Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

אנו מודים לעמיתינו במרכז לרפואה מולקולרית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט על דיונים ומשוב פוריים. אנו מודים לעמיתי מעבדת קלומפרמן בעבר ובהווה על ביצוע שיפורים מתמשכים בטכנולוגיות המיקרוסקופיה שלנו. תשתית EM המשמשת לעבודה זו היא חלק מתוכנית המחקר מפת הדרכים הלאומית לתשתיות מחקר בקנה מידה גדול (NEMI) הממומנת על ידי מועצת המחקר ההולנדית (NWO), פרויקט מספר 184.034.014 ל- JK.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

השיטה המוצגת כאן מנצלת את ההתקדמות האחרונה ב- CLEM מבוסס קריוזקציה - הרגישות הגבוהה של תיוג IF ומתאם מדויק (שגיאה של <100 ננומטר) בין FM ו- EM14,24. התוצאה היא שיטה עם רגישות לסימון פלואורסצנטי של חלבונים נדירים ואנדוגניים והיכולת לכסות זאת בדיוק גבוה לאולטרה-מבנה EM. לפיכך, שיטה זו מונעת את הצורך בביטוי (יתר) של חלבונים מתויגים אקסוגנית ושימוש בתוויות EM פחות רגישות. היתכנות השיטה מוצגת על ידי דוגמאות של CLEM על LC3 אנדוגני בתאים מורעבים, ללא שימוש במעכבי ליזוזומליים.
קריוסקציות מופשרות המתקבלות בשיטת טוקויאסו הן דגימות אידיאליות עבור immuno-EM, שכן בניגוד לקטעי שרף, הם חדירים לנוגדנים. בשילוב עם קיבוע קל ופרוצדורות מנוגדות, זה בדרך כלל מניב יעילות תיוג מעולה על פני שיטות אחרות מבלי להתפשר על מבנה העל המפורט, וממחיש בצורה מצוינת את קרומי התאים 12,25,26. יתר על כן, קריוסקציות תואמות מאוד למיקרוסקופ פלואורסצנטי, מה שהופך אותן למצעים יקרי ערך עבור CLEM. הן תיוג אימונוגולד קלאסי והן CLEM על קריוסקציות סיפקו תובנות ראשוניות בהבנת הארגון התת-תאי 14,27,28,29,30.
כיום, יישומים של CLEM על קריוסטים מופשרים הופכים נפוצים יותר, כתוצאה מהתפתחויות מתמשכות ואופטימיזציות 14,20,24,31,32,33,34 ששיפרו את האיכות, הישימות והדיוק של הגישה. כעת, על ידי התאמה מדויקת של אריחי תמונה גדולים של IF ו- EM, הטכניקה מאפשרת סינון עבור אולטרה-מבנה של רכיבים תאיים אנדוגנייםבעלי תווית פלואורסצנטית 14,32,33. זהו יתרון על פני immuno-EM קלאסי, שבו החיפוש אחר מבנים המסומנים בזהב דורש בדרך כלל הגדלה גבוהה ולכן הוא מייגע יותר וגוזל זמן. מסיבה זו לוקליזציה של LC3 לאולטרה-מבנה נהנית מאוד מ-CLEM. אברונים חיוביים ל-LC3 נפוצים כאשר פינוי אוטופגי נחסם (כלומר, כאשר תאים מטופלים ב-BafA1 או בחומרים מעלים pH), בעוד אברונים אוטופגיים מנוקים במהירות בתאים ללא שינוי או מורעבים, וכתוצאה מכך רמות מצב יציב נמוכות מאוד. בתנאים כאלה, מציאת אברונים המסומנים ב- LC3 באמצעות immuno-EM קלאסי יכולה להיות מאתגרת, ו- CLEM מציע יתרון ברור.
בעבר, CLEM על קטעי שרף יושם במחקרים באמצעות ביטוי חוץ רחמי של LC3-GFP או LC3-GFP-RFP טנדםבדיקה 35,36,37,38,39. במחקרים אלה בוצעה הדמיה פלואורסצנטית לפני ההטבעה או ישירות בחתכי שרף אקרילי40, ולאחר מכן הדגימות נבדקו על ידי EM. ישנם מספר יתרונות של הטבעה שרף; מבנה האולטרה האוטופגוזומלי נשמר בדרך כלל היטב, במיוחד אם החומר קפואבלחץ גבוה 40. יתר על כן, הניגודיות של חומר משובץ שרף מוכתם במתכת כבדה היא בדרך כלל בולטת יותר מזו של קריוסקציות מוכתמות באורניל. מקטעים משובצי שרף תואמים לשיטות EM נפחיות, כגון טומוגרפיית מערך, FIB-SEM או SEM חסום טורי, בעוד שהקפאה איננה. בגישות המבצעות הדמיה לפני הטבעה, דימות תאים חיים הוא אפשרות41 שאינה זמינה ב- CLEM בהקפאה. היתרון העיקרי של CLEM בקריוסקציות על פני חלופות אלה הוא אות IF גבוה, המאפשר לוקליזציה חיסונית של חלבונים נדירים ללא צורך בחדירות ממברנה או ביטוי יתר. זה מונע מיצוי ממברנה פוטנציאלית, ביטוי יתר חפצים42 ושינוי גנטי של הנושא, אשר, בשילוב עם האפשרות לתאם שטחים גדולים IF ו EM, עושה את זה כלי מצוין ללמוד LC3 ו אוטופגיה.
כאן, היישום של CLEM בחתך על תאי HEPG2 מורעבים גילה כי LC3 מקומי בעיקר למבנים שזוהו כאוטופגוזומים. בנוסף, נמצאו כמה כתמים פלואורסצנטיים חלשים באוטוליזוזומים. זאת בניגוד ישיר לתאים שטופלו ב-BafA19 ומשקף את הפירוק המהיר של חלבונים אוטופגוזומליים ברגע שהאוטופגוזום מתמזג עם ליזוזומים. בסך הכל, הנתונים הראו כי CLEM של קריוקציות מופשרות יכול לספק תובנות על אוטופגיה בתיווך LC3 בתנאים מקומיים. הנתונים גם מדגישים את הרגישות של הטכנולוגיה, שכן LC3 זוהה אפילו באוטוליזוזומים המכילים רק רמות נמוכות של אפיטופים LC3 שלמים. יישום נוסף של טכניקה זו על ידי הדמיה LC3 במודלים ותנאים שונים ישפר את הבנתנו של אוטופגיה ותהליכים ביולוגיים אחרים בתיווך LC3, כגון פגוציטוזה הקשורה ל- LC3 או הצמדה של ATG8 לממברנות בודדות.
מעבר לאוטופגיה, CLEM בחתך יכול להיות מיושם על אירועים או מבנים נדירים אחרים, כגון חלוקת תאים, זיהום, סוגי תאים נדירים ברקמות, קינטוכורים, ריסונים ראשוניים או אברונים ספציפיים לסוג התא. סינון יעיל לנושא העניין על ידי IF יכול מאוד להקל על המחקר ultrastructural של נדירים אלה. יתר על כן, הוכח14 כי ניתן להשתמש בטכניקה כדי למקם חלבונים באופן רגיש יותר מאשר immuno-EM קלאסי. התאמת אורך הקיבוע יכולה להרחיב עוד יותר רגישות זו, ולאפשר לוקליזציה אולטרה-מבנית של חלבונים בעלי שפע נמוך מאוד או אנטיגניים גרועים. לבסוף, שיטת CLEM מקלה על בחירה מהירה של מספר כמותי של אברונים, ומאפשרת ניתוח חזק יותר של ההתפלגות האולטרה-מבנית של חלבון נתון.
CLEM על cryosections דורש את הציוד ואת המומחיות עבור cryosectioning. בקבוצות עם גישה לכלים אלה (למשל, קריומיקרוטומים), היישום של CLEM על חתך הוא פשוט ודורש רק את הזמינות של מיקרוסקופ שדה רחב אוטומטי, הגדרה שלרוב המעבדות יש גישה אליה. יתר על כן, השיטה זמינה במתקני EM ברחבי העולם. מכיוון ש- CLEM בחתך משלב את היישום של שיטות IF ו- EM מבוססות, השיטה מותאמת בקלות וניתן לשלב אותה עם, למשל, טומוגרפיה 20,33,43, נפח חתך טורי EM של מספר מוגבל של סעיפים 44, או מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר 45. רבגוניות זו של השיטה תומכת ביישומים למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

אוטופגיה היא תהליך מפתח לפינוי ומיחזור של חלבונים ואברונים ציטופלזמיים. תהליך המאקרו-אוטופגיה (להלן אוטופגיה) כרוך בהיווצרות אברונים דו-קרומיים, אוטופגוזומים, המאפשרים לתאים להקיף מולקולות ציטופלזמיות ואברונים לצורך פירוק ליזוזומלי. אוטופגיה מתרחשת ברמה בסיסית ברוב התאים והיא מווסתת בתגובה לתנאים תאיים, כגון רעב או לחץ תאי. אוטופגיה מתרחשת באופן ספציפי למצע, המכוון למבנים או חלבונים ספציפיים לצורך פירוק, או כתהליך תפזורת לא סלקטיבי המקיף חלקים של הציטוזול. באוטופגיה סלקטיבית, אוטופגוזומים נוצרים על ידי צימוד חלבונים ממשפחת Atg8 (חלבונים הקשורים למיקרוטובולים 1A/B שרשרת אור 3A/B/C [LC3] ו-GABARAPs) לממברנות שמקורן באנדוזומים ממוחזרים, גולג'י ו/או רשתית אנדופלסמית (ER)1. LC3 מזהה מטען אוטופגי בציטוזול ישירות או באמצעות מתאמי אוטופגיה סלקטיביים כגון P62/SQSTM. לאחר מכן ניתן להצמיד קרומים אוטופגיים חדשים ל-LC3, להתרחב ולהתיך כדי ליצור קרום כפול שלם התוחם את המטען הנקרא אוטופגוזום. האוטופגוזום מבשיל ובסופו של דבר מתמזג עם אנדוזום או ליזוזום, ולאחר מכן המטען האוטופגי והמתאמים מתפרקים2.
מחקרים על היווצרות, הבשלה ואיחוי אוטופגוזום עושים לעתים קרובות שימוש בטכנולוגיות של מיקרוסקופ אור. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של LC3 משמש בדרך כלל להערכת מספר לוקליזציה תאית של אוטופגוזומים בתנאים שונים. יתר על כן, על ידי צימוד LC3 ל- GFP רגיש ל- pH ו- RFP יציב ל- pH במה שמכונה בדיקת טנדם, ניתן למדוד את השטף הכולל של אוטופגיה בתאים חיים כפונקציה של אובדן פלואורסצנטיות GFP3. גישות אלה הן כלים רבי ערך עבור חוקרים להבין את התפקיד והמנגנון של אוטופגיה בתנאים שונים. כלי רב ערך נוסף הוא מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), אשר חושף את מבנה העל של אברונים אוטופגיים בשלבים שונים של אוטופגיה 4,5,6,7,8. נכון להיום, EM היא עדיין השיטה המועדפת לזהות את השלבים המדויקים של היווצרות אוטופגוזום על ידי הבחנה בין קרומים אוטופגיים שונים לפי מורפולוגיה: פגופור (קרום כפול שאינו סגור במלואו), אוטופגוזום (קרום כפול סגור סביב מטען ציטוסולי), ואוטוליזוזום (אובדן [חלקי] של הממברנה האוטופגית הפנימית). מורפולוגיה ללא מידע מולקולרי, לעומת זאת, עלולה להיות מועדת לזיהוי שגוי או לעמימות. Immuno-EM היא השיטה המקיפה ביותר לאפיון מולקולרי סימולטני וסיווג מורפולוגי של אברונים אוטופגיים. לדוגמה, תיוג אימונוגולד של LC3 על קריוסקציות מופשרות מאפשר לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 וזיהוי מדויק של אברונים מסומנים LC39.
החיסרון של EM הוא שדה הראייה הקטן שמגיע עם ההגדלה הגבוהה הנדרשת כדי לצפות באולטרה-מבנה העדין של ממברנות אוטופגיות, ובמקרה של immuno-EM, לאתר את התווית המסמנת את החלבון המעניין. בשל המחסור שלהם ורמות חלבון נמוכות, זה בדרך כלל מעכב את ניתוח EM כמותי של אוטופגוזומים. כדי להגדיל את מספר האוטופגוזומים, לעתים קרובות מורעבים תאים ומטופלים ב-Bafilomycin A1 (BafA1), מעכב החמצה ליזוזומלית והתפרקות. ללא טיפול BafA1, החיפוש אחר אוטופגוזומים על ידי EM הוא גוזל זמן, בשל המחסור של אברונים אלה. השיטה המוצגת בכתב יד זה מטפלת בבעיה זו באמצעות תיוג פלואורסצנטי והדמיה של LC3 אנדוגני על קריוסקציות מופשרות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני הכנה נוספת ל- EM. התמונות הפלואורסצנטיות מנחות את החיפוש אחר מבנים המסומנים ב-LC3 ב-EM. לאחר האיסוף, תמונות EM מתואמות עם תמונות פלואורסצנטיות כדי להוסיף מידע מולקולרי - נוכחות LC3 - למבנה העל של התא. שיטת 'על חתך CLEM' זו מגדילה מאוד את היכולת למצוא מבנים המסומנים LC3, במיוחד בתנאים לא מטופלים, לזיהוי וסיווג לאחר מכן על ידי EM.
שיטה זו יושמה על תאי HEPG210 שמקורם בהפטובלסטומה מורעבים כדי למצוא אוטופגוזומים בתנאים ללא שינוי (כלומר, לא נעשה שימוש ב- BafA1). נמצאו יחסית מעט פונקטה פלואורסצנטית (פחות מאחד לכל פרופיל תא בחתך של 90 ננומטר), מה שתואם את התחלופה הגבוהה של LC311. דלילות זו של LC3-puncta הדגישה את הערך של CLEM; על ידי בחירת אזורים עם מספר פונקטה פלואורסצנטית להדמיה ב- EM, נמצאו אברונים חיוביים LC3 ואופיינו בצורה הרבה יותר יעילה מאשר באמצעות EM חיסוני קונבנציונאלי. זה גילה שרוב האברונים החיוביים ל-LC3 היו אוטופגוזומים, כפי שהוגדרו על ידי המורפולוגיה שלהם, בניגוד לתוצאות שהתקבלו בתאים שטופלו ב-BafA1, שם אוטוליזוזומים נפוצים יותר9. נתונים אלה מראים כי עם CLEM על חתך, אוטופגיה ניתן לחקור ברמה ultrastructural ללא צורך לעכב זרימה אוטופגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

הדמיה של אברונים אוטופגיים ברמה האולטרה-מבנית על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) חיונית כדי לקבוע את זהותם ולחשוף פרטים החשובים להבנת התהליך האוטופגי. עם זאת, שיטות EM חסרות לעתים קרובות מידע מולקולרי, מה שחוסם את המתאם של מידע אולטרה-מבני המתקבל על ידי EM ללוקליזציה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של חלבוני אוטופגיה ספציפיים. יתר על כן, הנדירות של אוטופגוזומים בתנאים תאיים שלא השתנו מעכבת את חקירת הקרינה האלקטרומגנטית, הדורשת הגדלה גבוהה, ולכן מספקת שדה ראייה מוגבל.
בתשובה לשני האתגרים, יושמה שיטת מיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי (CLEM) המבוססת על תיוג פלואורסצנטי כדי להתאים סמן אוטופגוזומלי נפוץ, LC3, לאולטרה-מבנה EM. השיטה שימשה לסינון מהיר של תאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי לתיוג LC3 בשילוב עם סמנים רלוונטיים אחרים. לאחר מכן, התכונות האולטרה-סטרוקטורליות הבסיסיות של כתמים נבחרים המסומנים בתווית LC3 זוהו על ידי CLEM. השיטה יושמה על תאים מורעבים מבלי להוסיף מעכבי החמצה ליזוזומלית.
בתנאים אלה, LC3 נמצא בעיקר על אוטופגוזומים ולעתים רחוקות באוטוליזוזומים, שבהם LC3 מתפרק במהירות. נתונים אלה מראים הן את ההיתכנות והן את הרגישות של גישה זו, ומוכיחים כי CLEM יכול לשמש כדי לספק תובנות אולטרה-מבניות על אוטופגיה בתיווך LC3 בתנאים מקומיים - ללא טיפולים תרופתיים או שינויים גנטיים. בסך הכל, שיטה זו מציגה כלי רב ערך למחקרי לוקליזציה אולטרה-סטרוקטורליים של חלבוני אוטופגיה ואנטיגנים נדירים אחרים על ידי גישור מיקרוסקופ אור לנתוני EM.

פרוטוקול immuno-EM אופטימלי לסימון אימונו-זהב של LC3 על קריוסקציות אולטרה-דקות פורסם לאחרונה על ידי De Maziere et al.9. מחקר זה כלל תנאי רעב ללא BafA1, בהם LC3 היה נוכח אך נדיר יחסית וקשה למצוא אותו על ידי EM. שיטת CLEM הוצגה במחקר נפרד, המשתמשת ברגישות של תיוג פלואורסצנטי כדי לדמיין חלבונים אנדוגניים נדירים יחסית ובעלי ביטוי נמוך ולקשר זאת לאולטרה-מבנהEM 14. כאן, שתי גישות אלה משולבות על ידי השימוש בפרוטוקול התוויה LC3 הממוטב כחלק מגישה LEM.
תאי HEPG2, תאים שמקורם בכבד עם רמות גבוהות יחסית של אוטופגיה בסיסית22, הורעבו בתווך מינימלי (תמיסת המלח המאוזנת של ארל [EBSS]) במשך שעתיים לפני הקיבוע ב-4% PFA. לאחר מכן נעשתה הכנת דגימה בשיטת טוקויאסו של קריוסקציה אולטרה-דקה (סעיפים 1-3; ראו חריץ וגוזה12), התואמת מאוד ל-CLEM 14,23 בחתך. קריוסקציות מופשרות סומנו באופן פלואורסצנטי (פרוטוקול סעיף 4 ואיור 1) באמצעות נוגדן ראשוני9 נגד LC3 של עכבר. בנוסף, ארנב נגד LAMP1 שימש כדי לציין אנדו-ליזוזומים, ואחריו נוגדנים משניים נגד עכבר AlexaFluor488 ונוגדנים משניים נגד ארנב AlexaFluor568. הרשתות נדחקו בין שקופית כיסוי למגלשת זכוכית וצולמו ב-RT במיקרוסקופ רחב שדה (100x 1.47 NA oil objective, מצלמת sCMOS).
יתרון של תיוג פלואורסצנטי של מקטעים דקים על פני IF קונבנציונלי של תא שלם הוא הרזולוציה המוגברת ב-Z, שכן העובי הפיזי של הקטע הוא 60-90 ננומטר. עם רזולוציית Z משופרת זו, התיוג הפלואורסצנטי של LC3 ו-LAMP1 על מקטעים דקים חושף מעט מאוד קולוקליזציה (איור 2A). בתאים המטופלים במעכבי ליזוזומליים, כגון BafA1, מתרחשת קולוקליזציה גבוהה, שכן LC3 סגור ליזוזומלי נשאר ללא פירוק9. בתאים שאינם מטופלים, LC3 מתפרק במהירות במגע עם ליזוזומים פעילים אנזימטית, חיוביים ל-LAMP1, ולכן קו-לוקליזציה נדירה בתנאים אלה. באופן כללי, פחות מניקוב LC3 אחד לכל פרופיל תא נצפתה. זה מצביע על כך שגם בתנאי רעב, התחלופה של אוטופגוזומים היא מהירה, מה ששומר על מספרים אוטופגוזומים נמוכים. זה גם מדגיש את החשיבות של השימוש ב- CLEM כדי למצוא את המבנים הנדירים המסומנים בתווית LC3, באמצעות שדה הראייה הגדול המסופק על ידי מיקרוסקופ אור. יתר על כן, הרגישות הגבוהה יותר של תיוג פלואורסצנטי בהשוואה לתיוג זהב מאפשרת זיהוי של יותר אברונים חיוביים LC3 מאשר במערכת החיסון הקונבנציונלית, מה שמסייע עוד יותר לאפיונם.
לאחר רכישת ערכת אריחים מלאה של רצועת המקטעים, הרשתות נלקחו מהמיקרוסקופ והוכתמו לאחר מכן עבור EM באמצעות UA ושיטת הלולאה החוצה (שלבי פרוטוקול 4.4-4.6; איור 1F,G). שיטת 'לולאה החוצה' זו מבטיחה ששכבה דקה של UA:methylcellulose תישאר על הרשת, מה שיוצר את הניגודיות הרצויה ב- EM. עובי השכבה תלוי במהירות ובזווית שבה UA:methylcellulose הוא נמחק על נייר המסנן. גרירת הלולאה מהר מדי יכולה להשאיר יותר מדי UA:methylcellulose על הרשת ולהכהות את המראה של החלקים ב- EM. גרירה איטית מדי עלולה למשוך יותר מדי UA:methylcellulose משם, וכתוצאה מכך מעט מדי כתמים ומורפולוגיה ירודה, ומסתכן בנפילת הרשת מהלולאה. צביעה 'חלקלקת שמן' (איור 1G) על רשתות יבשות מצביעה על עובי שכבת UA:methylcellulose מתאים.
לאחר לולאה וייבוש, הרשתות צולמו ב-TEM בהחזר השקעה שנבחר על ידי פלואורסצנטיות. מערכי הנתונים IF ו- EM היו מתואמים על ידי כיסוי אות DAPI לקווי המתאר של גרעינים הנראים ב- EM, ויצרו תמונה משולבת המכילה מידע משני האופנים.
מציאת אותו אזור ב- EM כפי שנבחר ב- IF יכולה להיות מאתגרת. לכן מומלץ לשמור תמונת סקירה כללית של ערכת האריחים IF בהישג יד בעת חיפוש ב- EM. משתמשים צריכים לחפש תכונות הניתנות לזיהוי בשני האופנים, כגון קפלים או קרעים במקטעים, פסי רשת או סידור גרעינים. חשוב גם לזכור כי הדגימה יכולה להיראות מסובבת ומשוקפת ב- EM. ניתן להשתמש ב'רשתות איתור' עם תכונות ספציפיות לזיהוי אזורים כדי להקל על המתאם (ראה טבלת חומרים).
הקורלציה בין אברונים חיוביים LC3 לאולטרה-מבנה EM גילתה שהפונקטה השונים ייצגו שלבים נפרדים של אוטופגיה (איור 2B). אף על פי שהשימור של אולטרה-מבנה אוטופגוזומלי מאתגר בהקפאה, אברונים עם תוכן ציטופלזמי וקרומים כפולים נצפו לעתים קרובות (איור 2C, חצים באברונים 1-5; איור משלים S1), המגדירים תכונות מורפולוגיות של אוטופגוזומים. באופן מעניין, כתמים פלואורסצנטיים חלשים למדי זוהו על-ידי EM כאוטוליזוזומים חיוביים ל-LC3 (איור 2C, אברון 6; התוכן האוטופגי מסומן*), המאופיינים בתכולה צפופה ובשלפוחיות תוך לומינליות. זה הראה כי כמויות קטנות מאוד של LC3 נראות ב- IF של קריוזקציות דקות במיוחד, והצביע על כך שלמרות הסביבה המתכלה, חלק מ- LC3 ניתן לזיהוי באוטוליזוזומים במצב יציב. עם זאת, רוב הפונקטים החיוביים ל-LC3 ייצגו אוטופגוזומים, בעוד שאוטוליזוזומים היו נדירים מאוד. זאת בניגוד לתאים שטופלו ב-BafA1, שצוברים בעיקר אוטוליזוזומים ולא אוטופגוזומים9.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטת CLEM חתך לקישור מידע מולקולרי המתקבל במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאולטרה-מבנה של EM. שיטה זו מגבירה את הרגישות של immuno-EM, שכן רק fluorophores משמשים תיוג אלה בדרך כלל להניב יותר אות מאשר בדיקות EM. השיטה מתאימה במיוחד לשימוש בקריוסקציות דקות במיוחד, בהן ניתן לקבל רמות גבוהות של פלואורסצנטיות ספציפית על פני צביעת רקע זניחה. על ידי שימוש בפלואורסצנטיות כדי לסנן מבנים או אירועים נדירים ומתאם החזר השקעה נבחר ל- EM, זמן הפעולה של EM והעלויות הנלוות יכולים להיות מופחתים במידה ניכרת. הרגישות וההיתכנות של השיטה מודגמות על ידי הדמיה של LC3 בתאים לא מטופלים ומורעבים, מה שמראה כי LC3 מתקשר בעיקר לאוטופגוזומים בתנאים אלה, עם רמות נמוכות מאוד הנראות באוטוליזוזומים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של CLEM בחתך . (A) קריוקטעים מתאים משובצי ג'לטין נאספים ברשת נחושת מצופה טופסבר. (B) רשתות מעובדות על טיפות של הפתרונות המתאימים. (C) רשתות מסומנות בנוגדנים ראשוניים ומשניים פלואורסצנטיים. (D) הרשתות דחוקות בין החלקה למגלשת זכוכית ב-50% גליצרול. (E) תמונות פלואורסצנטיות נאספות במיקרוסקופ שדה רחב. (F) רשתות מאוחזרות משקופית הזכוכית ומעובדות עוד יותר על ידי צביעת אורניל עבור EM. (G) לאחר הייבוש, ניתן לצלם את הרשתות על ידי TEM. (H) ערכת אריחי תמונה TEM בהגדלה גבוהה מתקבלת מאזור שנבחר מנתוני פלואורסצנטיות. (I) תמונות ממיקרוסקופ פלואורסצנטי ומקרינה אלקטרומגנטית מתואמות ומונחות בשכבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> איור 2: CLEM של LC3 ו-LAMP1 בתאי HEPG2 מורעבים. תאי HEPG2 הורעבו במשך שעתיים ב- EBSS לפני הקיבוע עם 4% PFA למשך שעתיים. (A) הדמיה של LC3 (ירוק) ו- LAMP1 (אדום) על מקטעים מגלה יחסית מעט LC3 puncta ומעט לוקליזציה עם LAMP1. (B) קישור מידע מולקולרי מ-IF (פאנל שמאלי) למידע העל-מבני המתקבל ב-EM (פאנל אמצעי) על-ידי כיסוי שני אופני הדימות המבוססים על DAPI וקווי מתאר גרעיניים (קווים מקווקוים, פאנל ימני). מבנה העל של התאים הבודדים המסומנים בתווית LC3, כפי שמודגם בתיבה 1 (לוח ימני), מוצג ב- C. (C) מבנה אולטרה של תאים חיוביים LC3. תמונות CLEM מוצגות משמאל ותמונות EM פסאודו-צבעוניות (בז') מימין (תמונות EM לא צבעוניות מוצגות באיור משלים S1). קרומים אוטופגוזומליים פנימיים וחיצוניים מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים, בהתאמה. התוכן האוטופגי בתוך האוטוליזוזום בדוגמה 6 מצוין על ידי *. מוטות קנה מידה = 10 מיקרומטר (A), 1 מיקרומטר (B), 200 ננומטר (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: תמונות EM לא צבעוניות של אברונים חיוביים ל-LC3. (א-ו) תמונות EM לא צבעוניות של דוגמאות פסאודו-צבעוניות 1-6 מוצגות באיור 2C. האברונים נבחרו על-ידי פלואורסצנטיות LC3, כפי שמתואר באיור 2. קרומים אוטופגוזומליים פנימיים וחיצוניים מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים, בהתאמה. התוכן האוטופגי בתוך האוטוליזוזום בדוגמה 6 מצוין על ידי *. פסי קנה מידה = 200 ננומטר. קיצורים: AL = autolysosome; AP = אוטופגוזום; M = מיטוכונדריה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: מאגרים ופתרונות ששימשו במחקר זה. קובץ משלים זה מכיל את המתכונים והפרוטוקולים הדרושים ליצירת המאגרים והפתרונות המשמשים במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

לוקליזציה של חלבונים בהקשר של מבנה העל של התא הייתה כלי מחקר רב עוצמה במשך עשרות שנים. בעזרת פרוטוקול זה הרחבנו את החלבונים שהם דלי שפע או קשים לאיתור. אנו משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסמן חלבונים באופן רגיש וניתן לסינון ומשלבים אותו עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי למלא מחדש את מבנה העל של התא.כאן נדגים בפרק CLEM על חלבוני אוטופגיה, אבל זה באמת יכול להיות מיושם על כל שאלה ביולוגית שבה מבנה העל של התא הוא מעניין, במיוחד בחקר אירועים נדירים. מי שתדגים איתי את ההליך תהיה טינקה ויננדאל, טכנאית מחקר בכירה מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, להחליף את PBS המכיל 0.15% גליצין עם 1% ג'לטין PBS שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.מגרדים ומעבירים את התאים בג'לטין לצינור מיקרוצנטריפוגה. גלולה התאים ב 6, 000 גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר מיקרוצנטריפוגה ולאחר מכן להסיר את הג'לטין מבלי להפריע את הכדור. מוסיפים לגלולה 12% ג'לטין שחומם ל-37 מעלות צלזיוס ומשהים מחדש בעדינות על ידי פיפטה עם קצוות פיפטה או פיפטות מרעה מזכוכית שחוממו מראש לאותה טמפרטורה.לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן pellet את התאים ב 6, 000 גרם במשך דקה אחת. ממצקים את הג'לטין על קרח למשך 30 דקות. כדי להסיר את התאים המשובצים בג'לטין מהצינור, חתכו את קצה הצינור המכיל את הגלולה משאר הצינור בעזרת סכין גילוח.לאחר מכן חותכים את קצה הצינור עם גלולת התא בניצב למחצה לחתך הראשון. מניחים את שני חצאי קצה הצינור המכילים את גלולת התא בסוכרוז טוחנת 2.3 ודגרים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. זה גורם לחצאי כדורי התא להתכווץ מעט ולהתנתק מצינור הפלסטיק.הסר את חצאי הצינור עם גלולת התא המשובצת בג'לטין מהסוכרוז, ולאחר מכן הסר את חצאי גלולות התא מחצאי צינור הפלסטיק בפינצטה. חתכו ידנית את הגלולה לגושים בגודל מתאים עם סכין גילוח, והשתמשו במיקרוסקופ מנתח סטריאו כדי להגדיל את הנושא במהלך החיתוך. דוגרים על גושי התא למשך הלילה בסוכרוז מולארי 2.3 בארבע מעלות צלזיוס.הניחו אותם על סיכת מחזיק דגימת אלומיניום. השאירו מספיק סוכרוז סביב שולי הבלוק כך שהוא יוצר צווארון דק בין הבלוק לסיכה. הצמד להקפיא ולאחסן אותו בחנקן נוזלי.חתוך את חזית הבלוק כדי לשטח את פני השטח שלו לקבלת חלקים בעובי של כ -250 ננומטר. לאחר מכן חותכים את צידי הבלוק על ידי חתך 50 עד 100 מיקרומטר לצד פני גוש הדגימה עם פינת הסכין. חיתוך ארבעה צדדים של פני גוש הדגימה ייצור מלבן בולט סביב 250 על 375 מיקרומטר.חתך סרט מהמלבן הבולט המבטיח שהקטעים יהיו בעובי של בין 70 ל -90 ננומטר ובעלי ברק זהוב כסוף. הרחיקו את החלקים מקצה סכין היהלומים בעזרת שערה על מקל ליצירת סרט ארוך. הרימו את הסרט על ידי טבילת לולאת האיסוף של שלושה מילימטרים בתערובת של אחד לאחד של 2.3 סוכרוז מולארי ו-2% מתילצלולוז.הכנס את הלולאה לתוך תא ההקפאה של המיקרוטום, וברגע שהטיפה מתחילה לקפוא, הרימו מיד את החלקים על ידי לחיצה עדינה על הטיפה נגדם. הסר את הלולאה מתא ההקפאה. המתן עד שהטיפה הפשירה לחלוטין ולחץ על הטיפה על רשת מוכנה.מניחים את הרשתות עם מקטעים על כמיליליטר אחד של PBS בצלחת קטנה או צלחת מרובת בארות ודגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מעבדים את הרשתות על כ-75 מיקרוליטר טיפות על פרפילם ומתחילים עם שטיפות גליצין PBS בטמפרטורת החדר. יש לדגור על הרשתות עם חיץ חוסם העשוי מאלבומין C בסרום בקר 0.1% וג'לטין עור דגים 0.5% ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כשלב החסימה.לדלל נוגדנים ראשוניים בחיץ חוסם ב- PBS ולדגור על הרשתות על כ -10 טיפות מיקרוליטר של תמיסה זו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הרשתות באלבומין בסרום בקר 0.1% ב-PBS חמש פעמים בטמפרטורת החדר. לדלל את הנוגדנים המשניים ואת DAPI במאגר החוסם ב- PBS.לאחר מכן יש לדגור על הרשתות על כ-10 טיפות מיקרוליטר של תמיסה זו למשך 30 דקות או יותר בטמפרטורת החדר לפני ששוטפים את הרשתות ב-PBS חמש פעמים כפי שהוצג קודם לכן. כדי להרכיב את הדגימות למיקרוסקופ אור, השקיעו את הרשתות ב-50% גליצרול במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו רשת אחת לכל החלקת כיסוי בין מגלשת זכוכית להחלקת כיסוי בגליצרול של 50%, וודאו שהחלקים פונים לחלקת הכיסוי.למיקרוסקופ אור, קחו שקופית זכוכית עם הרשתות הדחוקות למיקרוסקופ שדה רחב עם שלב אוטומטי. בחר מטרת שמן בהגדלה גבוהה וצור ערכת אריחים של רצועת הכלים של המקטעים. לאחר מכן, לפירוק ומיקרוסקופ אלקטרונים או ניגודיות EM, הוסף 10 מיקרוליטר מים מזוקקים לצד כריך ההחלקה של כיסוי מגלשת הזכוכית, והמתן לפעולה נימית כדי למלא את ממשק כריך החלקה של כיסוי זכוכית.יש להסיר בזהירות את חלקת הכיסוי מבלי לערבב שמן טבילה עם הגליצרול. שלפו את הרשתות בפינצטה והטבילו אותן במים מזוקקים שלוש פעמים בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את הגליצרול 50%. יבשו בזהירות את גב הרשת עם נייר טישו נטול סיבים והניחו את מקטע הרשת בצד על טיפות מים מזוקקות.כדי להכתים את החלקים לניגוד במיקרוסקופ אלקטרונים, לדגור אותם עם אורניל אצטט במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מצננים את תמיסת האורניל אצטט מתילצלולוז על ידי הנחת הטיפות על פרפילם על צלחת מתכת על קרח. לאחר מכן לשטוף את הרשתות עם פתרון קר כקרח זה פעמיים לדגור אותם בתמיסה במשך 10 דקות.לולאת החוצה את הרשתות על ידי הכנסת לולאת ייבוש רשת לתוך טיפת אורניל אצטט מתילצלולוז מתחת לכל רשת והרים אותה בעדינות עד שהרשת נשלפת מהטיפה. כדי להכתים את התמיסה העודפת, גע בלולאה בזווית של כ-60 מעלות על נייר הסינון ללא סיבים וגרור אותה באיטיות לאורך הנייר עד שלא תיספג תמיסה נוספת. הניחו את הלולאה עם הרשת במדף מתאים, והניחו לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך יותר מ-10 דקות.השתמש בסקירה המתקבלת במיקרוסקופ אור כדי לאתר אזור עניין להדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים שידור או TEM, וציין את החזר ההשקעה על מערך הנתונים של מיקרוסקופ האור. לאחר בחירת אזור, קבל אריח תמונה שנקבע בהגדלה של 20, 000x עד 50, 000x ב- TEM. בנה מחדש את ערכת אריח התמונה בתוכנה שלאחר עיבוד.בצע את המתאם בהתבסס על אות DAPI וקווי מתאר פלואורסצנטיים וגרעיניים במיקרוסקופ אלקטרונים. הזיזו את התמונות כדי לכסות אותן במדויק ובצעו את ההתאמה הידנית במדויק. תאי HEPG2 שמקורם בהפטובלסטומה הורעבו במשך שעתיים ב- EBSS לפני הקיבוע עם 4% פראלדהיד למשך שעתיים.הדמיית IF של LC3 ו-LAMP1 במקטעים חושפת יחסית מעט LC3 puncta ומעט לוקליזציה עם LAMP1. מידע מולקולרי מ-IF קושר למידע אולטרה-מבני שהתקבל במיקרוסקופ אלקטרונים על ידי כיסוי שני אופני הדימות המבוססים על DAPI וקווי מתאר גרעיניים. המתאם בין אברונים חיוביים LC3 לאולטרה-מבנה EM גילה כי הפונקטה השונים מייצגים שלבים נפרדים של אוטופגיה.מבנה העל של התאים המסומנים ב-LC3 כפי שמודגם בתיבה הראשונה מוצג כאן. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים אור מתאמי מוצגות משמאל, ותמונות מיקרוסקופ אלקטרונים צבעוני מדומה מוצגות מימין. קרומים אוטופגוזומליים פנימיים וחיצוניים מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים ושחורים.באופן מעניין, EM זיהה כתמים פלואורסצנטיים חלשים יחסית כמו אוטוליזוזומים חיוביים LC3, המאופיינים בתוכן צפוף ובועיות intraluminal. זה חושף ראות LC3 מינימלית ב- IF של קטעי קריו דקים במיוחד, מה שמרמז על LC3 ניתן לזיהוי במצב אוטוליזוזומים במצב יציב למרות הסביבה המתכלה. עם זאת, פונקטה חיובית LC3 מייצגת בעיקר אוטופגוזומים ומעטים מייצגים אוטוליזוזומים.עבור חוקרים שרוצים לבצע תיוג אימונוגולד במקום CLEM על סעיף, הפרוטוקולים והטיפים המתוארים כאן ישימים במלואם גם עבור תיוג אימונוגולד. בתחילה יישמנו CLEM בחתך על חלבונים אנדוזומליים רגולטוריים בעלי שפע נמוך והראינו לראשונה את הלוקליזציה האולטרה-מבנית האנדוגנית שלהם.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy