Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Nous remercions nos collègues du Centre de médecine moléculaire du Centre médical universitaire d’Utrecht pour leurs discussions et leurs commentaires fructueux. Nous remercions les collègues passés et présents du laboratoire Klumperman pour l’amélioration continue de nos technologies de microscopie. L’infrastructure EM utilisée pour ce travail fait partie du programme de recherche National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) financé par le Conseil néerlandais de la recherche (NWO), numéro de projet 184.034.014 à JK.

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

La méthode présentée ici tire parti des progrès récents dans le domaine de la CLEM sur section basée sur la cryosection, c’est-à-dire la haute sensibilité du marquage IF et la corrélation précise (erreur de <100 nm) entre FM et EM14,24. Il en résulte une méthode sensible au marquage fluorescent de protéines endogènes rares et capable de les superposer avec une grande précision à l’ultrastructure EM. Ainsi, cette méthode permet d’éviter la (sur)expression de protéines marquées exogènes et l’utilisation de marquages EM moins sensibles. La faisabilité de la méthode est démontrée par des exemples de CLEM sur la LC3 endogène dans des cellules affamées, sans l’utilisation d’inhibiteurs lysosomaux.
Les cryocoupes décongelées obtenues avec la méthode Tokuyasu sont des échantillons idéaux pour l’immuno-EM, car contrairement aux coupes de résine, elles sont perméables aux anticorps. Combiné à des procédures de fixation et de contraste douces, cela donne généralement une superbe efficacité de marquage par rapport à d’autres méthodes sans compromettre l’ultrastructure détaillée, et visualise parfaitement les membranes cellulaires 12,25,26. De plus, les cryosections sont hautement compatibles avec la microscopie à fluorescence, ce qui en fait des substrats précieux pour CLEM. Le marquage immunogold classique et le CLEM sur les cryocoupes ont fourni des informations déterminantes dans la compréhension de l’organisation subcellulaire 14,27,28,29,30.
À l’heure actuelle, les applications de CLEM sur les cryocoupes décongelées sont de plus en plus répandues, à la suite de développements et d’optimisations continus 14,20,24,31,32,33,34 qui ont amélioré la qualité, l’applicabilité et la précision de l’approche. Aujourd’hui, grâce à une corrélation précise de grands ensembles de tuiles d’images IF et EM, la technique facilite le criblage de l’ultrastructure des composants cellulaires endogènes marqués par fluorescence 14,32,33. Il s’agit d’un avantage par rapport à l’immuno-EM classique, où la recherche de structures marquées à l’or nécessite généralement un fort grossissement et est donc plus laborieuse et prend beaucoup de temps. C’est pour cette raison que la localisation de la LC3 dans l’ultrastructure bénéficie grandement de CLEM. Les organites LC3-positifs sont fréquents lorsque la clairance autophagique est bloquée (c’est-à-dire lorsque les cellules sont traitées avec du BafA1 ou des agents augmentant le pH), tandis que les organites autophagiques sont rapidement éliminés dans les cellules non altérées ou affamées, ce qui entraîne des niveaux d’équilibre très faibles. Dans de telles conditions, il peut être difficile de trouver des organites marqués par LC3 à l’aide de l’immuno-EM classique, et le CLEM offre un net avantage.
Auparavant, le CLEM sur des coupes de résine a été appliqué dans des études utilisant l’expression ectopique de LC3-GFP ou une sonde tandem LC3-GFP-RFP 35,36,37,38,39. Dans ces études, l’imagerie par fluorescence a été réalisée avant l’enrobage ou directement dans les sections de résine acrylique40, et les échantillons ont ensuite été examinés par EM. L’enrobage de résine présente plusieurs avantages ; L’échostructure autophagosomale est généralement bien conservée, surtout si le matériau est congelé à haute pression40. De plus, le contraste des matériaux enrobés de résine colorés aux métaux lourds est généralement plus prononcé que celui des cryocoupes colorées à l’uranyle. Les coupes enrobées de résine sont compatibles avec les méthodes EM volumétriques, telles que la tomographie sur puce, le FIB-MEB ou le MEB en série, alors que les cryosections ne le sont pas. Dans les approches qui effectuent l’imagerie avant l’intégration, l’imagerie de cellules vivantes est une option41 qui n’est pas disponible dans CLEM sur les cryosections. Le principal avantage du CLEM sur les cryosections par rapport à ces alternatives est le signal IF élevé, permettant l’immunolocalisation de protéines rares sans avoir besoin de perméabilisation ou de surexpression membranaire. Cela permet d’éviter les potentielles extractions membranaires, les artefacts de surexpression42 et les modifications génétiques du sujet, ce qui, combiné à la possibilité de corréler de grandes surfaces dans l’IF et l’EM, en fait un excellent outil pour étudier la LC3 et l’autophagie.
Ici, l’application de CLEM sur section à des cellules HEPG2 affamées a révélé que LC3 était principalement localisée à des structures identifiées comme des autophagosomes. De plus, quelques taches faiblement fluorescentes ont été trouvées dans les autolysosomes. Ceci est en contraste direct avec les cellules traitées avec BafA19 et reflète la dégradation rapide des protéines autophagosomiques une fois que l’autophagosome fusionne avec les lysosomes. Dans l’ensemble, les données ont démontré que le CLEM des cryocoupes décongelées peut fournir des informations sur l’autophagie médiée par la LC3 dans des conditions natives. Les données mettent également en évidence la sensibilité de la technologie, puisque la LC3 a été détectée même dans des autolysosomes qui ne contiennent que de faibles niveaux d’épitopes de LC3 intacts. L’application ultérieure de cette technique par imagerie de la LC3 dans différents modèles et conditions améliorera notre compréhension de l’autophagie et d’autres processus biologiques médiés par la LC3, tels que la phagocytose associée à la LC3 ou la conjugaison de l’ATG8 à des membranes individuelles.
Au-delà de l’autophagie, le CLEM sur section peut être appliqué à d’autres événements ou structures rares, tels que la division cellulaire, l’infection, les types de cellules rares dans les tissus, les kinétochores, les cils primaires ou les organites spécifiques au type cellulaire. Un dépistage efficace du sujet d’intérêt par l’IF peut grandement faciliter l’étude ultrastructurale de ces raretés. De plus, il a été démontré14 que la technique peut être utilisée pour localiser des protéines d’une manière plus sensible que l’immuno-EM classique. L’ajustement de la longueur de fixation peut encore étendre cette sensibilité, permettant la localisation ultrastructurale de protéines très peu abondantes ou peu antigéniques. Enfin, la méthode CLEM en coupe facilite la sélection rapide d’un nombre quantitatif d’organites, facilitant une analyse plus robuste de la distribution ultrastructurale d’une protéine donnée.
Le CLEM sur les cryosections nécessite l’équipement et l’expertise nécessaires à la cryosection. Dans les groupes ayant accès à ces outils (par exemple, les cryomicrotomes), la mise en œuvre du CLEM sur section est simple et ne nécessite que la disponibilité d’un microscope à grand champ automatisé, une configuration à laquelle la plupart des laboratoires ont accès. De plus, la méthode est disponible dans les installations EM du monde entier. Étant donné que le CLEM en coupe combine l’application des méthodes IF et EM établies, la méthode est facilement adaptable et peut être combinée, par exemple, avec la tomographie 20,33,43, le volume de coupe en série EM d’un nombre limité de sections 44, ou la microscopie à super-résolution 45. Cette polyvalence de la méthode permet des applications à un large éventail de questions biologiques.

L’autophagie est un processus clé pour l’élimination et le recyclage des protéines et des organites cytoplasmiques. Le processus de macro-autophagie (ci-après appelé autophagie) implique la formation d’organites à double membrane, les autophagosomes, qui permettent aux cellules d’enfermer des molécules cytoplasmiques et des organites pour la dégradation lysosomale. L’autophagie se produit au niveau basal dans la plupart des cellules et est régulée à la hausse en réponse à des conditions cellulaires, telles que la famine ou le stress cellulaire. L’autophagie se produit soit d’une manière spécifique au substrat, ciblant des structures ou des protéines spécifiques pour la dégradation, soit sous la forme d’un processus de masse non sélectif englobant des parties du cytosol. Dans l’autophagie sélective, les autophagosomes sont formés par la conjugaison de protéines de la famille Atg8 (protéines associées aux microtubules 1A/B chaîne légère 3A/B/C [LC3] et GABARAPs) à des membranes dérivées du recyclage des endosomes, du Golgi et/ou du réticulum endoplasmique (ER)1. LC3 reconnaît la cargaison autophagique dans le cytosol directement ou via des adaptateurs d’autophagie sélectifs tels que P62/SQSTM. De nouvelles membranes autophagiques peuvent ensuite être conjuguées à LC3, se dilater et fusionner pour former une double membrane complète renfermant la cargaison, appelée autophagosome. L’autophagosome mûrit et finit par fusionner avec un endosome ou un lysosome, après quoi la cargaison autophagique et les adaptateurs sont dégradés2.
Les études sur la formation, la maturation et la fusion des autophagosomes font souvent appel à des technologies de microscopie optique. La microscopie à fluorescence de la LC3 est généralement utilisée pour évaluer le nombre et la localisation cellulaire des autophagosomes dans différentes conditions. De plus, en couplant la LC3 à la GFP sensible au pH et à la RFP stable au pH dans une sonde dite tandem, le flux global d’autophagie peut être mesuré dans les cellules vivantes en fonction de la perte de fluorescence de la GFP3. Ces approches sont des outils précieux pour les chercheurs afin de comprendre le rôle et le mécanisme de l’autophagie dans différentes conditions. Un autre outil précieux est la microscopie électronique (EM), qui révèle l’ultrastructure des organites autophagiques à différents stades de l’autophagie 4,5,6,7,8. À ce jour, l’EM reste la méthode de choix pour identifier les étapes précises de la formation de l’autophagosome en discriminant différentes membranes autophagiques par morphologie : phagophore (double membrane non complètement fermée), autophagosome (double membrane fermée autour de la cargaison cytosolique) et autolysosome (perte [partielle] de la membrane autophagique interne). Cependant, la morphologie sans information moléculaire peut être sujette à des erreurs d’identification ou à des ambiguïtés. L’immuno-EM est la méthode la plus complète pour la caractérisation moléculaire et la classification morphologique simultanées des organites autophagiques. Par exemple, le marquage immunogold de la LC3 sur des cryocoupes décongelées permet la localisation ultrastructurale de la LC3 et l’identification précise des organites marqués LC39.
L’inconvénient de l’EM est le faible champ de vision qui accompagne le fort grossissement nécessaire pour observer l’ultrastructure fine des membranes autophagiques et, dans le cas de l’immuno-EM, pour localiser le marquage qui marque la protéine d’intérêt. En raison de leur rareté et de leur faible teneur en protéines, cela entrave généralement l’analyse EM quantitative des autophagosomes. Pour augmenter le nombre d’autophagosomes, les cellules sont souvent affamées et traitées avec de la bafilomycine A1 (BafA1), un inhibiteur de l’acidification et de la dégradation lysosomales. Sans traitement BafA1, la recherche d’autophagosomes par EM prend beaucoup de temps, en raison de la rareté de ces organites. La méthode présentée dans ce manuscrit aborde cette question par le marquage fluorescent et l’imagerie de la LC3 endogène sur des cryocoupes décongelées dans un microscope à fluorescence avant une préparation ultérieure à l’EM. Les images fluorescentes guident ensuite la recherche de structures marquées LC3 dans l’EM. Après la collecte, les images EM sont corrélées avec les images de fluorescence pour ajouter de l’information moléculaire – la présence de LC3 – à l’ultrastructure de la cellule. Cette méthode « CLEM sur coupe » augmente considérablement la capacité à trouver des structures marquées LC3, en particulier dans des conditions non traitées, pour une identification et une classification ultérieures par EM.
Cette méthode a été appliquée à des cellules HEPG210 dérivées d’hépatoblastomes affamés pour trouver des autophagosomes dans des conditions non modifiées (c’est-à-dire qu’aucun BafA1 n’a été utilisé). Relativement peu de puncta fluorescents (moins d’un par profil cellulaire dans une section de 90 nm) ont été trouvés, ce qui est en accord avec le renouvellement élevé de LC311. Cette rareté de LC3-puncta a mis en évidence la valeur de CLEM ; en sélectionnant des régions avec plusieurs puncta fluorescentes pour l’imagerie dans l’EM, des organites LC3-positifs ont été trouvés et caractérisés d’une manière beaucoup plus efficace que par immuno-EM conventionnelle. Cela a révélé que la majorité des organites LC3 positifs étaient des autophagosomes, tels que définis par leur morphologie, ce qui contraste avec les résultats obtenus dans les cellules traitées par BafA1, où les autolysosomes sont plus fréquents9. Ces données montrent qu’avec le CLEM en coupe, l’autophagie peut être étudiée au niveau ultrastructurel sans qu’il soit nécessaire d’inhiber le flux autophagique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

La visualisation des organites autophagiques au niveau ultrastructural par microscopie électronique (EM) est essentielle pour établir leur identité et révéler des détails importants pour la compréhension du processus autophagique. Cependant, les méthodes EM manquent souvent d’informations moléculaires, ce qui entrave la corrélation entre les informations ultrastructurales obtenues par EM et la localisation de protéines d’autophagie spécifiques par microscopie à fluorescence. De plus, la rareté des autophagosomes dans des conditions cellulaires non altérées entrave l’investigation par EM, qui nécessite un fort grossissement, et fournit donc un champ de vision limité.
En réponse à ces deux défis, une méthode de microscopie électronique corrélative en coupe (CLEM) basée sur le marquage fluorescent a été appliquée pour corréler un marqueur autophagosomique commun, LC3, à l’ultrastructure EM. La méthode a été utilisée pour cribler rapidement les cellules en microscopie à fluorescence pour le marquage LC3 en combinaison avec d’autres marqueurs pertinents. Par la suite, les caractéristiques ultrastructurales sous-jacentes de certaines taches marquées par LC3 ont été identifiées par CLEM. La méthode a été appliquée à des cellules affamées sans ajout d’inhibiteurs de l’acidification lysosomale.
Dans ces conditions, la LC3 a été retrouvée principalement sur les autophagosomes et rarement dans les autolysosomes, dans lesquels la LC3 est rapidement dégradée. Ces données montrent à la fois la faisabilité et la sensibilité de cette approche, démontrant que CLEM peut être utilisé pour fournir des informations ultrastructurales sur l’autophagie médiée par la LC3 dans des conditions natives, sans traitements médicamenteux ni altérations génétiques. Dans l’ensemble, cette méthode présente un outil précieux pour les études de localisation ultrastructurale des protéines d’autophagie et d’autres antigènes rares en reliant la microscopie optique aux données EM.

Un protocole immuno-EM optimisé pour le marquage immuno-or de la LC3 sur des cryocoupes ultraminces a été récemment publié par De Maziere et al.9. Cette étude a porté sur des conditions de famine sans BafA1, dans lesquelles la CL3 était présente mais relativement rare et difficile à trouver par EM. Une méthode CLEM sur coupe a été introduite dans une étude distincte, qui utilise la sensibilité du marquage par fluorescence pour visualiser des protéines endogènes relativement rares et faiblement exprimées et les corréler à l’ultrastructure EM14. Ici, ces deux approches sont combinées par l’utilisation du protocole de marquage LC3 optimisé dans le cadre d’une approche CLEM.
Les cellules HEPG2, des cellules dérivées du foie avec des niveaux relativement élevés d’autophagie basale22, ont été affamées dans un milieu minimal (solution saline équilibrée d’Earle [EBSS]) pendant 2 h avant la fixation dans 4% de PFA. S’en est suivie la préparation de l’échantillon par la méthode Tokuyasu de cryosection ultramince (sections 1 à 3 ; voir Fente et Geuze12), qui est hautement compatible avec la méthode CLEM 14,23 sur section. Les cryocoupes décongelées ont été marquées par fluorescence (section 4 du protocole et figure 1) à l’aide de l’anticorps primaire anti-LC39 de souris. De plus, l’anticorps anti-LAMP1 du lapin a été utilisé pour indiquer les endo-lysosomes, suivi des anticorps secondaires anti-souris AlexaFluor488 et anti-lapin AlexaFluor568. Des grilles ont été prises en sandwich entre une lamelle de recouvrement et une lame de verre et photographiées à RT sur un microscope à grand champ (objectif à huile 100x 1,47 NA, caméra sCMOS).
L’un des avantages du marquage par fluorescence des lames minces par rapport à l’IF conventionnel des cellules entières est l’augmentation de la résolution en Z, puisque l’épaisseur physique de la section est de 60 à 90 nm. Grâce à cette résolution Z améliorée, le marquage par fluorescence de LC3 et de LAMP1 sur des lames minces révèle très peu de colocalisation (Figure 2A). Dans les cellules traitées avec des inhibiteurs lysosomaux, tels que BafA1, une colocalisation élevée se produit, car la LC3 enfermée dans le lysosome reste non dégradée9. Dans les cellules non traitées, la LC3 est rapidement dégradée au contact de lysosomes enzymatiquement actifs et positifs pour LAMP1, et la colocalisation est donc rare dans ces conditions. En général, moins d’un punctum de LC3 par profil cellulaire a été observé. Cela indique que même dans des conditions de famine, le renouvellement des autophagosomes est rapide, ce qui maintient le nombre d’autophagosomes à un faible niveau. Il souligne également l’importance d’utiliser CLEM pour trouver les structures rares marquées LC3, en utilisant le large champ de vision fourni par la microscopie optique. De plus, la sensibilité plus élevée du marquage par fluorescence par rapport au marquage à l’or permet d’identifier plus d’organites LC3-positifs que dans l’immuno-EM conventionnelle, ce qui facilite encore leur caractérisation.
Après l’acquisition d’un ensemble complet de tuiles du ruban de sections, les grilles ont été extraites du microscope et post-colorées pour l’EM à l’aide de l’UA et de la méthode de bouclage (étapes de protocole 4.4-4.6 ; Graphique 1F, G). Cette méthode de « bouclage » garantit qu’une fine couche d’UA :méthylcellulose reste sur la grille, ce qui crée le contraste souhaité dans l’EM. L’épaisseur de la couche dépend de la vitesse et de l’angle avec lesquels l’UA :méthylcellulose est étalée sur le papier filtre. Si vous faites glisser la boucle trop rapidement, vous risquez de laisser trop d’UA :méthylcellulose sur la grille et d’assombrir l’apparence des sections dans EM. Si vous traînez trop lentement, vous risquez d’évacuer trop d’UA :méthylcellulose, ce qui entraîne trop peu de coloration et une mauvaise morphologie, et risque de faire tomber la grille hors de la boucle. La coloration de la « nappe d’huile » (figure 1G) sur les grilles sèches indique une épaisseur de couche UA :méthylcellulose appropriée.
Après bouclage et séchage, les grilles ont été imagées dans un MET à des retours d’intérêt sélectionnés par fluorescence. Les ensembles de données IF et EM ont été corrélés en superposant le signal DAPI aux contours des noyaux visibles dans l’EM, générant une image intégrée contenant des informations sur les deux modalités.
Il peut être difficile de trouver la même zone dans EM que celle sélectionnée dans IF. Il est donc recommandé de garder une vue d’ensemble de l’ensemble de tuiles IF à portée de main lors de la recherche dans l’EM. Les utilisateurs doivent rechercher des caractéristiques reconnaissables dans les deux modalités, telles que des plis ou des déchirures dans les sections, des barres de grille ou la disposition des noyaux. Il est également important de garder à l’esprit que l’échantillon peut apparaître tourné et reflété dans EM. Des « grilles de recherche » avec des caractéristiques spécifiques pour identifier les zones peuvent être utilisées pour faciliter la corrélation (voir le tableau des matériaux).
La corrélation des organites LC3-positifs à l’ultrastructure EM a révélé que les différents puncta représentaient des stades distincts de l’autophagie (Figure 2B). Bien que la préservation de l’ultrastructure autophagosomale soit difficile dans les cryosections, des organites à contenu cytoplasmique et à double membrane ont été fréquemment observés (Figure 2C, flèches dans les organites 1-5 ; Figure supplémentaire S1), qui définissent les caractéristiques morphologiques des autophagosomes. Il est intéressant de noter que des taches fluorescentes assez faibles ont été identifiées par EM comme des autolysosomes LC3 positifs (Figure 2C, organite 6 ; le contenu autophagique est marqué *), caractérisés par un contenu dense et des vésicules intraluminales. Cela a montré que de très petites quantités de LC3 sont visibles dans les FI des cryosections ultraminces, et a indiqué que malgré le milieu de dégradation, une partie de la LC3 est détectable dans les autolysosomes à l’état d’équilibre. Cependant, la majorité des puncta LC3-positives représentaient des autophagosomes, alors que les autolysosomes étaient très rares. Cela contraste avec les cellules traitées au BafA1, qui accumulent principalement des autolysosomes et non des autophagosomes9.
En résumé, ce protocole décrit une méthode CLEM sur coupe pour relier l’information moléculaire obtenue par microscopie à fluorescence à l’ultrastructure de l’EM. Cette méthode augmente la sensibilité de l’immuno-EM, car seuls les fluorophores sont utilisés pour le marquage et ceux-ci produisent généralement plus de signal que les sondes EM. La méthode est particulièrement adaptée à l’utilisation de cryosections ultraminces, dans lesquelles des niveaux élevés de fluorescence spécifique sur une coloration de fond négligeable peuvent être obtenus. En utilisant la fluorescence pour dépister des structures ou des événements rares et en corrélant les ROI sélectionnés à la ME, le temps d’opération de la ME et les coûts associés peuvent être considérablement réduits. La sensibilité et la faisabilité de la méthode sont démontrées par la visualisation de la LC3 dans des cellules affamées non traitées, montrant que la LC3 s’associe principalement aux autophagosomes dans ces conditions, avec de très faibles niveaux visibles dans les autolysosomes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du CLEM sur la section. (A) Les cryocoupes de cellules enrobées de gélatine sont recueillies sur une grille de cuivre recouverte de formvar. (B) Les grilles sont traitées en coupe sur des gouttelettes des solutions appropriées. (C) Les grilles sont marquées avec des anticorps primaires et secondaires fluorescents. (D) Des grilles sont prises en sandwich entre une lamelle et une lame de verre en glycérol à 50 %. (E) Les images de fluorescence sont recueillies dans un microscope à grand champ. (F) Les grilles sont extraites de la lame de verre et traitées ultérieurement par coloration à l’uranyle pour les EM. (G) Après séchage, les grilles peuvent être imagées par MET. (H) L’ensemble de tuiles d’image TEM à fort grossissement est acquis à partir d’une zone sélectionnée à partir de données de fluorescence. (I) Les images de la microscopie à fluorescence et de l’EM sont corrélées et superposées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figure 2 : CLEM de LC3 et LAMP1 dans des cellules HEPG2 affamées. Les cellules HEPG2 ont été affamées pendant 2 h dans l’EBSS avant la fixation avec 4 % de PFA pendant 2 h. (A) L’imagerie IF de LC3 (vert) et LAMP1 (rouge) sur les coupes révèle relativement peu de ponctuations de LC3 et peu de colocalisation avec LAMP1. (B) Relier l’information moléculaire de l’IF (panneau de gauche) à l’information ultrastructurale obtenue en EM (panneau du milieu) en superposant les deux modalités d’imagerie basées sur le DAPI et les contours nucléaires (lignes pointillées, panneau de droite). L’ultrastructure des différents compartiments marqués LC3, illustrée par l’encadré 1 (panneau de droite), est illustrée en C. (C) Ultrastructure des compartiments LC3 positifs. Les images CLEM sont montrées à gauche et les images EM pseudocolorées (beiges) à droite (les images EM non colorées sont montrées dans la figure supplémentaire S1). Les membranes autophagosomiques internes et externes sont indiquées par des pointes de flèches blanches et noires, respectivement. Le contenu autophagique à l’intérieur de l’autolysosome dans l’exemple 6 est indiqué par *. Barres d’échelle = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Images EM non colorées d’organites LC3 positifs. (A-F) Images EM non colorées des exemples pseudo-colorés 1 à 6 illustrés à la figure 2C. Les organites ont été sélectionnés par fluorescence LC3, comme décrit pour la figure 2. Les membranes autophagosomiques internes et externes sont indiquées par des pointes de flèches blanches et noires, respectivement. Le contenu autophagique à l’intérieur de l’autolysosome dans l’exemple 6 est indiqué par *. Barres d’échelle = 200 nm. Abréviations : AL = autolysosome ; AP = autophagosome ; M = mitochondrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Tampons et solutions utilisés dans cette étude. Ce fichier supplémentaire contient les recettes et les protocoles nécessaires à la fabrication des tampons et des solutions utilisés dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Nous présentons ici un protocole de microscopie électronique optique corrélative corrélative sur coupe basé sur le marquage endogène par fluorescence comme outil pour étudier la localisation de protéines rares en relation avec l’ultrastructure cellulaire. La puissance de cette approche est démontrée par la localisation ultrastructurale de la LC3 endogène dans des cellules affamées sans traitement par la bafilomycine.

Localisation ultrastructurale de la LC3 endogène par microscopie électronique luminescente corrélative sur coupe

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

La localisation des protéines dans le contexte de l’ultrastructure de la cellule est un outil de recherche puissant depuis des décennies. Avec ce protocole, nous avons étendu les protéines peu abondantes ou difficiles à localiser. Nous utilisons la microscopie à fluorescence pour marquer les protéines de manière sensible et criblable et la combinons avec la microscopie électronique pour recharger l’ultrastructure de la cellule.Ici, nous allons faire une démonstration en coupe de CLEM sur les protéines d’autophagie, mais il peut vraiment être appliqué à n’importe quelle question biologique où l’ultrastructure de la cellule est intéressante, en particulier dans l’étude d’événements rares. Tineke Veenendaal, technicienne de recherche senior de notre laboratoire, fera une démonstration de la procédure avec moi. Pour commencer, remplacez le PBS contenant 0,15 % de glycine par 1 % de gélatine dans du PBS préchauffé à 37 degrés Celsius.Grattez et transférez les cellules dans la gélatine dans un tube de microcentrifugation. Pelleter les cellules à 6 000 G pendant une minute à température ambiante dans une microcentrifugeuse, puis retirer la gélatine sans perturber la pastille. Ajouter 12 % de gélatine chauffée à 37 degrés Celsius à la pastille et remettre en suspension doucement en pipetant avec des pointes de pipette ou des pipettes de pâturage en verre préchauffées à la même température.Incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis granulez les cellules à 6 000 g pendant une minute. Solidifiez la gélatine sur de la glace pendant 30 minutes. Pour retirer les cellules enrobées de gélatine du tube, coupez l’extrémité du tube contenant la pastille du reste du tube avec une lame de rasoir.Coupez ensuite l’extrémité du tube avec la pastille de cellule en deux perpendiculairement à la première coupe. Placez les deux moitiés d’extrémité du tube contenant la pastille de cellule dans 2,3 molaires de saccharose et incubez pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Cela provoque le rétrécissement léger des moitiés de pastilles cellulaires et leur délogation du tube en plastique.Retirez les moitiés de tube avec la pastille de cellules enrobée de gélatine du saccharose, puis retirez les moitiés de pastilles de cellules des moitiés de tubes en plastique avec une pince à épiler. Coupez manuellement la pastille en blocs d’une taille appropriée avec une lame de rasoir et utilisez un microscope à dissection stéréoscopique pour grossir le sujet pendant la coupe. Incubez les blocs cellulaires pendant une nuit dans du saccharose de 2,3 molaires à quatre degrés Celsius.Placez-les sur une goupille porte-échantillon en aluminium. Laissez suffisamment de saccharose sur les bords du bloc pour qu’il forme un mince collier entre le bloc et la goupille. Congelez-le et conservez-le dans de l’azote liquide.Coupez l’avant du bloc pour aplatir sa surface afin d’obtenir des sections d’environ 250 nanomètres d’épaisseur. Coupez ensuite les côtés du bloc en sectionnant de 50 à 100 micromètres sur le côté de la face du bloc d’échantillon avec le coin du couteau. Le découpage de quatre côtés de la face du bloc d’échantillon créera un rectangle saillant d’environ 250 par 375 micromètres.Sectionnez un ruban à partir du rectangle saillant en veillant à ce que les sections aient une épaisseur comprise entre 70 et 90 nanomètres et aient un éclat doré argenté. Éloignez les sections du tranchant du couteau diamanté avec un cheveu sur un bâton pour créer un long ruban. Prenez le ruban en trempant la boucle de ramassage de trois millimètres dans un mélange un pour un de 2,3 molaires de saccharose et de 2 % de méthylcellulose.Insérez la boucle dans la chambre cryogénique du microtome, et une fois que la gouttelette commence à geler, ramassez rapidement les sections en appuyant doucement la gouttelette contre elles. Retirez la boucle de la chambre cryogénique. Attendez que la gouttelette soit complètement décongelée et pressez-la sur une grille préparée.Placez les grilles avec des sections sur environ un millilitre de PBS dans un petit plat ou une assiette à plusieurs puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Traitez les grilles sur environ 75 microlitres de gouttelettes sur Parafilm et commencez par des lavages à la glycine PBS à température ambiante. Incuber les grilles avec un tampon bloquant composé de 0,1 % d’albumine C sérique bovine et de 0,5 % de gélatine de peau de poisson dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante comme étape de blocage.Diluer les anticorps primaires dans le tampon bloquant dans le PBS et incuber les grilles sur des gouttelettes d’environ 10 microlitres de cette solution pendant une heure à température ambiante. Laver les grilles dans de l’albumine sérique bovine à 0,1 % dans du PBS cinq fois à température ambiante. Diluer les anticorps secondaires et le DAPI dans le tampon bloquant du PBS.Ensuite, incubez les grilles sur des gouttelettes d’environ 10 microlitres de cette solution pendant 30 minutes ou plus à température ambiante avant de laver les grilles dans du PBS cinq fois comme indiqué précédemment. Pour monter les échantillons pour la microscopie optique, immergez les grilles dans du glycérol à 50 % dans de l’eau distillée deux fois pendant cinq minutes à température ambiante. Placez une grille par lamelle entre une lame de verre et une lamelle de recouvrement à 50 % de glycérol, en veillant à ce que les sections soient face à la lamelle.Pour la microscopie optique, prenez une lame de verre avec les grilles prises en sandwich dans un microscope à grand champ avec une platine automatisée. Sélectionnez un objectif à huile à fort grossissement et créez un ensemble de mosaïques d’image du ruban de sections. Ensuite, pour le démontage et la microscopie électronique ou le contraste EM, ajoutez 10 microlitres d’eau distillée sur le côté du sandwich de glissement du couvercle de lame en verre et attendez que l’action capillaire remplisse l’interface sandwich du couvercle en verre.Retirez délicatement la lamelle sans mélanger l’huile d’immersion dans le glycérol. Récupérez les grilles avec une pince à épiler et plongez-les dans de l’eau distillée trois fois à température ambiante pour éliminer les 50 % de glycérol. Séchez soigneusement l’arrière de la grille avec un papier de soie non pelucheux et placez la section de la grille côté vers le bas sur des gouttelettes d’eau distillée.Pour colorer les coupes de contraste en microscopie électronique, incubez-les avec de l’acétate d’uranyle pendant cinq minutes à température ambiante. Refroidir la solution d’acétate d’uranyle méthylcellulose en plaçant les gouttelettes sur Parafilm sur une plaque métallique sur de la glace. Lavez ensuite les grilles avec cette solution glacée deux fois et incubez-les dans la solution pendant 10 minutes.Bouclez les grilles en insérant une boucle de séchage de la grille dans la gouttelette d’acétate d’uranyle méthylcellulose sous chaque grille et en la soulevant doucement jusqu’à ce que la grille soit retirée de la gouttelette. Pour éponger l’excès de solution, touchez la boucle à un angle d’environ 60 degrés sur le papier filtre non pelucheux et faites-la glisser lentement le long du papier jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de solution absorbée. Placez la boucle avec la grille dans une grille appropriée et laissez-la sécher à température ambiante pendant plus de 10 minutes.Utilisez la vue d’ensemble obtenue par microscopie optique pour localiser une région d’intérêt pour l’imagerie dans le microscope électronique à transmission ou MET, et annotez le retour sur investissement sur l’ensemble de données de microscopie optique. Une fois qu’une région est sélectionnée, obtenez une tuile d’image réglée à un grossissement de 20 000x à 50 000x dans le MET. Reconstruisez le jeu de tuiles d’image dans un logiciel de post-traitement.Effectuer la corrélation basée sur le signal DAPI et les contours de fluorescence et nucléaires en microscopie électronique. Déplacez les images pour les superposer avec précision et effectuez la corrélation manuelle avec précision. Les cellules HEPG2 dérivées de l’hépatoblastome ont été affamées pendant deux heures dans l’EBSS avant d’être fixées avec du paraldéhyde à 4 % pendant deux heures.L’imagerie IF de LC3 et LAMP1 sur des coupes révèle relativement peu de ponctuations de LC3 et peu de colocalisation avec LAMP1. L’information moléculaire de l’IF a été liée à l’information ultrastructurale obtenue en microscopie électronique en superposant les deux modalités d’imagerie basées sur le DAPI et les contours nucléaires. La corrélation des organites positifs de la LC3 à l’ultrastructure EM a révélé que les différents puncta représentaient des stades distincts de l’autophagie.L’ultrastructure des différents compartiments marqués LC3, illustrée par la première boîte, est illustrée ici. Les images de microscopie électronique lumière corrélative sont montrées à gauche, et les images de microscopie électronique pseudo-colorées sont montrées à droite. Les membranes autophagosomiques internes et externes sont indiquées par des pointes de flèches blanches et noires.Il est intéressant de noter que l’EM a identifié des taches fluorescentes relativement faibles comme des autolysosomes LC3 positifs, qui sont caractérisés par un contenu dense et des vésicules intraluminales. Cela révèle une visibilité minimale de la LC3 dans l’IF des coupes cryogéniques ultra-minces, suggérant une LC3 détectable dans les autolysosomes à l’état stationnaire malgré l’environnement de dégradation. Cependant, les puncta positifs de la LC3 représentent principalement des autophagosomes, peu d’entre eux représentant des autolysosomes.Pour les chercheurs qui souhaitent effectuer un marquage immunogold au lieu d’un CLEM sur section, les protocoles et les conseils décrits ici sont également pleinement applicables au marquage immunogold. Nous avons d’abord appliqué CLEM en coupe à des protéines régulatrices endosomiques de faible abondance et montré pour la première fois, leur localisation ultrastructurale endogène.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: la localisation des protéines en utilisant la microscopie Localisation Photo-actif et microscopie électronique

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Recherche

Biologie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Corrélative confocale et microscopie électronique 3D d&#39;une cellule sensorielle spécifique

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge congélation: un outil pour les études ultrastructurales et immunolocalisation de cellules en suspension dans microscopie électronique à transmission

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Congélation rapide à l’aide d’un dispositif de congélation sandwich pour une bonne conservation ultrastructurale des échantillons biologiques en microscopie électronique

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisation de la localisation subcellulaire d’une protéine dans le cœur à l’aide de l’immunomarquage médié par les points quantiques suivi de la microscopie électronique à transmission