbelmembraanorganellen, autofagosomen, waardoor cellen cytoplasmatische moleculen en organellen kunnen omsluiten voor lysosomale afbraak. Autofagie komt in de meeste cellen op basaal niveau voor en wordt opgereguleerd als reactie op cellulaire omstandigheden, zoals uithongering of cellulaire stress. Autofagie vindt ofwel plaats op een substraatspecifieke manier, gericht op specifieke structuren of eiwitten voor afbraak, of als een niet-selectief bulkproces dat delen van het cytosol omvat. Bij selectieve autofagie worden autofagosomen gevormd door de conjugatie van eiwitten uit de Atg8-familie (microtubuli-geassocieerde eiwitten 1A/B lichte keten 3A/B/C [LC3] en GABARAP's) tot membranen die zijn afgeleid van recycling-endosomen, de Golgi en/of endoplasmatisch reticulum (ER)1. LC3 herkent autofagische lading in het cytosol rechtstreeks of via selectieve autofagie-adapters zoals P62/SQSTM. Nieuwe autofagische membranen kunnen vervolgens worden geconjugeerd tot LC3, uitzetten en fuseren om een voltooid dubbel membraan te vormen dat de lading omsluit, het autofagosoom genaamd. Het autofagosoom rijpt en versmelt uiteindelijk met een endosoom of lysosoom, waarna de autofagische lading en adapters worden afgebroken2.
Studies naar autofagosoomvorming, rijping en fusie maken vaak gebruik van lichtmicroscopietechnologieën. Fluorescentiemicroscopie van LC3 wordt over het algemeen gebruikt om het aantal en de cellulaire lokalisatie van autofagosomen onder verschillende omstandigheden te beoordelen. Bovendien kan door LC3 te koppelen aan pH-gevoelige GFP en pH-stabiele RFP in een zogenaamde tandemsonde, de totale flux van autofagie in levende cellen worden gemeten als functie van GFP-fluorescentieverlies3. Deze benaderingen zijn waardevolle hulpmiddelen voor onderzoekers om de rol en het mechanisme van autofagie onder verschillende omstandigheden te begrijpen. Een ander hulpmiddel van onschatbare waarde is elektronenmicroscopie (EM), die de ultrastructuur van autofagische organellen in verschillende stadia van autofagie 4,5,6,7,8 onthult. Tot op heden is EM nog steeds de voorkeursmethode om de precieze stadia van autofagosoomvorming te identificeren door verschillende autofagische membranen te onderscheiden op morfologie: fagofoor (dubbel membraan niet volledig gesloten), autofagosoom (gesloten dubbel membraan rond cytosolische lading) en autolysosoom ([gedeeltelijk] verlies van het binnenste autofagische membraan). Morfologie zonder moleculaire informatie kan echter vatbaar zijn voor verkeerde identificatie of dubbelzinnigheid. Immuno-EM is de meest uitgebreide methode voor gelijktijdige moleculaire karakterisering en morfologische classificatie van autofagische organellen. Immunogold-etikettering van LC3 op ontdooidecryosecties maakt bijvoorbeeld de ultrastructurele lokalisatie van LC3 en nauwkeurige identificatie van LC3-gemarkeerde organellen 9 mogelijk.
Een nadeel van EM is het kleine gezichtsveld dat gepaard gaat met de hoge vergroting die nodig is om de fijne ultrastructuur van autofagische membranen te observeren en, in het geval van immuno-EM, om het label te lokaliseren dat het eiwit van belang markeert. Vanwege hun schaarste en lage eiwitgehaltes belemmert dit over het algemeen de kwantitatieve EM-analyse van autofagosomen. Om het aantal autofagosomen te verhogen, worden cellen vaak uitgehongerd en behandeld met Bafilomycine A1 (BafA1), een remmer van lysosomale verzuring en afbraak. Zonder BafA1-behandeling is de zoektocht naar autofagosomen door EM tijdsintensief, vanwege de schaarste aan deze organellen. De methode die in dit manuscript wordt gepresenteerd, pakt dit probleem aan door middel van fluorescerende etikettering en beeldvorming van endogene LC3 op ontdooide cryosecties in een fluorescentiemicroscoop voordat verdere voorbereiding op EM wordt uitgevoerd. De fluorescerende beelden begeleiden vervolgens de zoektocht naar LC3-gelabelde structuren in de EM. Na het verzamelen worden EM-beelden gecorreleerd met de fluorescentiebeelden om moleculaire informatie - de aanwezigheid van LC3 - toe te voegen aan de ultrastructuur van de cel. Deze 'on-section CLEM'-methode vergroot het vermogen om LC3-gelabelde structuren te vinden, vooral in onbehandelde omstandigheden, aanzienlijk voor latere identificatie en classificatie door EM.
Deze methode werd toegepast op uitgehongerde hepatoblastoom-afgeleide HEPG210-cellen om autofagosomen te vinden in ongewijzigde (d.w.z. er werd geen BafA1 gebruikt) omstandigheden. Er werden relatief weinig fluorescerende puncta (minder dan één per celprofiel in een 90 nm-sectie) gevonden, wat in overeenstemming is met de hoge omzet van LC311. Deze schaarste aan LC3-puncta benadrukte de waarde van CLEM; door regio's met verschillende fluorescerende puncta te selecteren voor beeldvorming in de EM, werden LC3-positieve organellen gevonden en gekarakteriseerd op een veel effectievere manier dan via conventionele immuno-EM. Hieruit bleek dat de meerderheid van de LC3-positieve organellen autofagosomen waren, zoals gedefinieerd door hun morfologie, wat in tegenstelling staat tot de resultaten verkregen in met BafA1 behandelde cellen, waar autolysosomen vakervoorkomen9. Deze gegevens tonen aan dat met CLEM op sectie autofagie op ultrastructureel niveau kan worden bestudeerd zonder de noodzaak om de autofagische stroming te remmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

De visualisatie van autofagische organellen op ultrastructureel niveau door middel van elektronenmicroscopie (EM) is essentieel om hun identiteit vast te stellen en details te onthullen die belangrijk zijn voor het begrijpen van het autofagische proces. EM-methoden missen echter vaak moleculaire informatie, waardoor de correlatie van ultrastructurele informatie verkregen door EM met op fluorescentiemicroscopie gebaseerde lokalisatie van specifieke autofagie-eiwitten wordt belemmerd. Bovendien belemmert de zeldzaamheid van autofagosomen in ongewijzigde cellulaire omstandigheden het onderzoek door EM, dat een hoge vergroting vereist, en dus een beperkt gezichtsveld biedt.
Als antwoord op beide uitdagingen werd een on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie (CLEM)-methode op basis van fluorescerende labeling toegepast om een gemeenschappelijke autofagosomale marker, LC3, te correleren met EM-ultrastructuur. De methode werd gebruikt om cellen in fluorescentiemicroscopie snel te screenen op LC3-labeling in combinatie met andere relevante markers. Vervolgens werden de onderliggende ultrastructurele kenmerken van geselecteerde LC3-gelabelde spots geïdentificeerd door CLEM. De methode werd toegepast op uitgehongerde cellen zonder toevoeging van remmers van lysosomale verzuring.
In deze omstandigheden werd LC3 voornamelijk aangetroffen op autofagosomen en zelden op autolysosomen, waarin LC3 snel wordt afgebroken. Deze gegevens tonen zowel de haalbaarheid als de gevoeligheid van deze aanpak aan, wat aantoont dat CLEM kan worden gebruikt om ultrastructurele inzichten te verschaffen over LC3-gemedieerde autofagie in inheemse omstandigheden - zonder medicamenteuze behandelingen of genetische veranderingen. Over het algemeen biedt deze methode een waardevol hulpmiddel voor ultrastructurele lokalisatiestudies van autofagie-eiwitten en andere schaarse antigenen door lichtmicroscopie te overbruggen naar EM-gegevens.

Een geoptimaliseerd immuno-EM-protocol voor immuno-goudlabeling van LC3 op ultradunne cryosecties werd onlangs gepubliceerd door De Maziere et al.9. Deze studie omvatte uitgehongerde omstandigheden zonder BafA1, waarin LC3 aanwezig was, maar relatief zeldzaam en moeilijk te vinden door EM. Een CLEM-methode op sectie werd geïntroduceerd in een afzonderlijke studie, die de gevoeligheid van fluorescentie-etikettering gebruikt om relatief zeldzame en laag tot expressie gebrachte endogene eiwitten te visualiseren en dit te correleren met EM-ultrastructuur14. Hier worden deze twee benaderingen gecombineerd door het gebruik van het geoptimaliseerde LC3-etiketteringsprotocol als onderdeel van een CLEM-benadering.
HEPG2-cellen, van de lever afgeleide cellen met relatief hoge niveaus van basale autofagie22, werden gedurende 2 uur uitgehongerd in minimaal medium (Earle's gebalanceerde zoutoplossing [EBSS]) voorafgaand aan fixatie in 4% PFA. Dit werd gevolgd door monstervoorbereiding door middel van de Tokuyasu-methode van ultradunne cryosecties (secties 1-3; zie Slot en Geuze12), die zeer compatibel is met CLEM 14,23 op sectie. Ontdooide cryosecties werden fluorescerend gelabeld (protocolsectie 4 en figuur 1) met behulp van anti-LC3 primair antilichaam9 van muizen. Bovendien werd konijn anti-LAMP1 gebruikt om endo-lysosomen aan te duiden, gevolgd door anti-muis AlexaFluor488 en anti-konijn AlexaFluor568 secundaire antilichamen. Roosters werden ingeklemd tussen een dekglaasje en een glasplaatje en afgebeeld bij RT op een breedveldmicroscoop (100x 1,47 NA olieobjectief, sCMOS-camera).
Een voordeel van fluorescentie-etikettering van dunne secties ten opzichte van conventionele IF voor hele cellen is de verhoogde resolutie in Z, aangezien de fysieke dikte van de sectie 60-90 nm is. Met deze verbeterde Z-resolutie vertoont de fluorescentie-etikettering van LC3 en LAMP1 op dunne secties zeer weinig colokalisatie (Figuur 2A). In cellen die worden behandeld met lysosomale remmers, zoals BafA1, treedt een hoge colokalisatie op, aangezien lysosomaal ingesloten LC3 niet wordt afgebroken9. In onbehandelde cellen wordt LC3 snel afgebroken bij contact met enzymatisch actieve, LAMP1-positieve lysosomen, en daarom is co-lokalisatie zeldzaam in deze omstandigheden. Over het algemeen werd minder dan één LC3-punctum per celprofiel waargenomen. Dit geeft aan dat zelfs in uitgehongerde omstandigheden de omzet van autofagosomen snel is, waardoor het aantal autofagosomen laag blijft. Het benadrukt ook het belang van het gebruik van CLEM om de zeldzame LC3-gelabelde structuren te vinden, met behulp van het grote gezichtsveld dat wordt geboden door lichtmicroscopie. Bovendien maakt de hogere gevoeligheid van fluorescentie-etikettering in vergelijking met goudetikettering de identificatie van meer LC3-positieve organellen mogelijk dan in conventionele immuno-EM, wat hun karakterisering verder bevordert.
Na het verkrijgen van een volledige tegelset van het lint van secties, werden de roosters uit de microscoop gehaald en nagekleurd voor EM met behulp van UA en de loop-out-methode (protocolstappen 4.4-4.6; Figuur 1F,G). Deze 'loop-out' methode zorgt ervoor dat er een dun laagje UA:methylcellulose op het rooster achterblijft, waardoor het gewenste contrast in de EM ontstaat. De dikte van de laag is afhankelijk van de snelheid en de hoek waarmee de UA:methylcellulose op het filtreerpapier wordt gedept. Als u de lus te snel sleept, kan er te veel UA:methylcellulose op het rooster achterblijven en kan het uiterlijk van de secties in EM donkerder worden. Te langzaam slepen kan te veel UA:methylcellulose wegtrekken, wat resulteert in te weinig kleuring en een slechte morfologie, en het risico loopt dat het raster uit de lus valt. De "olievlek"-kleuring (figuur 1G) op droge roosters geeft een geschikte laagdikte UA:methylcellulose aan.
Na het doorlussen en drogen werden de roosters in een TEM afgebeeld met ROI's geselecteerd door fluorescentie. De IF- en EM-datasets werden gecorreleerd door het DAPI-signaal te overlappen met de contouren van kernen die zichtbaar zijn in de EM, waardoor een geïntegreerd beeld werd gegenereerd met informatie over beide modaliteiten.
Het kan een uitdaging zijn om in EM hetzelfde gebied te vinden als geselecteerd in IF. Het is daarom aan te raden om tijdens het zoeken in de EM een overzichtsafbeelding van de IF-tegelset bij de hand te houden. Gebruikers moeten zoeken naar herkenbare kenmerken in beide modaliteiten, zoals vouwen of scheuren in de secties, rasterbalken of rangschikking van kernen. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat het monster in EM geroteerd en gespiegeld kan lijken. 'Finder grids' met specifieke kenmerken om gebieden te identificeren kunnen worden gebruikt om de correlatie te vergemakkelijken (zie Tabel met materialen).
Correlatie van de LC3-positieve organellen met de EM-ultrastructuur onthulde dat de verschillende puncta verschillende stadia van autofagie vertegenwoordigden (Figuur 2B). Hoewel het behoud van de autofagosomale ultrastructuur een uitdaging is bij cryosecties, werden organellen met cytoplasmatische inhoud en dubbele membranen vaak waargenomen (Figuur 2C, pijlen in organellen 1-5; Aanvullende figuur S1), die de morfologische kenmerken van autofagosomen definiëren. Interessant is dat vrij zwakke fluorescerende vlekken door EM werden geïdentificeerd als LC3-positieve autolysosomen (Figuur 2C, organel 6; autofagische inhoud is gemarkeerd met *), gekenmerkt door dichte inhoud en intraluminale blaasjes. Dit toonde aan dat zeer kleine hoeveelheden LC3 zichtbaar zijn in IF van ultradunne cryosecties, en gaf aan dat ondanks het afbraakmilieu sommige LC3 detecteerbaar is in steady-state autolysosomen. De meerderheid van de LC3-positieve puncta vertegenwoordigde echter autofagosomen, terwijl autolysosomen zeer zeldzaam waren. Dit in tegenstelling tot met BafA1 behandelde cellen, die voornamelijk autolysosomen accumuleren en geen autofagosomen9.
Samengevat beschrijft dit protocol een CLEM-methode voor het koppelen van moleculaire informatie verkregen door fluorescentiemicroscopie aan de ultrastructuur van EM. Deze methode verhoogt de gevoeligheid van immuno-EM, omdat alleen fluoroforen worden gebruikt voor etikettering en deze over het algemeen meer signaal afgeven dan EM-sondes. De methode is vooral geschikt voor het gebruik van ultradunne cryosecties, waarbij hoge niveaus van specifieke fluorescentie over verwaarloosbare achtergrondkleuring kunnen worden verkregen. Door fluorescentie te gebruiken om te screenen op zeldzame structuren of gebeurtenissen en geselecteerde ROI's te correleren met EM, kunnen de EM-bedrijfstijd en de bijbehorende kosten aanzienlijk worden verminderd. De gevoeligheid en haalbaarheid van de methode wordt aangetoond door de visualisatie van LC3 in onbehandelde, uitgehongerde cellen, waaruit blijkt dat LC3 in deze omstandigheden voornamelijk associeert met autofagosomen, met zeer lage niveaus zichtbaar in autolysosomen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de CLEM . (A) Cryosecties van in gelatine ingebedde cellen worden verzameld op een met formvar gecoat koperen rooster. (B) Roosters worden sectie-down verwerkt op druppeltjes van de juiste oplossingen. (C) Roosters zijn gelabeld met primaire en fluorescerende secundaire antilichamen. (D) Roosters zijn ingeklemd tussen een dekglaasje en een glasplaatje in 50% glycerol. (E) Fluorescentiebeelden worden verzameld in een breedveldmicroscoop. (F) Roosters worden uit het glasplaatje gehaald en verder verwerkt door uranylkleuring voor EM. (G) Na droging kunnen de roosters door TEM in beeld worden gebracht. (H) TEM-beeldtegelset met hoge vergroting wordt verkregen uit een gebied dat is geselecteerd uit fluorescentiegegevens. (I) Beelden van fluorescentiemicroscopie en EM zijn gecorreleerd en over elkaar heen gelegd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figuur 2: CLEM van LC3 en LAMP1 in uitgehongerde HEPG2-cellen. HEPG2-cellen werden gedurende 2 uur uitgehongerd in EBSS voorafgaand aan fixatie met 4% PFA gedurende 2 uur. (A) IF-beeldvorming van LC3 (groen) en LAMP1 (rood) op secties onthult relatief weinig LC3-puncta en weinig colokalisatie met LAMP1. (B) Koppeling van moleculaire informatie van IF (linkerpaneel) aan de ultrastructurele informatie verkregen in EM (middelste paneel) door overlapping van de twee beeldvormingsmodaliteiten op basis van DAPI en nucleaire contouren (stippellijnen, rechterpaneel). De ultrastructuur van de afzonderlijke compartimenten met het LC3-label, zoals geïllustreerd door vak 1 (rechterpaneel), wordt weergegeven in C. (C) Ultrastructuur van LC3-positieve compartimenten. CLEM-afbeeldingen worden aan de linkerkant weergegeven en pseudogekleurde (beige) EM-afbeeldingen aan de rechterkant (ongekleurde EM-afbeeldingen worden weergegeven in aanvullende afbeelding S1). Binnenste en buitenste autofagosomale membranen worden aangegeven met respectievelijk witte en zwarte pijlpunten. Het autofagische gehalte in het autolysosoom in voorbeeld 6 wordt aangegeven met *. Schaalstaven = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende figuur S1: Ongekleurde EM-beelden van LC3-positieve organellen. (A-F) Ongekleurde EM-afbeeldingen van pseudogekleurde voorbeelden 1-6 weergegeven in figuur 2C. De organellen werden geselecteerd door LC3-fluorescentie, zoals beschreven in figuur 2. Binnenste en buitenste autofagosomale membranen worden aangegeven met respectievelijk witte en zwarte pijlpunten. Het autofagische gehalte in het autolysosoom in voorbeeld 6 wordt aangegeven met *. Schaalbalken = 200 nm. Afkortingen: AL = autolysosoom; AP = autofagosoom; M = mitochondrion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: Buffers en oplossingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Dit aanvullende bestand bevat de recepten en protocollen die nodig zijn om de buffers en oplossingen te maken die in dit onderzoek zijn gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Lokalisatie van eiwitten in de context van de ultrastructuur van de cel is al tientallen jaren een krachtig onderzoeksinstrument. Met dit protocol hebben we de eiwitten uitgebreid die weinig of moeilijk te lokaliseren zijn. We gebruiken fluorescentiemicroscopie om eiwitten op een gevoelige en screenbare manier te labelen en combineren dit met elektronenmicroscopie om de ultrastructuur van de cel opnieuw te vullen.Hier zullen we CLEM op autofagie-eiwitten demonstreren, maar het kan echt worden toegepast op elke biologische vraag waarbij de ultrastructuur van de cel van belang is, vooral bij de studie van zeldzame gebeurtenissen. De procedure wordt samen met mij gedemonstreerd door Tineke Veenendaal, een senior onderzoekstechnicus van ons laboratorium. Vervang om te beginnen de PBS met 0,15% glycine door 1% gelatine in PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius.Schraap en breng de cellen in gelatine over in een microcentrifugebuis. Pelleteer de cellen bij 6.000 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur in een microcentrifuge en verwijder vervolgens de gelatine zonder de pellet te verstoren. Voeg 12% gelatine opgewarmd tot 37 graden Celsius toe aan de pellet en resuspendeer voorzichtig door te pipetteren met pipetpunten of glazen weidepipetten die op dezelfde temperatuur zijn voorverwarmd.Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en pellet de cellen vervolgens gedurende één minuut bij 6.000 G. Laat de gelatine 30 minuten stollen op ijs. Om de met gelatine ingebedde cellen uit de buis te verwijderen, snijdt u het buisuiteinde met de pellet met een scheermesje af van de rest van de buis.Snijd vervolgens het buisuiteinde met de celkorrel doormidden loodrecht op de eerste snede. Plaats de twee buiseindhelften met de celpellet in 2,3 molaire sucrose en incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Dit zorgt ervoor dat de helften van de celpellets iets krimpen en loskomen van de plastic buis.Verwijder de buishelften met de in gelatine ingebedde celpellet uit de sucrose en verwijder vervolgens de celpellethelften met een pincet van de plastic buishelften. Snijd de pellet handmatig in blokken van de juiste grootte met een scheermesje en gebruik een stereo-ontleedmicroscoop om het onderwerp tijdens het snijden te vergroten. Incubeer de celblokken 's nachts in 2,3 molaire sucrose bij vier graden Celsius.Plaats ze op een aluminium monsterhouderpen. Laat voldoende sacharose rond de randen van het blok zodat het een dunne kraag vormt tussen het blok en de pin. Snap vries het in en bewaar het in vloeibare stikstof.Snijd de voorkant van het blok af om het oppervlak af te vlakken om secties van ongeveer 250 nanometer dik te verkrijgen. Snijd vervolgens de zijkanten van het blok af door 50 tot 100 micrometer in de zijkant van het oppervlak van het monsterblok te snijden met de meshoek. Door vier zijden van het oppervlak van het monsterblok bij te snijden, ontstaat een uitstekende rechthoek van ongeveer 250 bij 375 micrometer.Doorsnijd een lint van de uitstekende rechthoek en zorg ervoor dat de secties tussen de 70 en 90 nanometer dik zijn en een zilverachtige gouden glans hebben. Leid de secties weg van de rand van het diamantmes met een haar op een stok om een lang lint te maken. Pak het lint op door de drie millimeter lange opneemlus in een één-op-één mengsel van 2,3 molaire sucrose en 2% methylcellulose te dopen.Steek de lus in de cryokamer van de microtoom en zodra de druppel begint te bevriezen, pakt u de secties onmiddellijk op door de druppel er voorzichtig tegenaan te drukken. Verwijder de lus uit de cryokamer. Wacht tot de druppel volledig ontdooid is en druk de druppel op een voorbereid rooster.Leg de roosters met secties op ongeveer een milliliter PBS in een schaaltje of bord met meerdere putjes en incubeer ze 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwerk de roosters op ongeveer 75 microliter druppels op Parafilm en begin met PBS glycine wasbeurten op kamertemperatuur. Incubeer de roosters met een blokkeerbuffer van 0,1% runderserumalbumine C en 0,5% vishuidgelatine in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur als blokkeerstap.Verdun primaire antilichamen in de blokkeerbuffer in PBS en incubeer de roosters op ongeveer 10 microliter druppeltjes van deze oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de roosters in 0,1% runderserumalbumine in PBS vijf keer op kamertemperatuur. Verdun de secundaire antilichamen en DAPI in de blokkerende buffer bij PBS.Incubeer de roosters vervolgens op ongeveer 10 microliter druppeltjes van deze oplossing gedurende 30 minuten of langer bij kamertemperatuur voordat u de roosters vijf keer in PBS wast, zoals eerder weergegeven. Om de monsters voor lichtmicroscopie te monteren, dompelt u de roosters twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur onder in 50% glycerol in gedestilleerd water. Plaats één rooster per dekglaasje tussen een glasglaasje en een dekglaasje in 50% glycerol en zorg ervoor dat de secties naar het dekglaasje wijzen.Voor lichtmicroscopie brengt u een glasplaatje met de ingeklemde roosters naar een breedveldmicroscoop met een geautomatiseerde tafel. Selecteer een olie-objectief met een hoge vergrotingsfactor en maak een afbeeldingstegelset van het lint met secties. Voeg vervolgens, voor demontage en elektronenmicroscopie of EM-contrast, 10 microliter gedestilleerd water toe aan de zijkant van de slipsandwich van het glazen glaasje en wacht tot de capillaire werking de sandwichinterface van de glazen afdekplaat vult.Verwijder voorzichtig het afdekglaasje zonder immersieolie in de glycerol te mengen. Haal de roosters eruit met een pincet en dompel ze drie keer onder in gedestilleerd water op kamertemperatuur om de 50% glycerol af te wassen. Droog de achterkant van het rooster voorzichtig af met pluisvrij vloeipapier en leg de roosters met de snijkant naar beneden op gedestilleerde waterdruppels.Om de secties te kleuren voor contrast in elektronenmicroscopie, incubeert u ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met uranylacetaat. Koel de uranylacetaatmethylcellulose-oplossing af door de druppeltjes op Parafilm op een metalen plaat op ijs te plaatsen. Was de roosters vervolgens twee keer met deze ijskoude oplossing en broed ze 10 minuten in de oplossing.Maak een lus van de roosters door een drooglus van het rooster in de druppel uranylacetaatmethylcellulose onder elk rooster te steken en deze voorzichtig op te tillen totdat het rooster van de druppel is getrokken. Om de overtollige oplossing te deppen, raakt u de lus in een hoek van ongeveer 60 graden aan op het pluisvrije filterpapier en sleept u deze langzaam langs het papier totdat er geen oplossing meer wordt geabsorbeerd. Plaats de lus met het rooster in een geschikt rooster en laat het langer dan 10 minuten op kamertemperatuur drogen.Gebruik het overzicht verkregen door lichtmicroscopie om een gebied te lokaliseren dat van belang is voor beeldvorming in de transmissie-elektronenmicroscoop of TEM, en annoteer de ROI op de lichtmicroscopiedataset. Zodra een gebied is geselecteerd, verkrijgt u een afbeeldingstegel die is ingesteld op een vergroting van 20.000x tot 50.000x in de TEM. Reconstrueer de afbeeldingstegelset in nabewerkingssoftware.Voer de correlatie uit op basis van DAPI-signaal en fluorescentie- en nucleaire contouren in elektronenmicroscopie. Verschuif de afbeeldingen om ze precies over elkaar heen te leggen en voer de handmatige correlatie nauwkeurig uit. Hepatoblastoom-afgeleide HEPG2-cellen werden gedurende twee uur uitgehongerd in EBSS voorafgaand aan fixatie met 4%paraldehyde gedurende twee uur.IF-beeldvorming van LC3 en LAMP1 op secties toont relatief weinig LC3-puncta en weinig colokalisatie met LAMP1. Moleculaire informatie van IF werd gekoppeld aan de ultrastructurele informatie verkregen in elektronenmicroscopie door de twee beeldvormingsmodaliteiten op basis van DAPI en nucleaire contouren over elkaar heen te leggen. De correlatie van de LC3-positieve organellen met de EM-ultrastructuur onthulde dat de verschillende puncta verschillende stadia van autofagie vertegenwoordigden.De ultrastructuur van de afzonderlijke compartimenten met LC3-label, zoals geïllustreerd door box één, wordt hier getoond. De gecorreleerde lichtelektronenmicroscopiebeelden worden aan de linkerkant getoond en de pseudo-gekleurde elektronenmicroscopiebeelden worden aan de rechterkant getoond. Binnenste en buitenste autofagosomale membranen worden aangegeven met witte en zwarte pijlpunten.Interessant is dat EM relatief zwakke fluorescerende vlekken identificeerde als LC3-positieve autolysosomen, die worden gekenmerkt door dichte inhoud en intraluminale blaasjes. Dit onthult een minimale LC3-zichtbaarheid in IF van ultradunne cryosecties, wat wijst op detecteerbare LC3 in steady-state autolysosomen ondanks de afbrekende omgeving. LC3-positieve puncta vertegenwoordigen echter voornamelijk autofagosomen en enkele autolysosomen.Voor onderzoekers die immunogold labeling willen doen in plaats van on-section CLEM, zijn de hier beschreven protocollen en tips ook volledig toepasbaar voor immunogold labeling. We pasten aanvankelijk CLEM toe op endosomale regulerende eiwitten met een lage abundantie en toonden voor het eerst hun endogene ultrastructurele lokalisatie aan.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlatieve Confocal en 3D Electron Microscopy van een specifiek Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisatie van subcellulaire lokalisatie van een eiwit in het hart met behulp van Quantum Dots-Gemedieerde immuno-labeling gevolgd door transmissie-elektronenmicroscopie