Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
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Wir danken unseren Kolleginnen und Kollegen am Zentrum für Molekulare Medizin des Universitätsklinikums Utrecht für die fruchtbaren Gespräche und Rückmeldungen. Wir danken ehemaligen und aktuellen Kollegen des Klumperman-Labors für die kontinuierliche Verbesserung unserer Mikroskopietechnologien. Die für diese Arbeit verwendete EM-Infrastruktur ist Teil des Forschungsprogramms National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI), das vom niederländischen Forschungsrat (NWO) finanziert wird, Projektnummer 184.034.014 an JK.

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Die hier vorgestellte Methode nutzt die jüngsten Fortschritte in der Kryosektions-basierten On-Section-CLEM - die hohe Sensitivität der IF-Markierung und die genaue (<100 nm Fehler) Korrelation zwischen FM und EM14,24. Dies führt zu einer Methode mit der Empfindlichkeit, seltene, endogene Proteine fluoreszenzmarkiert zu markieren und diese mit hoher Präzision auf die EM-Ultrastruktur zu überlagern. Somit vermeidet diese Methode die Notwendigkeit einer (Über-)Expression von exogen markierten Proteinen und die Verwendung weniger empfindlicher EM-Markierungen. Die Machbarkeit der Methode wird anhand von CLEM-Beispielen an endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne den Einsatz lysosomaler Inhibitoren gezeigt.
Aufgetaute Kryoschnitte, die mit der Tokuyasu-Methode gewonnen wurden, sind ideale Proben für die Immun-EM, da sie im Gegensatz zu Harzschnitten durchlässig für Antikörper sind. In Kombination mit milder Fixierung und kontrastierenden Verfahren führt dies im Allgemeinen zu einer hervorragenden Markierungseffizienz gegenüber anderen Methoden, ohne die detaillierte Ultrastruktur zu beeinträchtigen, und visualisiert Zellmembranen hervorragend 12,25,26. Darüber hinaus sind Kryoschnitte sehr gut kompatibel mit der Fluoreszenzmikroskopie, was sie zu wertvollen Substraten für CLEM macht. Sowohl die klassische Immunogold-Markierung als auch CLEM auf Kryosektionen haben bahnbrechende Einblicke in das Verständnis der subzellulären Organisation geliefert 14,27,28,29,30.
Derzeit werden CLEM auf aufgetaute Kryoschnitte immer häufiger angewendet, was auf kontinuierliche Entwicklungen und Optimierungenzurückzuführen ist 14,20,24,31,32,33,34, die die Qualität, Anwendbarkeit und Genauigkeit des Ansatzes verbessert haben. Durch die genaue Korrelation großer ZF- und EM-Bildkacheln erleichtert die Technik nun das Screening auf die Ultrastruktur fluoreszenzmarkierter endogener zellulärer Komponenten 14,32,33. Dies ist ein Vorteil gegenüber der klassischen Immuno-EM, bei der die Suche nach goldmarkierten Strukturen typischerweise eine hohe Vergrößerung erfordert und daher aufwändiger und zeitintensiver ist. Aus diesem Grund profitiert die Lokalisierung von LC3 in der Ultrastruktur stark von CLEM. LC3-positive Organellen treten häufig auf, wenn die autophagische Clearance blockiert ist (d. h. wenn Zellen mit BafA1 oder pH-erhöhenden Mitteln behandelt werden), während autophagische Organellen in unveränderten oder ausgehungerten Zellen schnell beseitigt werden, was zu sehr niedrigen Steady-State-Werten führt. Unter solchen Bedingungen kann es schwierig sein, LC3-markierte Organellen mit klassischer Immun-EM zu finden, und CLEM bietet einen klaren Vorteil.
Zuvor wurde CLEM auf Harzschnitten in Studien mit ektopischer Expression von LC3-GFP oder einer LC3-GFP-RFP-Tandemsonde angewendet 35,36,37,38,39. In diesen Studien wurde eine Fluoreszenzbildgebung vor dem Einbetten oder direkt in Acrylharzabschnitten40 durchgeführt, und die Proben wurden anschließend durch EM gescreent. Es gibt mehrere Vorteile der Harzeinbettung; Die autophagosomale Ultrastruktur ist im Allgemeinen gut erhalten, insbesondere wenn das Material unter Hochdruck gefroren ist40. Darüber hinaus ist der Kontrast von schwermetallgefärbtem, harzeingebettetem Material im Allgemeinen ausgeprägter als der von uranylgefärbten Kryoschnitten. In Harz eingebettete Schnitte sind mit volumetrischen EM-Methoden wie Array-Tomographie, FIB-REM oder seriellem Blockface-REM kompatibel, Kryoschnitte hingegen nicht. Bei Ansätzen, bei denen vor dem Einbetten eine Bildgebung durchgeführt wird, ist die Bildgebung lebender Zellen eine Option41, die in CLEM für Kryoschnitte nicht verfügbar ist. Der Hauptvorteil von CLEM bei Kryosektionen gegenüber diesen Alternativen ist das hohe IF-Signal, das eine Immunlokalisierung seltener Proteine ermöglicht, ohne dass eine Membranpermeabilisierung oder Überexpression erforderlich ist. Dies vermeidet eine mögliche Membranextraktion, Überexpressionsarefakte42 und genetische Modifikationen des Probanden, was es in Kombination mit der Möglichkeit, große Bereiche in IF und EM zu korrelieren, zu einem hervorragenden Werkzeug für die Untersuchung von LC3 und Autophagie macht.
Hier zeigte die Anwendung von On-Section-CLEM auf ausgehungerte HEPG2-Zellen, dass LC3 hauptsächlich in Strukturen lokalisiert ist, die als Autophagosomen identifiziert wurden. Zusätzlich wurden einige schwach fluoreszierende Flecken in Autolysosomen gefunden. Dies steht in direktem Gegensatz zu Zellen, die mit BafA19 behandelt wurden, und spiegelt den schnellen Abbau autophagosomaler Proteine wider, sobald das Autophagosom mit den Lysosomen fusioniert. Insgesamt zeigten die Daten, dass CLEM von aufgetauten Kryoschnitten Einblicke in die LC3-vermittelte Autophagie unter nativen Bedingungen geben kann. Die Daten unterstreichen auch die Empfindlichkeit der Technologie, da LC3 auch in Autolysosomen nachgewiesen wurde, die nur geringe Mengen an intakten LC3-Epitopen enthalten. Die weitere Anwendung dieser Technik durch die Abbildung von LC3 in verschiedenen Modellen und Bedingungen wird unser Verständnis der Autophagie und anderer LC3-vermittelter biologischer Prozesse, wie z.B. der LC3-assoziierten Phagozytose oder der Konjugation von ATG8 mit einzelnen Membranen, verbessern.
Über die Autophagie hinaus kann CLEM im Schnitt auch auf andere seltene Ereignisse oder Strukturen angewendet werden, wie z. B. Zellteilung, Infektion, seltene Zelltypen in Geweben, Kinetochoren, primäre Zilien oder zelltypspezifische Organellen. Ein effektives Screening des interessierenden Themas durch IF kann die ultrastrukturelle Untersuchung dieser Raritäten erheblich erleichtern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass mit der Technik Proteine empfindlicher lokalisiertwerden können als mit der klassischen Immun-EM. Die Anpassung der Fixationslänge kann diese Empfindlichkeit weiter verlängern und die ultrastrukturelle Lokalisierung von sehr niedrig oder schlecht antigenen Proteinen ermöglichen. Schließlich erleichtert die On-Section-CLEM-Methode die schnelle Selektion einer quantitativen Anzahl von Organellen und ermöglicht so eine robustere Analyse der ultrastrukturellen Verteilung eines bestimmten Proteins.
CLEM für Kryosektionen erfordert die Ausrüstung und das Fachwissen für die Kryosektion. In Gruppen mit Zugang zu diesen Werkzeugen (z. B. Kryomikrotomen) ist die Implementierung von On-Section-CLEM unkompliziert und erfordert nur die Verfügbarkeit eines automatisierten Weitfeldmikroskops, zu dem die meisten Labore Zugang haben. Darüber hinaus ist die Methode in EM-Einrichtungen weltweit verfügbar. Da die On-Section-CLEM die Anwendung etablierter IF- und EM-Methoden kombiniert, ist die Methode leicht anpassbar und kann beispielsweise mit der Tomographie 20,33,43, der seriellen Schnittvolumen-EM einer begrenzten Anzahl von Abschnitten 44 oder der superauflösenden Mikroskopie 45 kombiniert werden. Diese Vielseitigkeit der Methode unterstützt die Anwendung auf ein breites Spektrum biologischer Fragestellungen.

Autophagie ist ein Schlüsselprozess für die Beseitigung und das Recycling von zytoplasmatischen Proteinen und Organellen. Der Prozess der Makroautophagie (im Folgenden Autophagie genannt) beinhaltet die Bildung von Doppelmembranorganellen, Autophagosomen, die es den Zellen ermöglichen, zytoplasmatische Moleküle und Organellen für den lysosomalen Abbau einzuschließen. Autophagie findet in den meisten Zellen auf basaler Ebene statt und wird als Reaktion auf zelluläre Bedingungen wie Hunger oder zellulären Stress hochreguliert. Die Autophagie erfolgt entweder substratspezifisch, indem sie auf bestimmte Strukturen oder Proteine abzielt, um sie abzubauen, oder als nicht-selektiver Massenprozess, der Teile des Zytosols umfasst. Bei der selektiven Autophagie werden Autophagosomen durch die Konjugation von Proteinen der Atg8-Familie (Mikrotubuli-assoziierte Proteine 1A/B-Leichtkette 3A/B/C [LC3] und GABARAPs) mit Membranen gebildet, die aus Recycling-Endosomen, dem Golgi und/oder dem endoplasmatischen Retikulum (ER)1 stammen. LC3 erkennt autophagische Fracht im Zytosol direkt oder über selektive Autophagie-Adapter wie P62/SQSTM. Neue autophagische Membranen können dann mit LC3 konjugiert werden, sich ausdehnen und verschmelzen, um eine vollständige Doppelmembran zu bilden, die die Fracht umschließt - das sogenannte Autophagosom. Das Autophagosom reift heran und verschmilzt schließlich mit einem Endosom oder Lysosom, woraufhin die autophagische Fracht und die Adapter abgebaut werden2.
Studien zur Autophagosomenbildung, -reifung und -fusion nutzen häufig lichtmikroskopische Technologien. Die Fluoreszenzmikroskopie von LC3 wird im Allgemeinen verwendet, um die Anzahl und zelluläre Lokalisation von Autophagosomen unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen. Darüber hinaus kann durch die Kopplung von LC3 an pH-sensitives GFP und pH-stabiles RFP in einer sogenannten Tandemsonde der Gesamtfluss der Autophagie in lebenden Zellen in Abhängigkeit vom GFP-Fluoreszenzverlustgemessen werden 3. Diese Ansätze sind wertvolle Werkzeuge für Forscher, um die Rolle und den Mechanismus der Autophagie unter verschiedenen Bedingungen zu verstehen. Ein weiteres unschätzbares Werkzeug ist die Elektronenmikroskopie (EM), die die Ultrastruktur von autophagischen Organellen in verschiedenen Stadien der Autophagie aufdeckt 4,5,6,7,8. Bis heute ist EM immer noch die Methode der Wahl, um die genauen Stadien der Autophagosomenbildung zu identifizieren, indem verschiedene autophagische Membranen nach ihrer Morphologie unterschieden werden: Phagophor (Doppelmembran nicht vollständig geschlossen), Autophagosom (geschlossene Doppelmembran um zytosolische Fracht) und Autolysosom ([teilweiser] Verlust der inneren autophagischen Membran). Eine Morphologie ohne molekulare Informationen kann jedoch anfällig für Fehlidentifikationen oder Mehrdeutigkeiten sein. Immuno-EM ist die umfassendste Methode zur gleichzeitigen molekularen Charakterisierung und morphologischen Klassifikation autophagischer Organellen. Zum Beispiel ermöglicht die Immunogold-Markierung von LC3 auf aufgetauten Kryoschnitten die ultrastrukturelle Lokalisierung von LC3 und die präzise Identifizierung von LC3-markierten Organellen9.
Ein Nachteil der EM ist das kleine Sichtfeld, das mit der hohen Vergrößerung einhergeht, die erforderlich ist, um die feine Ultrastruktur der autophagischen Membranen zu beobachten und im Falle der Immun-EM die Markierung zu finden, die das gewünschte Protein markiert. Aufgrund ihrer Knappheit und ihres geringen Proteingehalts erschwert dies in der Regel die quantitative EM-Analyse von Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu erhöhen, werden die Zellen oft ausgehungert und mit Bafilomycin A1 (BafA1), einem Inhibitor der lysosomalen Ansäuerung und des Abbaus, behandelt. Ohne BafA1-Behandlung ist die Suche nach Autophagosomen mittels EM aufgrund der Knappheit dieser Organellen zeitintensiv. Die in diesem Manuskript vorgestellte Methode befasst sich mit diesem Problem durch Fluoreszenzmarkierung und Bildgebung von endogenem LC3 auf aufgetauten Kryoschnitten in einem Fluoreszenzmikroskop vor der weiteren Vorbereitung auf EM. Die Fluoreszenzbilder leiten dann die Suche nach LC3-markierten Strukturen in der EM. Nach der Entnahme werden die EM-Bilder mit den Fluoreszenzbildern korreliert, um der Ultrastruktur der Zelle molekulare Informationen – das Vorhandensein von LC3 – hinzuzufügen. Diese "On-Section-CLEM"-Methode erhöht die Fähigkeit, LC3-markierte Strukturen zu finden, insbesondere unter unbehandelten Bedingungen, für die anschließende Identifizierung und Klassifizierung durch EM.
Diese Methode wurde auf ausgehungerte Hepatoblastom-abgeleitete HEPG210-Zellen angewendet, um Autophagosomen unter unveränderten Bedingungen (d.h. es wurde kein BafA1 verwendet) zu finden. Es wurden relativ wenige fluoreszierende Punkte (weniger als eine pro Zellprofil in einem 90-nm-Schnitt) gefunden, was mit dem hohen Umsatz von LC311 übereinstimmt. Diese Spärlichkeit von LC3-puncta unterstrich den Wert von CLEM; Durch die Auswahl von Regionen mit mehreren fluoreszierenden Punkten für die Bildgebung in der EM wurden LC3-positive Organellen gefunden und auf eine wesentlich effektivere Weise charakterisiert als durch konventionelle Immun-EM. Dabei zeigte sich, dass es sich bei der Mehrzahl der LC3-positiven Organellen um Autophagosomen handelte, die durch ihre Morphologie definiert sind, was im Gegensatz zu den Ergebnissen steht, die in BafA1-behandelten Zellen erzielt wurden, wo Autolysosomen häufiger vorkommen9. Diese Daten zeigen, dass mit On-Section-CLEM die Autophagie auf ultrastruktureller Ebene untersucht werden kann, ohne dass der autophagische Fluss gehemmt werden muss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

Die Visualisierung autophagischer Organellen auf ultrastruktureller Ebene durch Elektronenmikroskopie (EM) ist unerlässlich, um ihre Identität festzustellen und Details zu enthüllen, die für das Verständnis des autophagischen Prozesses wichtig sind. EM-Methoden fehlen jedoch oft molekulare Informationen, was die Korrelation der durch EM gewonnenen ultrastrukturellen Informationen mit der fluoreszenzmikroskopischen Lokalisierung spezifischer Autophagieproteine behindert. Darüber hinaus erschwert die Seltenheit von Autophagosomen unter unveränderten zellulären Bedingungen die Untersuchung mittels EM, die eine hohe Vergrößerung erfordert und daher ein begrenztes Sichtfeld bietet.
Als Antwort auf beide Herausforderungen wurde eine auf Fluoreszenzmarkierung basierende Methode der korrelativen Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) angewendet, um einen gemeinsamen autophagosomalen Marker, LC3, mit der EM-Ultrastruktur zu korrelieren. Die Methode wurde verwendet, um Zellen in der Fluoreszenzmikroskopie für die LC3-Markierung in Kombination mit anderen relevanten Markern schnell zu screenen. Anschließend wurden die zugrundeliegenden ultrastrukturellen Merkmale ausgewählter LC3-markierter Spots mittels CLEM identifiziert. Die Methode wurde auf ausgehungerte Zellen angewendet, ohne dass Inhibitoren der lysosomalen Ansäuerung zugesetzt wurden.
Unter diesen Bedingungen wurde LC3 überwiegend auf Autophagosomen und selten in Autolysosomen gefunden, in denen LC3 schnell abgebaut wird. Diese Daten zeigen sowohl die Machbarkeit als auch die Sensitivität dieses Ansatzes und zeigen, dass CLEM verwendet werden kann, um ultrastrukturelle Einblicke in die LC3-vermittelte Autophagie unter nativen Bedingungen zu liefern - ohne medikamentöse Behandlungen oder genetische Veränderungen. Insgesamt stellt diese Methode ein wertvolles Werkzeug für ultrastrukturelle Lokalisierungsstudien von Autophagieproteinen und anderen seltenen Antigenen dar, indem sie die Lichtmikroskopie mit EM-Daten verbindet.

Ein optimiertes Immuno-EM-Protokoll für die Immuno-Gold-Markierung von LC3 auf ultradünnen Kryoschnitten wurde kürzlich von De Maziere et al. veröffentlicht.9. Diese Studie umfasste hungernde Bedingungen ohne BafA1, in denen LC3 zwar vorhanden, aber relativ selten und für EM schwer zu finden war. In einer separaten Studie wurde eine On-Section-CLEM-Methode vorgestellt, die die Sensitivität der Fluoreszenzmarkierung nutzt, um relativ seltene und niedrig exprimierte endogene Proteine sichtbar zu machen und diese mit der EM-Ultrastruktur zu korrelieren14. Hier werden diese beiden Ansätze durch die Verwendung des optimierten LC3-Markierungsprotokolls im Rahmen eines CLEM-Ansatzes kombiniert.
HEPG2-Zellen, aus der Leber stammende Zellen mit relativ hoher basaler Autophagie22, wurden vor der Fixierung in 4% PFA 2 h lang in minimalem Medium (Earle's balanced salt solution [EBSS]) ausgehungert. Darauf folgte die Probenvorbereitung mit der Tokuyasu-Methode der ultradünnen Kryosektion (Abschnitte 1-3; siehe Slot und Geuze12), die sehr gut mit dem On-Sektions-CLEM 14,23 kompatibel ist. Die aufgetauten Kryoschnitte wurden mit einem Maus-Anti-LC3-Primärantikörper9 fluoreszenzmarkiert (Protokollabschnitt 4 und Abbildung 1). Zusätzlich wurde Kaninchen-Anti-LAMP1 verwendet, um Endo-Lysosomen anzuzeigen, gefolgt von Anti-Maus-AlexaFluor488- und Anti-Kaninchen-AlexaFluor568-Sekundärantikörpern. Die Gitter wurden zwischen einem Deckglas und einem Objektträger platziert und mit RT auf einem Weitfeldmikroskop (100x 1,47 NA Ölobjektiv, sCMOS-Kamera) abgebildet.
Ein Vorteil der Fluoreszenzmarkierung von Dünnschliffen gegenüber herkömmlichen Ganzzell-IF ist die erhöhte Auflösung in Z, da die physikalische Dicke des Schnitts 60-90 nm beträgt. Mit dieser verbesserten Z-Auflösung zeigt die Fluoreszenzmarkierung von LC3 und LAMP1 auf Dünnschliffen nur eine sehr geringe Kolokalisation (Abbildung 2A). In Zellen, die mit lysosomalen Inhibitoren wie BafA1 behandelt wurden, kommt es zu einer hohen Kolokalisation, da lysosomal-umschlossenes LC3 nicht abgebaut wird9. In unbehandelten Zellen wird LC3 bei Kontakt mit enzymatisch aktiven, LAMP1-positiven Lysosomen schnell abgebaut, so dass eine Kolokalisation unter diesen Bedingungen selten ist. Im Allgemeinen wurde weniger als ein LC3-Punctum pro Zellprofil beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass selbst unter Hungerbedingungen der Umsatz von Autophagosomen schnell abläuft, wodurch die Anzahl der Autophagosomen niedrig bleibt. Es unterstreicht auch, wie wichtig es ist, CLEM zu verwenden, um die seltenen LC3-markierten Strukturen zu finden, indem das große Sichtfeld der Lichtmikroskopie genutzt wird. Darüber hinaus ermöglicht die höhere Sensitivität der Fluoreszenzmarkierung im Vergleich zur Goldmarkierung die Identifizierung von mehr LC3-positiven Organellen als bei der herkömmlichen Immun-EM, was ihre Charakterisierung weiter unterstützt.
Nach der Erfassung eines vollständigen Kachelsatzes des Schnittbandes wurden die Gitter aus dem Mikroskop entnommen und mit UA und der Loop-Out-Methode für EM nachgefärbt (Protokollschritte 4.4-4.6; Abbildung 1F,G). Diese "Loop-Out"-Methode sorgt dafür, dass eine dünne Schicht UA:Methylcellulose auf dem Gitter verbleibt, wodurch der gewünschte Kontrast im EM entsteht. Die Dicke der Schicht hängt von der Geschwindigkeit und dem Winkel ab, mit dem die UA:Methylcellulose auf das Filterpapier abgetupft wird. Wenn Sie die Schleife zu schnell ziehen, kann zu viel UA:Methylcellulose auf dem Raster zurückbleiben und das Erscheinungsbild der Abschnitte in EM verdunkeln. Zu langsames Ziehen kann zu viel UA:Methylcellulose wegziehen, was zu zu wenig Färbung und schlechter Morphologie führt und das Risiko birgt, dass das Gitter aus der Schleife fällt. Die "Ölteppich"-Färbung (Abbildung 1G) auf trockenen Gittern weist auf eine geeignete UA:Methylcellulose-Schichtdicke hin.
Nach dem Loop-Out und der Trocknung wurden die Gitter in einem TEM mit ROIs abgebildet, die durch Fluoreszenz ausgewählt wurden. Die IF- und EM-Datensätze wurden korreliert, indem das DAPI-Signal mit den Umrissen der im EM sichtbaren Kerne überlagert wurde, wodurch ein integriertes Bild mit Informationen beider Modalitäten erzeugt wurde.
Es kann eine Herausforderung sein, den gleichen Bereich in EM zu finden, der in IF ausgewählt wurde. Es empfiehlt sich daher, bei der Suche im EM ein Übersichtsbild des IF-Tilesets griffbereit zu haben. Benutzer sollten in beiden Modalitäten nach erkennbaren Merkmalen suchen, wie z. B. Falten oder Risse in den Abschnitten, Gitterstäben oder der Anordnung der Kerne. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass die Probe in EM gedreht und gespiegelt erscheinen kann. "Finder-Raster" mit spezifischen Merkmalen zur Identifizierung von Bereichen können verwendet werden, um die Korrelation zu erleichtern (siehe Materialtabelle).
Die Korrelation der LC3-positiven Organellen mit der EM-Ultrastruktur zeigte, dass die verschiedenen Puncta unterschiedliche Stadien der Autophagie repräsentierten (Abbildung 2B). Obwohl die Erhaltung der autophagosomalen Ultrastruktur in Kryoschnitten eine Herausforderung darstellt, wurden häufig Organellen mit zytoplasmatischem Gehalt und Doppelmembranen beobachtet (Abbildung 2C, Pfeile in Organellen 1-5; Ergänzende Abbildung S1), die morphologische Merkmale von Autophagosomen definieren. Interessanterweise wurden eher schwache fluoreszierende Spots mittels EM als LC3-positive Autolysosomen identifiziert (Abbildung 2C, Organelle 6; autophagischer Gehalt ist markiert *), die sich durch dichten Inhalt und intraluminale Vesikel auszeichnen. Dies zeigte, dass sehr geringe Mengen an LC3 in IF von ultradünnen Kryoschnitten sichtbar sind, und deutete darauf hin, dass trotz des abbauenden Milieus etwas LC3 in stationären Autolysosomen nachweisbar ist. Die Mehrzahl der LC3-positiven Puncta repräsentierte jedoch Autophagosomen, während Autolysosomen sehr selten waren. Dies steht im Gegensatz zu BafA1-behandelten Zellen, die in erster Linie Autolysosomen und keine Autophagosomen akkumulieren9.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine On-Section-CLEM-Methode zur Verknüpfung von molekularen Informationen, die durch Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden, mit der Ultrastruktur von EM. Diese Methode erhöht die Sensitivität von Immuno-EM, da nur Fluorophore für die Markierung verwendet werden und diese in der Regel mehr Signal liefern als EM-Sonden. Die Methode eignet sich besonders für den Einsatz von ultradünnen Kryoschnitten, bei denen ein hohes Maß an spezifischer Fluoreszenz über vernachlässigbare Hintergrundfärbungen erzielt werden kann. Durch die Verwendung von Fluoreszenz zum Screening nach seltenen Strukturen oder Ereignissen und die Korrelation ausgewählter ROIs mit EM können die EM-Betriebszeit und die damit verbundenen Kosten erheblich gesenkt werden. Die Sensitivität und Durchführbarkeit der Methode wird durch die Visualisierung von LC3 in unbehandelten, ausgehungerten Zellen demonstriert, die zeigt, dass LC3 unter diesen Bedingungen überwiegend an Autophagosomen assoziiert, wobei in Autolysosomen nur sehr geringe Konzentrationen sichtbar sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht über CLEM im Querschnitt . (A) Kryoschnitte von in Gelatine eingebetteten Zellen werden auf einem formvarbeschichteten Kupfergitter gesammelt. (B) Die Gitter werden abschnittsweise auf Tröpfchen der entsprechenden Lösungen verarbeitet. (C) Die Gitter sind mit primären und fluoreszierenden sekundären Antikörpern markiert. (D) Die Gitter werden zwischen einem Deckglas und einem Objektträger aus 50 % Glycerin angeordnet. (E) Fluoreszenzbilder werden in einem Weitfeldmikroskop aufgenommen. (F) Die Gitter werden aus dem Objektträger entnommen und durch Uranylfärbung für EM weiterverarbeitet. (G) Nach dem Trocknen können die Gitter mittels TEM abgebildet werden. (H) TEM-Bildkacheln mit hoher Vergrößerung werden aus einem Bereich aufgenommen, der aus Fluoreszenzdaten ausgewählt wurde. (I) Bilder aus Fluoreszenzmikroskopie und EM werden korreliert und überlagert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Abbildung 2: CLEM von LC3 und LAMP1 in ausgehungerten HEPG2-Zellen. HEPG2-Zellen wurden vor der Fixierung mit 4% PFA für 2 h in EBSS für 2 h ausgehungert. (A) IF-Bildgebung von LC3 (grün) und LAMP1 (rot) auf Schnitten zeigt relativ wenige LC3-Punkte und eine geringe Kolokalisation mit LAMP1. (B) Verknüpfung der molekularen Informationen von IF (linkes Bild) mit den ultrastrukturellen Informationen, die in EM (mittleres Bild) erhalten wurden, durch Überlagerung der beiden Bildgebungsmodalitäten basierend auf DAPI und Kernkonturen (gestrichelte Linien, rechtes Bild). Die Ultrastruktur der einzelnen LC3-markierten Kompartimente, wie sie in Kasten 1 (rechtes Bild) dargestellt ist, ist in C dargestellt. (C) Ultrastruktur von LC3-positiven Kompartimenten. CLEM-Bilder sind auf der linken Seite und pseudofarbige (beigefarbene) EM-Bilder auf der rechten Seite zu sehen (ungefärbte EM-Bilder sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt). Innere und äußere autophagosomale Membranen sind durch weiße bzw. schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet. Der autophagische Gehalt innerhalb des Autolysosoms in Beispiel 6 wird durch * angegeben. Maßstabsbalken = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Ungefärbte EM-Bilder von LC3-positiven Organellen. (A-F) Ungefärbte EM-Bilder der pseudofarbigen Beispiele 1-6, die in Abbildung 2C gezeigt sind. Die Organellen wurden durch LC3-Fluoreszenz ausgewählt, wie in Abbildung 2 beschrieben. Innere und äußere autophagosomale Membranen sind durch weiße bzw. schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet. Der autophagische Gehalt innerhalb des Autolysosoms in Beispiel 6 wird durch * angegeben. Maßstabsbalken = 200 nm. Abkürzungen: AL = Autolysosom; AP = Autophagosom; M = Mitochondrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: In dieser Studie verwendete Puffer und Lösungen. Diese ergänzende Datei enthält die Rezepte und Protokolle, die zur Herstellung der in dieser Studie verwendeten Puffer und Lösungen erforderlich sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Die Lokalisierung von Proteinen im Kontext der Zellultrastruktur ist seit Jahrzehnten ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug. Mit diesem Protokoll haben wir die Proteine erweitert, die in geringer Häufigkeit vorhanden oder schwer zu finden sind. Wir verwenden die Fluoreszenzmikroskopie, um Proteine empfindlich und screenbar zu markieren, und kombinieren sie mit der Elektronenmikroskopie, um die Ultrastruktur der Zelle wieder aufzufüllen.Hier werden wir CLEM auf Autophagie-Proteinen demonstrieren, aber es kann wirklich auf jede biologische Fragestellung angewendet werden, bei der die Ultrastruktur der Zelle von Interesse ist, insbesondere bei der Untersuchung seltener Ereignisse. Tineke Veenendaal, eine leitende Forschungstechnikerin aus unserem Labor, wird mir das Verfahren vorführen. Ersetzen Sie zunächst das PBS mit 0,15 % Glycin durch 1 % Gelatine in PBS, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist.Die Zellen werden abgeschabt und in Gelatine in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pelletieren Sie die Zellen bei 6.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie dann die Gelatine, ohne das Pellet zu stören. Dem Pellet wird 12%ige auf 37 Grad Celsius erwärmte Gelatine zugegeben und durch Pipettieren mit Pipettenspitzen oder auf die gleiche Temperatur vorgewärmten Weidepipetten vorsichtig resuspendiert.10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann eine Minute lang bei 6.000 g pelletieren. Die Gelatine 30 Minuten auf Eis erstarren. Um die in Gelatine eingebetteten Zellen aus dem Röhrchen zu entfernen, schneiden Sie das Röhrchenende, das das Pellet enthält, mit einer Rasierklinge vom Rest des Röhrchens ab.Schneiden Sie dann das Röhrchenende mit dem Zellpellet senkrecht zum ersten Schnitt in zwei Hälften. Die beiden Rohrendenhälften mit dem Zellpellet in 2,3 molare Saccharose legen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Dadurch schrumpfen die Zellpellethälften leicht und lösen sich aus dem Kunststoffschlauch.Entfernen Sie die Tubenhälften mit dem in Gelatine eingebetteten Zellpellet aus der Saccharose und entfernen Sie dann die Zellpellethälften mit einer Pinzette aus den Kunststoffröhrchenhälften. Schneiden Sie das Pellet manuell mit einer Rasierklinge in Blöcke geeigneter Größe und verwenden Sie ein Stereo-Präpariermikroskop, um das Motiv während des Schneidens zu vergrößern. Inkubieren Sie die Zellblöcke über Nacht in 2,3 molar Saccharose bei vier Grad Celsius.Legen Sie sie auf einen Probenhalterstift aus Aluminium. Lassen Sie so viel Saccharose um die Ränder des Blocks, dass sie einen dünnen Kragen zwischen dem Block und der Nadel bildet. Einfrieren und in flüssigem Stickstoff aufbewahren.Schneiden Sie die Vorderseite des Blocks ab, um seine Oberfläche abzuflachen, um etwa 250 Nanometer dicke Abschnitte zu erhalten. Schneiden Sie dann die Seiten des Blocks ab, indem Sie 50 bis 100 Mikrometer in die Seite der Probenblockfläche mit der Messerecke schneiden. Durch das Trimmen von vier Seiten der Probenblockfläche entsteht ein etwa 250 x 375 Mikrometer großes Rechteck.Schneiden Sie ein Band aus dem hervorstehenden Rechteck und stellen Sie sicher, dass die Abschnitte zwischen 70 und 90 Nanometer dick sind und einen silbrig-goldenen Glanz haben. Führen Sie die Abschnitte mit einem Haar an einem Stock von der Schneide des Diamantmessers weg, um ein langes Band zu bilden. Nehmen Sie das Farbband auf, indem Sie die drei Millimeter lange Tonabnehmerschlaufe in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 2,3 molar Saccharose und 2 % Methylcellulose tauchen.Führen Sie die Schlaufe in die Kältekammer des Mikrotoms ein, und sobald das Tröpfchen zu gefrieren beginnt, nehmen Sie die Abschnitte sofort auf, indem Sie das Tröpfchen vorsichtig dagegen drücken. Entfernen Sie die Schlaufe aus der Kältekammer. Warten Sie, bis der Tropfen vollständig aufgetaut ist, und drücken Sie den Tropfen auf ein vorbereitetes Gitter.Legen Sie die Gitter mit Abschnitten auf etwa einen Milliliter PBS in eine kleine Schale oder eine Multi-Well-Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verarbeiten Sie die Gitter auf rund 75 Mikroliter Tröpfchen auf Parafilm und beginnen Sie mit PBS-Glycin-Waschungen bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Gitter mit einem Blockierungspuffer aus 0,1 % Rinderserumalbumin C und 0,5 % Fischhautgelatine in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur als Blockierungsschritt.Verdünnen Sie Primärantikörper in Blockierungspuffer in PBS und inkubieren Sie die Gitter auf etwa 10 Mikrolitertröpfchen dieser Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gitter fünfmal bei Raumtemperatur in 0,1%igem Rinderserumalbumin in PBS. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper und DAPI im Blockierungspuffer in PBS.Inkubieren Sie dann die Gitter auf etwa 10 Mikrolitertröpfchen dieser Lösung für 30 Minuten oder länger bei Raumtemperatur, bevor Sie die Gitter fünfmal in PBS waschen, wie zuvor gezeigt. Um die Proben für die Lichtmikroskopie zu montieren, tauchen Sie die Gitter zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur in 50%iges Glycerin in destilliertes Wasser. Platzieren Sie ein Gitter pro Deckglas zwischen einem Objektträger und einem Deckglas aus 50%igem Glycerin und achten Sie darauf, dass die Abschnitte zum Deckglas zeigen.Für die Lichtmikroskopie nehmen Sie einen Objektträger mit den Sandwichgittern zu einem Weitfeldmikroskop mit einem automatisierten Tisch. Wählen Sie ein Ölobjektiv mit hoher Vergrößerung aus, und erstellen Sie einen Bildkachelsatz des Menübands der Abschnitte. Als Nächstes geben Sie für die Demontage und Elektronenmikroskopie oder EM-Kontrastierung 10 Mikroliter destilliertes Wasser an die Seite des Glasobjektträger-Deckglas-Sandwiches und warten Sie, bis die Kapillarwirkung die Glasdeckglas-Sandwich-Schnittstelle gefüllt hat.Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, ohne Immersionsöl in das Glycerin zu mischen. Holen Sie die Gitter mit einer Pinzette heraus und tauchen Sie sie dreimal bei Raumtemperatur in destilliertes Wasser, um das 50%ige Glycerin abzuwaschen. Trocknen Sie die Rückseite des Gitters vorsichtig mit einem fusselfreien Seidenpapier ab und legen Sie das Gitter mit der Teilseite nach unten auf destillierte Wassertropfen.Um die Schnitte für den Kontrast in der Elektronenmikroskopie zu färben, inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Uranylacetat. Kühlen Sie die Uranylacetat-Methylcelluloselösung ab, indem Sie die Tröpfchen auf Parafilm auf eine Metallplatte auf Eis legen. Waschen Sie dann die Gitter zweimal mit dieser eiskalten Lösung und inkubieren Sie sie 10 Minuten in der Lösung.Schlaufe die Gitter aus, indem du eine Gittertrocknungsschleife in das Uranylacetat-Methylcellulose-Tröpfchen unter jedem Gitter einführst und vorsichtig anhebst, bis das Gitter vom Tropfen abgezogen wird. Um die überschüssige Lösung abzutupfen, berühren Sie die Schlaufe in einem Winkel von etwa 60 Grad auf das fusselfreie Filterpapier und ziehen Sie sie langsam über das Papier, bis keine Lösung mehr absorbiert wird. Legen Sie die Schlaufe mit dem Gitter in ein geeignetes Gestell und lassen Sie sie bei Raumtemperatur länger als 10 Minuten trocknen.Verwenden Sie die durch die Lichtmikroskopie erhaltene Übersicht, um einen Bereich von Interesse für die Bildgebung im Transmissionselektronenmikroskop oder TEM zu lokalisieren, und kommentieren Sie den ROI im Lichtmikroskopie-Datensatz. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, erhalten Sie eine Bildkachel mit 20.000- bis 50.000-facher Vergrößerung im TEM. Rekonstruieren Sie den Bildkachelsatz in der Nachbearbeitungssoftware.Führen Sie die Korrelation basierend auf DAPI-Signalen und Fluoreszenz- und Kernkonturen in der Elektronenmikroskopie durch. Verschieben Sie die Bilder, um sie präzise zu überlagern und die manuelle Korrelation genau durchzuführen. Hepatoblastom-abgeleitete HEPG2-Zellen wurden zwei Stunden lang in EBSS ausgehungert, bevor sie zwei Stunden lang mit 4%Paraldehyd fixiert wurden.Die IF-Bildgebung von LC3 und LAMP1 auf Schnitten zeigt relativ wenige LC3-Punkte und eine geringe Kolokalisation mit LAMP1. Molekulare Informationen von IF wurden mit den ultrastrukturellen Informationen verknüpft, die in der Elektronenmikroskopie gewonnen wurden, indem die beiden Bildgebungsmodalitäten auf der Grundlage von DAPI und Kernkonturen überlagert wurden. Die Korrelation der LC3-positiven Organellen mit der EM-Ultrastruktur zeigte, dass die verschiedenen Puncta unterschiedliche Stadien der Autophagie repräsentierten.Die Ultrastruktur der einzelnen LC3-beschrifteten Kompartimente, wie sie in Kasten eins veranschaulicht wird, ist hier dargestellt. Die korrelativen lichtelektronenmikroskopischen Bilder sind auf der linken Seite und die pseudofarbigen Elektronenmikroskopiebilder auf der rechten Seite zu sehen. Innere und äußere autophagosomale Membranen sind durch weiße und schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet.Interessanterweise identifizierte EM relativ schwache fluoreszierende Flecken als LC3-positive Autolysosomen, die sich durch dichten Inhalt und intraluminale Vesikel auszeichnen. Dies zeigt eine minimale LC3-Sichtbarkeit in IF von ultradünnen Kryoschnitten, was darauf hindeutet, dass LC3 trotz der abbauenden Umgebung in stationären Autolysosomen nachweisbar ist. LC3-positive Punkte repräsentieren jedoch hauptsächlich Autophagosomen, während nur wenige Autolysosomen repräsentieren.Für Forscher, die eine Immunogold-Markierung anstelle von On-Section-CLEM durchführen möchten, sind die hier beschriebenen Protokolle und Tipps auch für die Immunogold-Markierung uneingeschränkt anwendbar. Wir haben CLEM zunächst auf endosomale regulatorische Proteine mit geringer Häufigkeit angewendet und zum ersten Mal ihre endogene ultrastrukturelle Lokalisation gezeigt.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization Mit Photo-aktivierten Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Forschung

Biologie

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Korrelat konfokale und 3D-Elektronenmikroskopie eines spezifischen Sinneszelle

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisierung der subzellulären Lokalisation eines Proteins im Herzen mittels Quantenpunkt-vermittelter Immunmarkierung gefolgt von Transmissionselektronenmikroskopie