Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

実りある議論とフィードバックをしてくれたユトレヒト大学医療センターの分子医学センターの同僚に感謝します。私たちは、顕微鏡技術の継続的な改善を行ってくれたKlumpermanラボの過去と現在の同僚に感謝します。本研究に用いるEMインフラは、オランダ研究評議会(NWO)がJKに資金提供する研究プログラム「National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI)」(プロジェクト番号184.034.014)の一部です。

著者らは、利益相反はないと宣言しています。

ここで紹介する方法は、凍結切片に基づくオンセクションCLEMの最近の進歩、つまりIF標識の高感度とFMとEM14,24の間の正確な(<100 nmエラー)相関を利用しています。これにより、希少な内因性タンパク質を蛍光標識する感度と、これをEM超微細構造に高精度で重ね合わせる能力を備えた方法が得られます。したがって、この方法では、外因性にタグ付けされたタンパク質の(過剰)発現や、感度の低いEM標識の使用が不要になります。この方法の実現可能性は、リソソーム阻害剤を使用せずに、飢餓細胞の内因性LC3に対するCLEMの例によって示されています。
徳安法で得られた凍結切片は、樹脂切片と異なり抗体を透過性があるため、免疫電子顕微鏡に最適なサンプルです。穏やかな固定および造影手順と組み合わせることで、これは一般に、詳細な超微細構造を損なうことなく、他の方法よりも優れた標識効率をもたらし、細胞膜を見事に視覚化します12,25,26。さらに、クライオ切片は蛍光顕微鏡との親和性が高く、CLEMの貴重な基質となっています。凍結切除における古典的なイムノゴールド標識とCLEMの両方が、細胞内組織を理解する上で独創的な洞察を提供しました14,27,28,29,30。
現在、融解凍結切片へのCLEMの適用は、アプローチの品質、適用性、および精度を向上させた継続的な開発と最適化14、20、24、31、32、33、34の結果として、より普及しています。現在、この技術は、大きなIF画像タイルセットとEM画像タイルセットの正確な相関により、蛍光標識された内因性細胞成分の超微細構造のスクリーニングを容易にします14,32,33。これは、金標識構造の探索に通常高倍率を必要とするため、より手間と時間がかかる従来の免疫電子顕微鏡よりも優れています。このため、LC3の超微細構造への局在化はCLEMから大きな恩恵を受けます。LC3陽性の細胞小器官は、オートファジークリアランスがブロックされている場合(すなわち、細胞がBafA1またはpH上昇剤で処理されている場合)に一般的ですが、オートファジー細胞小器官は、変化していない細胞または飢餓状態の細胞で急速に除去されるため、定常状態レベルが非常に低くなります。このような状況では、従来のイムノ電子顕微鏡を用いてLC3標識細胞小器官を見つけることは困難な場合があり、CLEMには明らかな利点があります。
以前は、LC3-GFPまたはLC3-GFP-RFPタンデムプローブの異所性発現を用いた研究で、樹脂切片にCLEMを適用していました35,36,37,38,39。これらの研究では、蛍光イメージングは、包埋前に、またはアクリル樹脂切片40に直接実施され、その後、サンプルをEMによってスクリーニングした。樹脂包埋にはいくつかの利点があります。オートファゴソームの超微細構造は、特に材料が高圧凍結されている場合、一般的によく保存されています40。さらに、重金属染色された樹脂包埋材料のコントラストは、一般にウラニル染色された凍結切片のコントラストよりも顕著です。樹脂包埋切片は、アレイトモグラフィー、FIB-SEM、シリアルブロックフェースSEMなどの体積EM法と互換性がありますが、クライオ切片は互換性がありません。包埋前にイメージングを行うアプローチでは、生細胞イメージングは、クライオ切片のCLEMでは利用できないオプション41です。凍結切除におけるCLEMの主な利点は、IFシグナルが高いため、膜透過処理や過剰発現を必要とせずに希少タンパク質の免疫局在化が可能であることです。これにより、膜抽出、過剰発現アーチファクト42、および被験者の遺伝子改変の可能性が回避され、IFとEMの広い領域を相関させる可能性と相まって、LC3とオートファジーを研究するための優れたツールになります。
ここでは、飢餓状態のHEPG2細胞にオンセクションCLEMを適用したところ、LC3は主にオートファゴソームとして同定された構造に局在していることが明らかになりました。さらに、オートリソソームにいくつかの弱い蛍光スポットが見つかりました。これは、BafA19 で処理された細胞とは正反対であり、オートファゴソームがリソソームと融合すると、オートファゴソームタンパク質が急速に分解されることを反映しています。全体として、このデータは、融解した凍結切片のCLEMが、天然条件におけるLC3を介したオートファジーに関する洞察を提供できることを実証しました。また、このデータは、低レベルのインタクトなLC3エピトープしか含まないオートリソソームでもLC3が検出されたため、この技術の感度を強調しています。異なるモデルや条件でLC3をイメージングすることにより、この技術をさらに応用することで、オートファジーや、LC3関連食作用やATG8の単膜への結合など、LC3を介した他の生物学的プロセスの理解が深まります。
オートファジー以外にも、オンセクションCLEMは、細胞分裂、感染、組織内の希少細胞タイプ、動原体、一次繊毛、細胞タイプ特異的細胞小器官など、他のまれなイベントや構造にも適用できます。IFによる対象の効果的なスクリーニングは、これらの希少性の超微細構造研究を大幅に促進することができます。さらに、この技術は、従来の免疫電子顕微鏡よりも高感度な方法でタンパク質を局在化するために使用できることが示されました14 。固定長を調整することで、この感度をさらに拡張し、非常に少量のタンパク質や抗原性の低いタンパク質の超微細構造局在化が可能になります。最後に、オンセクションCLEM法は、定量的な数の細胞小器官の迅速な選択を容易にし、特定のタンパク質の超微細構造分布のより堅牢な分析を容易にします。
凍結切片のCLEMには、凍結切片作成のための機器と専門知識が必要です。これらのツール(クライオミクロトームなど)にアクセスできるグループでは、オンセクションCLEMの実装は簡単で、ほとんどのラボがアクセスできるセットアップである自動広視野顕微鏡のみが必要です。さらに、この方法は世界中のEM施設で利用可能です。オンセクションCLEMは、確立されたIF法とEM法の適用を組み合わせたものであるため、この方法は容易に適合し、例えば、断層撮影20、33、43、限られた数のセクション44のシリアルセクションボリュームEM、または超解像顕微鏡45と組み合わせることができる。この分析法の汎用性は、幅広い生物学的問題への応用をサポートします。

オートファジーは、細胞質タンパク質と細胞小器官のクリアランスとリサイクルのための重要なプロセスです。マクロオートファジー(以下、オートファジーと呼ぶ)のプロセスには、二重膜オルガネラであるオートファゴソームの形成が含まれ、これにより細胞は細胞質分子と細胞小器官を囲い込み、リソソーム分解を行うことができます。オートファジーは、ほとんどの細胞で基底レベルで発生し、飢餓や細胞ストレスなどの細胞の状態に応じてアップレギュレーションされます。オートファジーは、特定の構造やタンパク質を標的とする基質特異的な方法で分解されるか、細胞質の一部を含む非選択的なバルクプロセスとして発生します。選択的オートファジーでは、オートファゴソームは、Atg8ファミリータンパク質(微小管関連タンパク質1A/B軽鎖3A/B/C [LC3]およびGABARAP)が、リサイクルエンドソーム、ゴルジ体、および/または小胞体(ER)に由来する膜に結合することによって形成されます1。LC3は、細胞質内のオートファジーカーゴを直接、またはP62/SQSTMなどの選択的オートファジーアダプター を介して 認識します。その後、新しいオートファジー膜をLC3に結合させ、膨張させ、融合させて、オートファゴソームと呼ばれるカーゴを包む完全な二重膜を形成します。オートファゴソームは成熟し、最終的にエンドソームまたはリソソームと融合し、その後、オートファジーカーゴとアダプターが分解されます2。
オートファゴソームの形成、成熟、融合に関する研究には、光学顕微鏡技術が利用されることがよくあります。LC3の蛍光顕微鏡法は、一般に、さまざまな条件下でのオートファゴソームの数と細胞局在を評価するために使用されます。さらに、いわゆるタンデムプローブでLC3をpH感受性GFPおよびpH安定RFPに結合させることにより、オートファジーの全体的なフラックスをGFP蛍光損失の関数として生細胞で測定することができます3。これらのアプローチは、研究者がさまざまな条件下でのオートファジーの役割とメカニズムを理解するための貴重なツールです。もう一つの貴重なツールは電子顕微鏡(EM)で、オートファジーのさまざまな段階におけるオートファジーオルガネラの微細構造を明らかにします4,5,6,7,8。今日まで、EMは、形態によって異なるオートファジー膜を識別することにより、オートファゴソーム形成の正確な段階を特定するための選択方法であり、ファゴフォア(完全に閉じていない二重膜)、オートファゴソーム(細胞質カーゴの周りの閉じた二重膜)、およびオートリソソーム(内側のオートファジー膜の[部分的な]喪失)。しかし、分子情報のない形態は、誤認や曖昧さを招きやすい。イムノ電子顕微鏡は、オートファジーオルガネラの分子特性評価と形態学的分類を同時に行うための最も包括的な方法です。例えば、融解した凍結切片でLC3を免疫金標識すると、LC3の超微細構造局在とLC3標識細胞小器官の正確な同定が可能になります9。
EMの欠点は、オートファジー膜の微細な超微細構造を観察し、免疫電子顕微鏡の場合は目的のタンパク質をマークする標識を見つけるために高倍率で視野が狭いことです。オートファゴソームは希少でタンパク質レベルが低いため、一般的にオートファゴソームの定量的EM分析の妨げになります。オートファゴソームの数を増やすために、細胞はしばしば飢餓状態になり、リソソームの酸性化と分解の阻害剤であるバフィロマイシンA1(BafA1)で処理されます。BafA1処理を行わないと、これらの細胞小器官が不足しているため、EMによるオートファゴソームの探索に時間がかかります。この原稿で紹介する方法は、EMのさらなる準備を行う前に、蛍光顕微鏡で解凍した凍結切片上の内因性LC3の蛍光標識とイメージングを通じてこの問題に対処します。蛍光画像は、EM中のLC3標識構造の探索をガイドします。採取後、EM画像と蛍光画像を相関させて、細胞の微細構造に分子情報(LC3の存在)を追加します。この「オンセクションCLEM」法により、特に未処理条件でLC3標識構造を見つける能力が大幅に向上し、その後のEMによる同定と分類が可能になります。
この方法を飢餓肝芽腫由来HEPG210 細胞に適用し、変化していない(すなわち、BafA1を使用しない)条件でオートファゴソームを見出した。比較的少数の蛍光点(90 nm切片の細胞プロファイルあたり1つ未満)が見られ、これはLC311の高い代謝回転と一致しています。LC3-punctaのこの疎性は、CLEMの価値を強調しました。EMでイメージングするためにいくつかの蛍光点を持つ領域を選択することにより、LC3陽性オルガネラが従来の免疫EMよりもはるかに効果的な方法で見つかり、特性評価されました。これにより、LC3陽性細胞小器官の大部分は、その形態によって定義されるオートファゴソームであることが明らかになり、オートリソソームがより一般的であるBafA1処理細胞で得られた結果とは対照的であることが明らかになった9。これらのデータは、オンセクションCLEMでは、オートファジーの流れを阻害することなく、超微細構造レベルでオートファジーを研究できることを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

電子顕微鏡(EM)によるオートファジーオルガネラの超微細構造レベルでの可視化は、オートファジープロセスの同一性を確立し、オートファジープロセスを理解する上で重要な詳細を明らかにするために不可欠です。しかし、EM法は分子情報が不足していることが多く、EMで得られる超微細構造情報と、特定のオートファジータンパク質の蛍光顕微鏡による局在との相関関係を妨げています。さらに、オートファゴソームは細胞内が変化していない状態では稀少であるため、高倍率を必要とするEMによる研究は困難であり、視野が限られています。
この2つの課題に対して、蛍光標識に基づくオンセクション相関光電子顕微鏡(CLEM)法を適用し、一般的なオートファゴソームマーカーであるLC3をEM超微細構造に相関させました。この分析法は、蛍光顕微鏡で細胞を迅速にスクリーニングし、他の関連マーカーと組み合わせてLC3標識を行うために使用されました。その後、選択されたLC3標識スポットの根底にある超微細構造の特徴がCLEMによって同定されました。この方法は、リソソーム酸性化の阻害剤を添加せずに飢餓細胞に適用しました。
これらの条件下では、LC3は主にオートファゴソームに見られ、LC3が急速に分解されるオートリソソームではまれに見られました。これらのデータは、このアプローチの実現可能性と感度の両方を示しており、CLEMを使用して、薬物治療や遺伝子変異を伴わない天然条件でのLC3を介したオートファジーに関する超微細構造の洞察を提供できることを実証しています。全体として、この方法は、光学顕微鏡とEMデータをつなぐことにより、オートファジータンパク質やその他の希少な抗原の超微細構造局在研究のための貴重なツールを提供します。

極薄凍結切片でのLC3の免疫金標識のための最適化された免疫EMプロトコルが、De Maziereらによって最近発表されました9。この研究には、LC3が存在するが比較的まれでEMによる発見が困難なBafA1のない飢餓状態が含まれていました。別の研究では、蛍光標識の感度を利用して、比較的まれで発現の少ない内因性タンパク質を可視化し、これをEM超微細構造と相関させるオンセクションCLEM法が導入されました14。ここでは、これら 2 つのアプローチを、CLEM アプローチの一部として最適化された LC3 標識プロトコルの使用によって組み合わせます。
基底オートファジーのレベルが比較的高い肝臓由来の細胞であるHEPG2細胞22を、4%PFAに固定する前に、最小限の培地(アール平衡塩溶液[EBSS])で2時間飢餓状態にしました。これに続いて、超薄型凍結切片の徳安法(セクション1-3;Slot and Geuze12参照)によるサンプル調製が行われ、これはオンセクションCLEM 14,23と高い親和性があります。融解した凍結切片を、マウス抗LC3一次抗体を用いて蛍光標識した(プロトコルセクション4および図1)。さらに、ウサギ抗LAMP1をエンドリソソームの指示に用い、次に抗マウスAlexaFluor488および抗ウサギAlexaFluor568二次抗体を用いました。グリッドをカバーガラスとスライドガラスの間に挟み込み、広視野顕微鏡(100x 1.47 NAオイル対物レンズ、sCMOSカメラ)でRTで画像化しました。
従来の全細胞IFに対する薄切片の蛍光標識の利点は、切片の物理的な厚さが60〜90 nmであるため、Zの分解能が向上することです。このZ分解能の向上により、薄切片上のLC3とLAMP1の蛍光標識では、共局在がほとんど見られません(図2A)。BafA1などのリソソーム阻害剤で処理された細胞では、リソソームで封入されたLC3が分解されないままであるため、高い共局在が起こります9。未処理の細胞では、LC3は酵素活性のLAMP1陽性リソソームと接触すると急速に分解されるため、これらの条件では共局在はまれです。一般に、細胞プロファイルごとに1つのLC3句点未満が観察されました。これは、飢餓状態でもオートファゴソームの代謝回転が速く、オートファゴソームの数を低く抑えていることを示しています。また、CLEMを使用して、光学顕微鏡による広い視野を使用して、まれなLC3標識構造を見つけることの重要性も強調しています。さらに、蛍光標識は金標識よりも感度が高いため、従来の免疫電子顕微鏡よりも多くのLC3陽性細胞小器官を同定でき、その特性評価がさらに容易になります。
切片のリボンの完全なタイルセットを取得した後、グリッドを顕微鏡から取り出し、UAおよびループアウト法を使用してEM用に後染色しました(プロトコルステップ4.4-4.6;図1F、G)。この「ループアウト」方式により、UA:メチルセルロースの薄層がグリッド上に残り、EMに望ましいコントラストが生まれます。層の厚さは、UA:メチルセルロースがろ紙に吸い取られる速度と角度によって異なります。ループのドラッグが速すぎると、グリッドにUA:methylcelluloseが残りすぎて、EMのセクションの外観が暗くなる可能性があります。ドラッグが遅すぎると、UA:メチルセルロースが引き離されすぎて、染色が少なすぎて形態が悪くなり、グリッドがループから外れる危険性があります。ドライグリッド上の「油膜」着色(図1G)は、適切なUA:メチルセルロース層の厚さを示します。
ループアウトと乾燥の後、グリッドをTEMで蛍光によって選択されたROIでイメージングしました。IFデータセットとEMデータセットは、DAPIシグナルをEMで見える核の輪郭に重ね合わせることによって相関し、両方のモダリティの情報を含む統合画像を生成しました。
IFで選択したのと同じ領域をEMで見つけるのは困難な場合があります。したがって、EMで検索している間は、IFタイルセットの概要画像を手元に置いておくことをお勧めします。ユーザーは、切片の折り目や裂け目、グリッドバー、核の配置など、両方のモダリティで認識可能な特徴を探す必要があります。また、EMではサンプルが回転して鏡面化して見える可能性があることに留意することも重要です。領域を識別するための特定の機能を備えた「ファインダーグリッド」を使用して、相関関係を容易にすることができます(材料表を参照)。
LC3陽性オルガネラとEM超微細構造の相関関係から、異なる点状がオートファジーの異なる段階を表すことが明らかになりました(図2B)。凍結切片ではオートファゴソームの超微細構造の保存が困難であるが、細胞質内容物と二重膜を有するオルガネラが頻繁に観察された(図2C、オルガネラ1-5の矢印; 補足図S1)は、オートファゴソームの形態学的特徴を定義しています。興味深いことに、やや弱い蛍光斑は、濃い内容物と管腔内小胞を特徴とするLC3陽性のオートリソソーム(図2C、オルガネラ6、オートファジー含量は*とマークされています)としてEMによって同定されました。このことは、極薄凍結切片のIFにおいてごく少量のLC3が見られることを示し、分解環境にもかかわらず、定常状態の自己リソソームでは一部のLC3が検出可能であることを示しました。しかし、LC3陽性の点状の大部分はオートファゴソームであり、オートリソソームは非常にまれでした。これは、BafA1で処理された細胞が主にオートファゴソームを蓄積し、オートファゴソームを蓄積しないのとは対照的である9。
要約すると、このプロトコルはEMの微細構造に蛍光性の顕微鏡検査によって得られる分子情報をつなぐためのセクションCLEM方法を記述する。この方法では、標識に蛍光色素のみが使用され、一般にEMプローブよりも多くのシグナルが得られるため、免疫電子顕微鏡の感度が向上します。この方法は、無視できるバックグラウンド染色で高レベルの比蛍光を得ることができる極薄凍結切片の使用に特に適しています。蛍光を使用して希少な構造や事象をスクリーニングし、選択したROIをEMに相関させることで、EM操作時間と関連コストを大幅に削減できます。この方法の感度と実現可能性は、未処理の飢餓細胞におけるLC3の可視化によって実証され、LC3はこれらの条件で主にオートファゴソームに会合し、オートリソソームでは非常に低いレベルが見られることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> 図1:オンセクションCLEMの概略図 。 (A)ゼラチン包埋細胞からの凍結切片は、formvarでコーティングされた銅グリッド上に収集されます。(B)グリッドは、適切な溶液の液滴上でセクションダウンで処理されます。(C)グリッドは、一次抗体および蛍光二次抗体で標識されています。(D)グリッドは、50%グリセロールでカバーガラスとスライドガラスの間に挟まれています。(E)広視野顕微鏡で蛍光画像を収集します。(F)スライドガラスからグリッドを取り出し、EM用のウラニル染色でさらに処理します。(G)乾燥後、TEMでグリッドを画像化できます。(H)高倍率TEM画像タイルセットは、蛍光データから選択された領域から取得されます。(I)蛍光顕微鏡とEMの画像を相関させ、重ね合わせます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> 図2:飢餓状態のHEPG2細胞におけるLC3とLAMP1のCLEM。 HEPG2細胞をEBSSで2時間飢餓状態にした後、4% PFAで2時間固定した。 (A)切片上のLC3(緑)とLAMP1(赤)のIFイメージングでは、LC3点が比較的少なく、LAMP1との共局在がほとんどないことがわかります。(B)DAPIと核外形に基づく2つのイメージングモダリティ(破線、右パネル)を重ね合わせ、IF(左パネル)の分子情報とEMで得られた超微細構造情報(中パネル)をリンクさせる。ボックス 1(右パネル)に例示されているように、個々の LC3 標識コンパートメントの超微細構造を C に示します。(C)LC3陽性コンパートメントの微細構造。CLEM画像を左側に、疑似カラー(ベージュ)EM画像を右側に示します(無色のEM画像を 補足図S1に示します)。内側と外側のオートファゴソーム膜は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。実施例6におけるオートリソソーム内部のオートファジー含量を*で示す。スケールバー = 10 μm (A)、1 μm (B)、200 nm (C)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:LC3陽性細胞小器官の無着色EM画像。 (A-F)擬似着色例1〜6の無着色EM画像を 図2Cに示す。細胞小器官は、 図 2 に示したように、LC3 蛍光によって選択されました。内側と外側のオートファゴソーム膜は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。実施例6におけるオートリソソーム内部のオートファジー含量を*で示す。スケールバー = 200 nm。略語:AL =オートリソソーム;AP = オートファゴソーム;M =ミトコンドリア。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:この研究で使用した緩衝液と溶液。 この補足ファイルには、この研究で使用したバッファーと溶液を作製するために必要なレシピとプロトコルが含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

細胞の超微細構造におけるタンパク質の局在化は、何十年にもわたって強力な研究ツールとなってきました。このプロトコルでは、存在量が少ないタンパク質や見つけにくいタンパク質を拡張しました。蛍光顕微鏡を用いて、高感度でスクリーニング可能な方法でタンパク質を標識し、電子顕微鏡と組み合わせて細胞の超微細構造を補充します。ここでは、オートファジータンパク質のオンセクションCLEMを実証しますが、細胞の超微細構造が関心のある生物学的問題、特にまれな事象の研究に実際に適用できます。私と一緒に手順を実演するのは、私たちの研究室の上級研究技術者であるTineke Veenendaalです。まず、0.15%グリシンを含むPBSを、摂氏37度に予熱したPBS中の1%ゼラチンと交換します。ゼラチン中の細胞をこすり落とし、微量遠心チューブに移します。微量遠心分離機で室温で1分間6、000Gで細胞をペレット化し、ペレットを乱すことなくゼラチンを除去します。摂氏37度に加温した12%ゼラチンをペレットに加え、ピペットチップまたは同じ温度に予熱したガラス製牧草地ピペットでピペッティングして穏やかに再懸濁します。摂氏37度で10分間インキュベートした後、細胞を6, 000 Gで1分間ペレット化します。ゼラチンを氷上で30分間固めます。ゼラチン包埋細胞をチューブから取り除くには、ペレットを含むチューブの端をチューブの残りの部分からカミソリの刃で切り取ります。次に、セルペレットでチューブの端を最初のカットに対して垂直に半分にカットします。細胞ペレットを含む2つのチューブの端半分を2.3モルのスクロースに入れ、摂氏4度で10分間インキュベートします。これにより、細胞ペレットの半分がわずかに収縮し、プラスチックチューブから外れます。ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットが入ったチューブの半分をスクロースから取り除き、次にピンセットでプラスチックチューブの半分から細胞ペレットの半分を取り除きます。ペレットをカミソリの刃で適切なサイズのブロックに手動で切断し、実体解剖顕微鏡を使用して切断中に被写体を拡大します。細胞ブロックを2.3モルのスクロース中で摂氏4度で一晩インキュベートします。アルミニウム製サンプルホルダーピンに取り付けます。ブロックとピンの間に薄いカラーを形成するように、ブロックの端に十分なスクロースを残します。スナップフリーズして液体窒素で保存します。ブロックの前面をトリミングして表面を平らにし、約250ナノメートルの厚さのセクションを取得します。次に、ナイフの角でサンプルブロック面の側面に50〜100マイクロメートルを切断して、ブロックの側面をトリミングします。サンプルブロック面の4辺をトリミングすると、約250 x 375マイクロメートルの長方形が突き出ます。突き出た長方形からリボンを切断し、セクションの厚さが70〜90ナノメートルで、銀色の金色の光沢があることを確認します。ダイヤモンドナイフの刃から切片を棒につなげて、長いリボンを作ります。3ミリメートルのピックアップループを2.3モルのスクロースと2%メチルセルロースの1対1の混合物に浸して、リボンをピックアップします。ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴が固まり始めたら、液滴をそっと押し付けて切片をすぐに拾います。クライオチャンバーからループを取り外します。液滴が完全に解凍するまで待ち、準備したグリッドに液滴を押します。約1ミリリットルのPBSを切片化したグリッドを小皿またはマルチウェルプレートに入れ、摂氏37度で30分間インキュベートします。パラフィルム上の約75マイクロリットルの液滴でグリッドを処理し、室温でPBSグリシン洗浄から始めます。ブロッキングステップとして、0.1%ウシ血清アルブミンCおよび0.5%魚皮ゼラチンからなるブロッキングバッファーをPBS中で室温で10分間インキュベートします。一次抗体をブロッキングバッファーでPBSに希釈し、この溶液の約10マイクロリットルの液滴上で室温で1時間インキュベートします。0.1%ウシ血清アルブミン含有PBS溶液中のグリッドを室温で5回洗浄します。二次抗体とDAPIをPBSのブロッキングバッファーで希釈します。次に、この溶液の約10マイクロリットルの液滴でグリッドを室温で30分以上インキュベートした後、前述のようにPBSでグリッドを5回洗浄します。光学顕微鏡用のサンプルを取り付けるには、グリッドを蒸留水に溶かした50%グリセロールに2回、室温で5分間浸します。50%グリセロールのスライドガラスとカバースリップの間にカバースリップごとに1つのグリッドを配置し、セクションがカバーガラスに面するようにします。光学顕微鏡では、グリッドを挟んだスライドガラスを自動ステージ付きの広視野顕微鏡に持っていきます。高倍率のオイル対物レンズを選択し、セクションのリボンの画像タイルセットを作成します。次に、アンマウントと電子顕微鏡またはEMコントラストのために、スライドガラスカバースリップサンドイッチの側面に10マイクロリットルの蒸留水を追加し、毛細管現象がガラスカバースリップサンドイッチ界面を満たすのを待ちます。グリセロールに浸漬油を混ぜずにカバースリップを慎重に取り外します。ピンセットでグリッドを回収し、室温で蒸留水に3回浸して、50%グリセロールを洗い流します。糸くずの出ないティッシュペーパーでグリッドの裏側を慎重に乾かし、グリッドセクションを下にして蒸留水滴の上に置きます。電子顕微鏡で造影剤として切片を染色するには、室温で酢酸ウラニルと5分間インキュベートします。酢酸ウラニルメチルセルロース溶液を、氷上の金属板上のパラフィルムに液滴を置いて冷却します。次に、この氷冷溶液でグリッドを2回洗浄し、溶液中で10分間インキュベートします。グリッド乾燥ループを各グリッドの下の酢酸ウラニルメチルセルロース液滴に挿入し、グリッドが液滴から引き離されるまでゆっくりと持ち上げて、グリッドをループアウトします。余分な溶液を吸い取るには、糸くずの出ないろ紙に約60度の角度でループに触れ、溶液が吸収されなくなるまで紙に沿ってゆっくりとドラッグします。グリッド付きのループを適切なラックに置き、室温で10分以上乾燥させます。光学顕微鏡で得られた概要を使用して、透過型電子顕微鏡またはTEMでイメージングする関心領域を特定し、光学顕微鏡データセットにROIに注釈を付けます。領域を選択したら、TEMで20, 000倍から50, 000倍の倍率で設定された画像タイルを取得します。後処理ソフトウェアで設定された画像タイルを再構築します。電子顕微鏡でDAPIシグナルと蛍光および核の輪郭に基づいて相関を実行します。画像をシフトして正確に重ね合わせ、手動の相関関係を正確に実行します。肝芽腫由来のHEPG2細胞をEBSSで2時間飢餓状態にした後、4%パラアルデヒドで2時間固定した。切片上のLC3とLAMP1のIFイメージングでは、LC3の点点が比較的少なく、LAMP1との共局在がほとんど見られません。IFの分子情報は、DAPIと核外形に基づく2つのイメージングモダリティを重ね合わせることで、電子顕微鏡で得られた超微細構造情報とリンクしました。LC3陽性細胞小器官とEM超微細構造の相関関係から、異なる点状がオートファジーの異なる段階を表していることが明らかになりました。ボックス 1 で例示されている個々の LC3 標識コンパートメントの超微細構造をここに示します。左に相関光電子顕微鏡像、右に疑似着色電子顕微鏡像を示す。内側と外側のオートファゴソーム膜は、白と黒の矢印で示されます。興味深いことに、EMは比較的弱い蛍光斑をLC3陽性オートリソソームとして同定し、この自己リソソームは濃密な内容物と管腔内小胞を特徴としています。これにより、極薄クライオ切片のIFではLC3の視認性が最小限に抑えられていることが明らかになり、分解環境にもかかわらず定常状態のオートリソソームでLC3が検出可能であることが示唆されました。しかし、LC3陽性の点状は主にオートファゴソームを表し、オートリソソームを表すものはほとんどありません。オンセクションCLEMの代わりにイムノゴールドラベリングを行いたい研究者のために、ここで説明するプロトコルとヒントは、イムノゴールドラベリングにも完全に適用できます。我々はまず、少量のエンドソーム制御タンパク質にオンセクションCLEMを適用し、その内因性超微細構造局在を初めて示しました。

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

電子顕微鏡での生体試料の良好な超構造保存のためのサンドイッチ凍結装置を用いた急速凍結

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy