Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
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हम उपयोगी चर्चा ओं और प्रतिक्रिया के लिए यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर यूट्रेक्ट के आणविक चिकित्सा केंद्र में हमारे सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। हम अपनी माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों में निरंतर सुधार करने के लिए क्लंपरमैन प्रयोगशाला के पिछले और वर्तमान सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम के लिए उपयोग किया जाने वाला ईएम बुनियादी ढांचा डच रिसर्च काउंसिल (एनडब्ल्यूओ) द्वारा वित्तपोषित अनुसंधान कार्यक्रम नेशनल रोडमैप फॉर लार्ज स्केल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर (एनईएमआई) का हिस्सा है, परियोजना संख्या 184.034.014 जेके है।

लेखक ों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

यहां प्रस्तुत विधि क्रायोसेक्शन-आधारित ऑन-सेक्शन सीएलईएम में हालिया प्रगति का लाभ उठाती है - एफएम और ईएम 14,24 के बीच आईएफ लेबलिंग और सटीक (<100 एनएम त्रुटि) सहसंबंध की उच्च संवेदनशीलता। इसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंटली लेबल दुर्लभ, अंतर्जात प्रोटीन की संवेदनशीलता और ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ इसे ओवरले करने की क्षमता के साथ एक विधि होती है। इस प्रकार, यह विधि बहिर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन की (अधिक) अभिव्यक्ति और कम संवेदनशील ईएम लेबल के उपयोग की आवश्यकता से बचती है। विधि की व्यवहार्यता लाइसोसोमल अवरोधकों के उपयोग के बिना, भूखे कोशिकाओं में अंतर्जात एलसी 3 पर सीएलईएम के उदाहरणों द्वारा दिखाई गई है।
टोकुयासु विधि के साथ प्राप्त पिघले हुए क्रायोसेक्शन इम्यूनो-ईएम के लिए आदर्श नमूने हैं, क्योंकि राल वर्गों के विपरीत, वे एंटीबॉडी के लिए पारगम्य हैं। हल्के निर्धारण और विपरीत प्रक्रियाओं के साथ संयुक्त, यह आम तौर पर विस्तृत अल्ट्रास्ट्रक्चर से समझौता किए बिना अन्य तरीकों पर शानदार लेबलिंग दक्षता उत्पन्न करता है, और उत्कृष्ट रूप से सेलुलर झिल्ली 12,25,26 की कल्पना करता है। इसके अलावा, क्रायोसेक्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ अत्यधिक संगत हैं, जो उन्हें सीएलईएम के लिए मूल्यवान सब्सट्रेट बनाते हैं। क्रायोसेक्शन पर क्लासिक इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और सीएलईएम दोनों ने उपकोशिकीय संगठन 14,27,28,29,30 को समझने में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है।
वर्तमान में, पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम के अनुप्रयोग अधिक प्रचलित हो रहे हैं, निरंतर विकास और अनुकूलन 14,20,24,31,32,33,34 के परिणामस्वरूप जिसने दृष्टिकोण की गुणवत्ता, प्रयोज्यता और सटीकता में सुधार किया है। अब, बड़े आईएफ और ईएम छवि टाइलसेट के सटीक सहसंबंध से, तकनीक फ्लोरोसेंटली-लेबल अंतर्जात सेलुलर घटकों 14,32,33 के अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करती है। यह क्लासिक इम्यूनो-ईएम पर एक फायदा है, जहां सोने के लेबल वाली संरचनाओं की खोज के लिए आमतौर पर उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है और इसलिए, अधिक श्रमसाध्य और समय-गहन है। यह इस कारण से है कि अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए एलसी 3 का स्थानीयकरण सीएलईएम से बहुत लाभान्वित होता है। एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल आम हैं जब ऑटोफैजिक क्लीयरेंस अवरुद्ध हो जाता है (यानी, जब कोशिकाओं को बाफा 1 या पीएच-बढ़ाने वाले एजेंटों के साथ इलाज किया जाता है), जबकि ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल को अपरिवर्तित या भूखे कोशिकाओं में तेजी से साफ किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत कम स्थिर-राज्य स्तर होते हैं। ऐसी स्थितियों में, शास्त्रीय इम्यूनो-ईएम का उपयोग करके एलसी 3-लेबल ऑर्गेनेल ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और सीएलईएम एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है।
इससे पहले, राल वर्गों पर सीएलईएम को एलसी 3-जीएफपी या एलसी 3-जीएफपी-आरएफपी टेंडम जांच35,36,37,38,39 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके अध्ययनों में लागू किया गया था। इन अध्ययनों में, एक्रिलिक राल अनुभाग40 में एम्बेड करने से पहले या सीधे प्रतिदीप्ति इमेजिंग की गई थी, और नमूने बाद में ईएम द्वारा जांच किए गए थे। राल एम्बेडिंग के कई फायदे हैं; ऑटोफैगोसोमल अल्ट्रास्ट्रक्चर आम तौर पर अच्छी तरह से संरक्षित होता है, खासकर अगर सामग्री उच्च दबाव जमे हुए40 है। इसके अलावा, भारी धातु से सना राल-एम्बेडेड सामग्री का विपरीत आम तौर पर मूत्र-दाग वाले क्रायोसेक्शन की तुलना में अधिक स्पष्ट होता है। राल-एम्बेडेड अनुभाग वॉल्यूमेट्रिक ईएम विधियों के साथ संगत हैं, जैसे कि सरणी टोमोग्राफी, एफआईबी-एसईएम, या सीरियल ब्लॉकफेस एसईएम, जबकि क्रायोसेक्शन नहीं हैं। एम्बेड करने से पहले इमेजिंग करने वाले दृष्टिकोणों में, लाइव-सेल इमेजिंग एक विकल्प41 है जो क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम में उपलब्ध नहीं है। इन विकल्पों पर क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम का मुख्य लाभ उच्च आईएफ सिग्नल है, जो झिल्ली परमेबिलाइजेशन या ओवरएक्प्रेशन की आवश्यकता के बिना दुर्लभ प्रोटीन के इम्यूनो-स्थानीयकरण की अनुमति देता है। यह संभावित झिल्ली निष्कर्षण, ओवरएक्प्रेशन कलाकृतियों और विषय के आनुवंशिक संशोधन से बचता है, जो आईएफ और ईएम में बड़े क्षेत्रों को सहसंबंधित करने की संभावना के साथ मिलकर, एलसी3 और ऑटोफैगी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाता है।
यहां, भूखे एचईपीजी 2 कोशिकाओं के लिए ऑन-सेक्शन सीएलईएम के आवेदन से पता चला कि एलसी 3 मुख्य रूप से ऑटोफैगोसोम के रूप में पहचाने जाने वाले संरचनाओं के लिए स्थानीयकृत है। इसके अतिरिक्त, ऑटोलाइसोसोम में कुछ कमजोर फ्लोरोसेंट स्पॉट पाए गए। यह बाफा 19 के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं के विपरीत है और लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम फ्यूज होने के बाद ऑटोफैगोसोमल प्रोटीन के तेजी से क्षरण को दर्शाता है। कुल मिलाकर, डेटा से पता चला है कि पिघले हुए क्रायोसेक्शन का सीएलईएम मूल परिस्थितियों में एलसी 3-मध्यस्थता ऑटोफैगी पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। डेटा प्रौद्योगिकी की संवेदनशीलता को भी उजागर करता है, क्योंकि एलसी 3 को ऑटोलाइसोसोम में भी पाया गया था जिसमें बरकरार एलसी 3 एपिटोप्स के केवल निम्न स्तर होते हैं। विभिन्न मॉडलों और स्थितियों में एलसी 3 इमेजिंग द्वारा इस तकनीक के आगे के अनुप्रयोग से ऑटोफैगी और अन्य एलसी 3-मध्यस्थता जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ में सुधार होगा, जैसे कि एलसी 3 से जुड़े फागोसाइटोसिस या एटीजी 8 के एकल झिल्ली के संयुग्मन।
ऑटोफैगी से परे, ऑन-सेक्शन सीएलईएम को अन्य दुर्लभ घटनाओं या संरचनाओं पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि कोशिका विभाजन, संक्रमण, ऊतकों में दुर्लभ कोशिका प्रकार, किनेटोकाम, प्राथमिक सिलिया, या सेल प्रकार-विशिष्ट ऑर्गेनेल। आईएफ द्वारा रुचि के विषय के लिए प्रभावी स्क्रीनिंग इन दुर्लभताओं के अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन को बहुत सुविधाजनक बना सकती है। इसके अलावा,यह दिखाया गया था कि तकनीक का उपयोग शास्त्रीय इम्यूनो-ईएम की तुलना में अधिक संवेदनशील तरीके से प्रोटीन को स्थानीयकृत करने के लिए किया जा सकता है। निर्धारण लंबाई को समायोजित करने से इस संवेदनशीलता को और बढ़ाया जा सकता है, जिससे बहुत कम-प्रचुर मात्रा में या खराब एंटीजेनिक प्रोटीन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण की अनुमति मिलती है। अंत में, ऑन-सेक्शन सीएलईएम विधि ऑर्गेनेल की मात्रात्मक संख्या के तेजी से चयन को आसान बनाती है, जिससे किसी दिए गए प्रोटीन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल वितरण का अधिक मजबूत विश्लेषण होता है।
क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम को क्रायोसेक्शनिंग के लिए उपकरण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इन उपकरणों (जैसे, क्रायोमाइक्रोटोम) तक पहुंच वाले समूहों में, ऑन-सेक्शन सीएलईएम का कार्यान्वयन सीधा है और केवल एक स्वचालित वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप की उपलब्धता की आवश्यकता होती है, एक सेटअप जो अधिकांश प्रयोगशालाओं तक पहुंच है। इसके अलावा, विधि दुनिया भर में ईएम सुविधाओं में उपलब्ध है। चूंकि ऑन-सेक्शन सीएलईएम स्थापित आईएफ और ईएम विधियों के आवेदन को जोड़ती है, इसलिए विधि को आसानी से अनुकूलित किया जाता है और इसे जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए, टोमोग्राफी 20,33,43, सीमित संख्या में सेक्शन 44 के सीरियल सेक्शन वॉल्यूम ईएम, या सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी 45। विधि की यह बहुमुखी प्रतिभा जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुप्रयोगों का समर्थन करती है।

ऑटोफैगी साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और ऑर्गेनेल की निकासी और रीसाइक्लिंग के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। मैक्रो-ऑटोफैगी (इसके बाद ऑटोफैगी कहा जाता है) की प्रक्रिया में डबल-झिल्ली ऑर्गेनेल, ऑटोफैगोसोम का गठन शामिल है, जो कोशिकाओं को लाइसोसोमल गिरावट के लिए साइटोप्लाज्मिक अणुओं और ऑर्गेनेल को संलग्न करने की अनुमति देता है। ऑटोफैगी अधिकांश कोशिकाओं में बेसल स्तर पर होता है और सेलुलर स्थितियों, जैसे भुखमरी या सेलुलर तनाव के जवाब में अनियंत्रित होता है। ऑटोफैगी या तो सब्सट्रेट-विशिष्ट तरीके से होती है, जो गिरावट के लिए विशिष्ट संरचनाओं या प्रोटीन को लक्षित करती है, या साइटोसोल के कुछ हिस्सों को शामिल करने वाली एक गैर-चयनात्मक थोक प्रक्रिया के रूप में होती है। चयनात्मक ऑटोफैगी में, ऑटोफैगोसोम का निर्माण एटीजी 8-परिवार प्रोटीन (सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 ए / बी प्रकाश श्रृंखला 3 ए / बी / सी [एलसी 3] और जीएआरएएपी) के संयुग्मन से एंडोसोम, गोल्गी और / या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) 1 रीसाइक्लिंग से प्राप्त झिल्ली में होता है। एलसी 3 साइटोसोल में ऑटोफैजिक कार्गो को सीधे या चुनिंदा ऑटोफैगी एडाप्टर जैसे पी 62 / एसक्यूएसटीएम के माध्यम से पहचानता है। नए ऑटोफैजिक झिल्ली को तब एलसी 3 में संयुग्मित किया जा सकता है, विस्तार किया जा सकता है, और कार्गो को घेरने वाली एक पूर्ण डबल झिल्ली बनाने के लिए फ्यूज किया जा सकता है- जिसे ऑटोफैगोसोम कहा जाता है। ऑटोफैगोसोम परिपक्व होता है और अंततः एंडोसोम या लाइसोसोम के साथ फ्यूज हो जाता है, जिसके बाद ऑटोफैजिक कार्गो और एडाप्टरखराब हो जाते हैं।
ऑटोफैगोसोम गठन, परिपक्वता और संलयन पर अध्ययन अक्सर प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हैं। एलसी 3 की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग आमतौर पर विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैगोसोम की संख्या और सेलुलर स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, तथाकथित अग्रानुक्रम जांच में एलसी 3 को पीएच-संवेदनशील जीएफपी और पीएच-स्थिर आरएफपी में जोड़कर, जीएफपी फ्लोरेसेंस लॉस3 के कार्य के रूप में जीवित कोशिकाओं में ऑटोफैगी के समग्र प्रवाह को मापा जा सकता है। ये दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैगी की भूमिका और तंत्र को समझने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। एक अन्य अमूल्य उपकरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) है, जो ऑटोफैगी 4,5,6,7,8 के विभिन्न चरणों में ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर का खुलासा करता है। आज तक, ईएम अभी भी आकृति विज्ञान द्वारा विभिन्न ऑटोफैजिक झिल्ली को भेदभाव करके ऑटोफैगोसोम गठन के सटीक चरणों की पहचान करने के लिए पसंद की विधि है: फागोफोर (डबल झिल्ली पूरी तरह से बंद नहीं), ऑटोफैगोसोम (साइटोसोलिक कार्गो के चारों ओर बंद डबल झिल्ली), और ऑटोलिसोसोम (आंतरिक ऑटोफैजिक झिल्ली का आंशिक] नुकसान)। आणविक जानकारी के बिना आकृति विज्ञान, हालांकि, गलत पहचान या अस्पष्टता से ग्रस्त हो सकता है। इम्यूनो-ईएम ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल के एक साथ आणविक लक्षण वर्णन और रूपात्मक वर्गीकरण के लिए सबसे व्यापक तरीका है। उदाहरण के लिए, पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर एलसी 3 का इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग एलसी 3 के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण और एलसी 3-चिह्नित ऑर्गेनेल9 की सटीक पहचान की अनुमति देता है।
ईएम का एक दोष दृश्य का एक छोटा सा क्षेत्र है जो ऑटोफैजिक झिल्ली के ठीक अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक उच्च आवर्धन के साथ आता है और, इम्यूनो-ईएम के मामले में, उस लेबल का पता लगाने के लिए जो रुचि के प्रोटीन को चिह्नित करता है। उनकी कमी और कम प्रोटीन के स्तर के कारण, यह आम तौर पर ऑटोफैगोसोम के मात्रात्मक ईएम विश्लेषण में बाधा डालता है। ऑटोफैगोसोम की संख्या बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं को अक्सर भूखा रखा जाता है और बेफिलोमाइसिन ए 1 (बाफा 1) के साथ इलाज किया जाता है, जो लाइसोसोमल अम्लीकरण और गिरावट का अवरोधक है। बाफा 1 उपचार के बिना, ईएम द्वारा ऑटोफैगोसोम की खोज समय-गहन है, इन ऑर्गेनेल की कमी के कारण। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि ईएम के लिए आगे की तैयारी से पहले फ्लोरोसेंट लेबलिंग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर अंतर्जात एलसी 3 की इमेजिंग के माध्यम से इस मुद्दे को संबोधित करती है। फ्लोरोसेंट छवियां तब ईएम में एलसी 3-लेबल संरचनाओं की खोज का मार्गदर्शन करती हैं। संग्रह के बाद, ईएम छवियों को कोशिका की अल्ट्रास्ट्रक्चर में आणविक जानकारी-एलसी 3 की उपस्थिति जोड़ने के लिए प्रतिदीप्ति छवियों के साथ सहसंबद्ध किया जाता है। यह 'ऑन-सेक्शन सीएलईएम' विधि एलसी 3-लेबल संरचनाओं को खोजने की क्षमता को बढ़ाती है, विशेष रूप से अनुपचारित परिस्थितियों में, ईएम द्वारा बाद में पहचान और वर्गीकरण के लिए।
इस विधि को भूखे हेपेटोब्लास्टोमा-व्युत्पन्न एचईपीजी 210 कोशिकाओं पर लागू किया गया था ताकि अपरिवर्तित (यानी, कोई बाफा 1 का उपयोग नहीं किया गया था) स्थितियों में ऑटोफैगोसोम का पता लगाया जा सके। अपेक्षाकृत कम फ्लोरोसेंट पंक्टा (90 एनएम खंड में प्रति सेल प्रोफाइल एक से कम) पाए गए, जो एलसी 311 के उच्च कारोबार के साथ समझौते में है। एलसी 3-पंक्टा की इस स्पर्शता ने सीएलईएम के मूल्य पर जोर दिया; ईएम में इमेजिंग के लिए कई फ्लोरोसेंट पंक्टा वाले क्षेत्रों का चयन करके, एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल पाए गए और पारंपरिक इम्यूनो-ईएम की तुलना में बहुत अधिक प्रभावी तरीके से विशेषता दी गई। इससे पता चला कि एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल के बहुमत ऑटोफैगोसोम थे, जैसा कि उनकी आकृति विज्ञान द्वारा परिभाषित किया गया है, जो बाफा 1-उपचारित कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों के विपरीत है, जहां ऑटोलाइसोसोमअधिक सामान्य हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि ऑन-सेक्शन सीएलईएम के साथ, ऑटोफैगी का अध्ययन ऑटोफैजिक प्रवाह को बाधित करने की आवश्यकता के बिना अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल का विज़ुअलाइज़ेशन उनकी पहचान स्थापित करने और उन विवरणों को प्रकट करने के लिए आवश्यक है जो ऑटोफैजिक प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, ईएम विधियों में अक्सर आणविक जानकारी की कमी होती है, जो ईएम द्वारा प्राप्त अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी के सहसंबंध को विशिष्ट ऑटोफैगी प्रोटीन के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी-आधारित स्थानीयकरण में बाधा डालती है। इसके अलावा, अपरिवर्तित सेलुलर स्थितियों में ऑटोफैगोसोम की दुर्लभता ईएम द्वारा जांच में बाधा डालती है, जिसके लिए उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है, और इसलिए दृश्य का एक सीमित क्षेत्र प्रदान करता है।
दोनों चुनौतियों के जवाब में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर आधारित एक ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) विधि को ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए एक सामान्य ऑटोफैगोसोमल मार्कर, एलसी 3 को सहसंबंधित करने के लिए लागू किया गया था। विधि का उपयोग अन्य प्रासंगिक मार्करों के साथ संयोजन में एलसी 3 लेबलिंग के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में कोशिकाओं को तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया गया था। इसके बाद, सीएलईएम द्वारा चयनित एलसी 3-लेबल स्पॉट की अंतर्निहित अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताओं की पहचान की गई। विधि को लाइसोसोमल अम्लीकरण के अवरोधकों को जोड़ने के बिना भूखे कोशिकाओं पर लागू किया गया था।
इन स्थितियों में, एलसी 3 मुख्य रूप से ऑटोफैगोसोम पर पाया गया था और शायद ही कभी ऑटोलाइसोसोम में, जिसमें एलसी 3 तेजी से खराब हो जाता है। ये डेटा इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता और संवेदनशीलता दोनों को दिखाते हैं, यह दर्शाते हुए कि सीएलईएम का उपयोग दवा उपचार या आनुवंशिक परिवर्तन के बिना देशी स्थितियों में एलसी 3-मध्यस्थता ऑटोफैगी पर अल्ट्रास्ट्रक्चरल अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह विधि ईएम डेटा के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी को पुल करके ऑटोफैगी प्रोटीन और अन्य दुर्लभ एंटीजन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रस्तुत करती है।

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Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

यहां, हम सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के संबंध में दुर्लभ प्रोटीन के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में अंतर्जात, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर अनुकूलित ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस दृष्टिकोण की शक्ति को बेफिलोमाइसिन उपचार के बिना भूखे कोशिकाओं में अंतर्जात एलसी 3 के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।

ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अंतर्जात एलसी 3 का अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

नैनो फेम: प्रोटीन फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का स्थानीयकरण

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

एक विशिष्ट संवेदी प्रकोष्ठ के correlative confocal और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

तीन आयामी सुपर Interferometric Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा एफ actin फिलामेंट्स के संकल्प माइक्रोस्कोपी (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

डुबकी बर्फ़ीली: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में निलंबन कोशिकाओं के Ultrastructural और Immunolocalization अध्ययन के लिए एक उपकरण

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 को मापकर आटोफैजिक फ्लक्स का मूल्यांकन करना मल्टी-स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

उच्च दबाव ठंड, माइक्रोवेव की सहायता के विपरीत वृद्धि, और मात्रा इमेजिंग के लिए ंयूनतम राल Embedding द्वारा जैविक नमूना तैयारी

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में जैविक नमूनों के अच्छे अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण के लिए सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग करके तेजी से ठंड

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

क्वांटम डॉट्स-मध्यस्थता इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग करके हृदय में प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की कल्पना करना, इसके बाद ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...