Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Vi takker våre kolleger ved Senter for molekylær medisin ved University Medical Center Utrecht for fruktbare diskusjoner og tilbakemeldinger. Vi takker tidligere og nåværende kolleger fra Klumperman-laboratoriet for å gjøre kontinuerlige forbedringer i våre mikroskopiteknologier. EM-infrastrukturen som brukes til dette arbeidet er en del av forskningsprogrammet National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansiert av det nederlandske forskningsrådet (NWO), prosjektnummer 184.034.014 til JK.

1. Klargjøring av verktøy og reagenser
MERK: For nødvendige reagenser, buffere og løsninger, se tilleggsfil 1 eller 12 for mer informasjon. For detaljer relatert til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen, se materialfortegnelsen.
<ol><li>Fikseringsmidler<ol><li>Forbered 0,2 M fosfatbuffer (PB) eller 0,2 M RØR, HEPES, EGTA, MgSO4 (PHEM) buffer, som beskrevet i tilleggsfil 1, til bruk som base for fikseringsløsninger. MERK: Fikseringsmidler bufres rutinemessig i 0,1 M PB- eller PHEM-buffer for å bufre mot forsuring forårsaket av aldehydreaksjonen med det biologiske materialet.</li>
		<li>Siden kvaliteten på paraformaldehydet (PFA) er nøkkelen til pålitelig fiksering av prøvenes ultrastruktur, bruk EM-grad PFA. For å følge denne protokollen må du bruke 16 % lagerløsninger, fremstilt av PFA-priller av høy kvalitet (se tilleggsfil 1). FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et farlig kjemikalie (faresetninger H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). Når du arbeider med PFA, bruk verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) og arbeid i en kjemisk hette. Avfall som inneholder PFA skal samles inn og destrueres i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.</li>
		<li>Kombiner 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16% PFA (i demineralisert vann [dH 2 O]) og 5 ml dH2Ofor å fremstille en fikseringsløsning på 4% PFA.</li>
		<li>Valgfritt: Tilsetning av 0,02%-0,5% glutaraldehyd (GA) til fikseringsløsningen fra trinn 1.1.3 forbedrer bevaringen av ultrastrukturen, men reduserer prøvens antigenisitet mot mange antistoffer. MERK: Når GA-fiksering er ønsket, bruk EM-grade GA fra en egnet leverandør. FORSIKTIG: Glutaraldehyd er et farlig kjemikalie (faresetninger H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Arbeid i en kjemisk hette og bruk verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) når du manipulerer GA. Avfall som inneholder GA skal samles inn og kastes i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.</li>
	</ol></li>
	<li>Verktøy og materialer<ol><li>Skrap overflaten av aluminiumsprøveholderpinner og sonicate dem i etanol 3 x 10 minutter for å fjerne metallrester og sikre optimal overholdelse når gelatin-innebygde celleblokker er montert på pinnene.</li>
		<li>Bruk en lagringsbeholder som er egnet til å lagre aluminiumsprøveholderpinnene med prøvene i flytende nitrogen (LN2).</li>
		<li>Lag en manipulator ved å feste et enkelt hår eller øyenvippe til enden av et trespyd ved hjelp av neglelakk.</li>
		<li>Lag en hentesløyfe. Bøy en 0,3 mm tykk ståltråd i rustfritt stål rundt en 3 mm diameter rund stang og vri endene sammen og danner en løkke i den ene enden. Sett de vridde endene inn i en pipettespiss. Sett inn et trespyd fra den andre enden og fest med lim eller harpiks. MERK: En hentesløyfe er også kommersielt tilgjengelig (se Materialfortegnelse).</li>
		<li>For å forberede tørkesløyfene, følg de samme trinnene for å lage pickup-sløyfer: Lag en rustfritt ståltråd i en 4 mm sløyfe og fest på en stor pipettespiss med lim eller harpiks.</li>
		<li>Belegg ristene med en tynn støttefilm som formvar (protokoll i tilleggsfil 1). Før bruk, belegg ristene med et tynt lag karbon. MERK: Rutenett som er klare til bruk, er kommersielt tilgjengelige (se Materialfortegnelse). Formvar-belagte rister kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur (RT); karbonbelagte rister kan lagres i flere måneder ved RT.</li>
		<li>Forbered rene glassglass og store dekkslips (24 mm x 24 mm er ideelt med 25 mm brede glasslysbilder), som i 13.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fiksering og prøveklargjøring
<ol><li>Fiksering<ol><li>Bruk fikseringsmiddelet fremstilt i trinn 1.1.3 (4% PFA i 0,1 M PB). For adherente cellelinjer, kultur 1-5 × 10 6 celler i6 cm retter. Legg fiksativet til kulturmediet i forholdet 1: 1 og inkuber prøven i 5 minutter ved RT. Deretter erstattes den mediumfikserende blandingen med fikseringsmiddel og inkuberes i 2 timer ved RT. MERK: Eksakte celletall, sammenløp og kulturforhold kan variere i henhold til modellsystemet som brukes.</li>
		<li>Oppbevar prøvene over natten eller i opptil 3-4 uker i 0,5% PFA i 0,1 M PB ved 4 °C. MERK: GA kan legges til fikseringen (se trinn 1.1.4) og fikseringslengden kan endres for å finne en optimal balanse mellom bevaring av morfologi og antigenisitet, som varierer per prøve og merking. For mer informasjon, se14.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksempel på innebygging<ol><li>Vask fatet med faste celler 3x med PBS på RT. Deretter erstattes med PBS som inneholder 0,15% glycin og inkuberes i 10 minutter ved RT.</li>
		<li>Bytt ut PBS inneholdende 0,15% glycin med 1% gelatin i PBS forvarmet til 37 ° C, og skrap og overfør cellene i 1% gelatin til et mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved 6000 × g i 1 min ved RT i en mikrosentrifuge. Fjern deretter 1% gelatin uten å forstyrre pelleten og tilsett 12% gelatin oppvarmet til 37 °C. Resuspender cellepelleten ved å pipettere forsiktig opp og ned med pipettespisser eller glasspasteurpipetter forvarmet til 37 °C.</li>
		<li>Inkuber ved 37 °C i 10 minutter; Deretter pelleterer du cellene ved 6000 × g i 1 min. Stivn gelatinen på is i 30 min.</li>
		<li>For å fjerne de gelatininnebygde cellene fra røret, kutt rørenden som inneholder pelleten av fra resten av røret med et barberblad. Deretter, vinkelrett på det første kuttet, kutt rørenden med cellepelleten i to.</li>
		<li>Inkuber de to rørendehalvdelene som inneholder den gelatininnebygde cellepelleten i 2,3 M sukrose i 10 minutter ved 4 °C. Dette fører til at de gelatininnebygde cellepelletshalvdelene krymper litt og løsner fra plastrøret. MERK: De gelatininnebygde cellepellets bør holdes ved 4 °C eller iskalde så mye som mulig for å unngå at 2,3 M sukrose blir for tyktflytende og gelatinen for myk. Under manipulering av de gelatininnebygde cellepellets i de neste trinnene, arbeid med bare en prøve om gangen og hold de andre på is, eller arbeid i et kaldt (~ 4 ° C) rom. Unngå overoppheting av de gelatininnebygde cellepellets ved sollys, varme mikroskoplamper eller andre varmekilder.</li>
		<li>Fjern rørhalvdelene med den gelatininnebygde cellepelleten fra 2,3 M sukrose. Fjern deretter de gelatininnebygde cellepelletshalvdelene fra plastrørhalvdelene med pinsett. Klipp pelleten manuelt til blokker av passende størrelse (~1 mm3) med et barberblad. Bruk et stereodissekerende mikroskop for å forstørre motivet under skjæringen.</li>
		<li>Tilsett de gelatininnebygde celleblokkene med 2,3 M sukrose i 3-16 timer, snu ende-over-ende i en rotor ved 4 ° C.</li>
		<li>Plasser en gelatininnebygd celleblokk på en aluminiumsprøveholderpinne (se trinn 1.2.1). La det være nok 2,3 m sukrose rundt kantene på blokken slik at den danner en tynn "krage" mellom blokken og tappen. Unngå for mye 2,3 M sukrose som dekker toppen av blokken. Snap-frys og lagre i LN2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Seksjonering
<ol><li>Trimming (se også12)<ol><li>Ta en pinne med en blokk med gelatin-innebygde celler ut av LN2-lagring og plasser den inne i et kryomikrotomsett satt til -80 ° C.</li>
		<li>Trim fronten av blokken for å flate overflaten og oppnå ~ 250 nm seksjoner. Dypp den 3 mm sløyfen i pickup-løsningen (1:1 2,3 M sukrose og 2 % metylcellulose), sett sløyfen inn i kryokammeret til mikrotomen, og vent til det begynner å danne seg is i dråpen (typisk 5-7 s). Deretter tar du straks opp seksjonen ved å trykke dråpen raskt, men forsiktig mot dem. Fjern sløyfen fra kryokammeret, vent til dråpen har tint helt, og trykk dråpen på et glassglass.</li>
		<li>Kontroller celleorienteringen ved toluidinblå farging av seksjonene.<ol><li>Legg en dråpe toluidinblå oppløsning (se tilleggsfil 1) på toppen av seksjonene på et glassglass og tørk på en varmeplate på 80 °C til kantene på dråpen er tørre.</li>
			<li>Fjern glassglasset fra varmeplaten og skyll forsiktig toluidinblått bort med dH2O, og samle det i en egnet avfallsbeholder.</li>
			<li>Tørk glassglasset og sjekk celleretningen i seksjonene gjennom et enkelt, benkaktig lysmikroskop.</li>
		</ol></li>
		<li>Trim sidene av blokken ved å seksjonere 50-100 μm inn i siden av prøveblokkflaten med knivhjørnet. Trim fire sider av prøveblokkflaten ved å dreie prøveholderen 90° etter å ha trimmet hver side for å lage et utstikkende ~250 μm x 375 μm rektangel. Merk det utstikkende området basert på celleretningen som ble bestemt i forrige trinn.</li>
	</ol></li>
	<li>Seksjonering og henting<ol><li>Avkjøl kryomikrotomet til -100 °C. Seksjon et bånd fra det utstikkende rektangelet, seksjonene er 70-90 nm tykke og med en sølvfarget gylden glans. Før seksjonene bort fra diamantknivens kant med et hår på en pinne (se pkt. 1.2.3) for å lage et langt (2-5 mm) bånd.</li>
		<li>Når et passende bånd har dannet seg, stopper du seksjoneringen for å plukke opp båndet. Dypp 3 mm pickup-sløyfen i 2,3 M sukrose og 2 % metylcellulose blandet 1:1, sett sløyfen inn i kryokammeret til mikrotomen, og vent til dråpen begynner å fryse (vanligvis 5-7 s). Deretter tar du straks opp seksjonene ved å trykke dråpen raskt men forsiktig mot dem. Fjern sløyfen fra kryokammeret, vent til dråpen har tint helt, og trykk dråpen på et forberedt rutenett (trinn 1.2.6). MERK: Rister med seksjoner kan oppbevares ved 4 °C i flere måneder.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Merking og lysmikroskopi
<ol><li>Merking<ol><li>Plasser ristene med seksjoner (figur 1A) med seksjonssiden ned på ~ 1 ml PBS i en liten tallerken eller flerbrønnsplate. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter. MERK: Dette trinnet fjerner gelatinen som er mellom cellene; Gelatin er ikke nødvendig etter seksjonering og forstyrrer den gjenværende protokollen.</li>
		<li>Behandle rutenettene med snittsiden ned på ~75 μL dråper på parafilm (se figur 1B). Start med PBS + 0,15% glycinvask (3 x 2 min) ved RT. Deretter inkuberer ristene med 0,1% bovint serumalbumin (BSA)-c + 0,5% fiskeskinngelatin (FSG) i PBS i 10 min ved RT som blokkeringstrinn. Fortynn primære antistoffer i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuber ristene på ~ 10 μL dråper av denne løsningen i 1 time ved RT (figur 1C).</li>
		<li>Vask ristene i 0,1% BSA i PBS 5x ved RT. Deretter fortynnes sekundære antistoffer og 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 10 μg / ml) i 0,1% BSA-c + 0,5% FSG i PBS og inkuberer ristene på ~ 10 μL dråper av denne løsningen i 30+ min ved RT (figur 1C). Vask ristene i PBS 5x ved RT. MERK: Eventuelt kan et sekundært antistoff merkes med 5, 10, 15 eller 20 nm kolloidale gullpartikler konjugert til protein A (PAG) for lokalisering av proteinet av interesse i EM. Hvis dette er ønskelig, inkuber ristene med PAG i 20 minutter ved RT etter trinn 4.1.3. Vask deretter 5x med PBS ved RT. Unngå samtidig bruk av flere primære antistoffer og legg merke til reaktiviteten til PAG til forskjellige arters IgG for å forhindre uønskede kryssreaksjoner. For mer informasjon, se12.</li>
	</ol></li>
	<li>Monteringsprøver for lysmikroskopi<ol><li>Senk ristene i 50% glyserol i dH 2 O2x 5 min ved RT. Sandwich ristene mellom en glasslip og coverslip i 50% glyserol, ett rutenett per coverslip, med seksjoner mot dekselet (figur 1D). MERK: Kvaliteten på merkingen kan forringes når rister holdes montert i 50% glyserol i mer enn 30 minutter. Det anbefales derfor å montere og avbilde to eller tre rister om gangen og la de andre stå på den sekundære merkeløsningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lysmikroskopi<ol><li>Ta et glassglass med klemte rister til et bredfeltmikroskop med et automatisert stadium. Velg et oljemål med høy forstørrelse (63x eller 100x). Opprett et bildeflissett av (deler av) båndet med inndelinger (figur 1E). MERK: Noen sekundære antistoffer kan danne fluorescerende aggregater på rister, spesielt rundt folder eller rifter i seksjonene. I tillegg inneholder noen celletyper og vev autofluorescerende strukturer. Hvis slike problemer forventes, anbefales det å inkludere et negativt kontrollgitter som ikke inkuberes med primært antistoff.</li>
	</ol></li>
	<li>Avmontering og EM-kontrast<ol><li>Tilsett 10 μL dH2O på siden av glassdekselsandwichen og vent på kapillærvirkning for å fylle glassdekselets sandwichgrensesnitt. Fjern forsiktig dekselet uten å blande nedsenkningsolje i glyserol. Hent ristene med pinsett og senk ned i dH2O 3x ved RT for å vaske av 50% glyserol. MERK: Olje kan forstyrre uranylfarging og forringe EM-kontrast.</li>
		<li>Tørk forsiktig baksiden av rutenettet med lofritt silkepapir. MERK: Hvis prøven også ble merket med kolloidale gullpartikler, utfør følgende trinn: plasser rutenettet med seksjoner med seksjonssiden ned på PBS-dråper og vask 2x ved RT. Postfix i 1% GA i 5 min ved RT (se forsiktighetsmerknad under 1.1.4). Vask i PBS 2x på RT.</li>
		<li>Plasser ristene med seksjonssiden ned på dH2O dråper og vask 8x på RT.</li>
		<li>For å farge seksjonene for kontrast i EM, inkuber med uranylacetat (UA), pH 7, i 5 minutter ved RT (figur 1F).</li>
		<li>Før du plasserer ristene, avkjøl UA:metylcellulose, pH 4, ved å plassere dråper på parafilm på en metallplate på is. Vask deretter ristene med iskald UA: metylcellulose, pH 4, 2x og inkuber med iskald UA: metylcellulose, pH 4, i 10 minutter (figur 1F). FORSIKTIG: Uranylacetat er et farlig kjemikalie (faresetninger H300, H330, H373, H411). I trinn som krever UA, arbeid i en kjemisk hette og bruk verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller). Samle inn og deponere UA-holdig avfall i henhold til instituttenes retningslinjer og forskrifter.</li>
		<li>Sløyfe ristene ved å sette inn en rutenetttørkesløyfe i UA:metylcellulosedråpen under gitteret og løft den forsiktig til gitteret trekkes av dråpen12. Fjern overflødig UA: metylcellulose ved å berøre sløyfen i en ~ 60 ° vinkel (seksjoner vendt ned) på lofritt filterpapir (se materialfortegnelse) og dra det sakte langs papiret til ikke mer UA: metylcellulose absorberes. Plasser deretter sløyfen med risten i et passende stativ og la tørke i >10 min ved RT (figur 1G).</li>
	</ol></li>
</ol>5. EM
<ol><li>Bruk oversikten fra lysmikroskopi til å lokalisere et interesseområde (ROI) for avbildning i transmisjonselektronmikroskopet (TEM; Figur 1H). Kommenter avkastningen på lysmikroskopidatasettet. Når et område er valgt, får du et bildeflissett ved 20 000x-50 000x forstørrelse i TEM. Rekonstruer bildeflissettet i etterbehandlingsprogramvare15,16.</li>
</ol>6. Korrelasjon og analyse
<ol><li>Last inn lysmikroskopien og EM-datasettet i egnet bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ/Fiji17, ec-CLEM-plugin-modulen i Icy18 eller Photoshop. Beskjær og roter lysmikroskopidatasettet slik at det samsvarer med EM-flissettet.<ol><li>Utfør korrelasjonen basert på DAPI-signal i fluorescens og nukleære konturer i EM (figur 1I). Skift bildene for å legge dem nøyaktig og utfør den manuelle korrelasjonen nøyaktig. For å gjøre tilnærmingen mer nøyaktig, bruk landemerkebasert korrelasjon gjennom for eksempel ec-CLEM-plugin i Icy eller BigWarp-plugin i ImageJ, for å korrelere bildene gjennom manuelt valg av tilsvarende punkter. En detaljert, trinnvis protokoll for korrelasjon med ec-CLEM er tilgjengelig19. MERK: Denne tilnærmingen fungerer også godt med bruk av bimodale fiducial prober20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser de korrelerte bildene ved å velge avkastning basert på fluorescerende signal i et passende program (f.eks. ImageJ). For kvantitativ analyse, opprett en samling avkastning for alle merkede organeller. Deretter inspiserer du den tilsvarende ultrastrukturen til de enkelte avkastningene og klassifiserer dem basert på morfologiske elementer.</li>
</ol>

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.

Metoden som presenteres her utnytter nylige fremskritt innen kryoseksjonsbasert CLEM på seksjonen - den høye følsomheten til IF-merking og nøyaktig (<100 nm feil) korrelasjon mellom FM og EM14,24. Dette resulterer i en metode med følsomhet for fluorescerende etikettknappe, endogene proteiner og evnen til å legge dette med høy presisjon til EM-ultrastrukturen. Dermed unngår denne metoden behovet for (over) ekspresjon av eksogent merkede proteiner og bruk av mindre følsomme EM-etiketter. Gjennomførbarheten av metoden er vist ved eksempler på CLEM på endogen LC3 i sultede celler, uten bruk av lysosomale hemmere.
Tinte kryoseksjoner oppnådd med Tokuyasu-metoden er ideelle prøver for immun-EM, da de i motsetning til harpiksseksjoner er gjennomtrengelige for antistoffer. Kombinert med milde fikserings- og kontrasteringsprosedyrer, gir dette generelt suveren merkeeffektivitet i forhold til andre metoder uten at det går ut over den detaljerte ultrastrukturen, og visualiserer cellemembraner på en utmerket måte 12,25,26. Videre er kryoseksjoner svært kompatible med fluorescensmikroskopi, noe som gjør dem til verdifulle substrater for CLEM. Både klassisk immungullmerking og CLEM på kryoseksjoner har gitt banebrytende innsikt i å forstå subcellulær organisasjon 14,27,28,29,30.
For tiden blir anvendelser av CLEM på tinte kryoseksjoner stadig mer utbredt, som et resultat av kontinuerlig utvikling og optimalisering 14,20,24,31,32,33,34 som har forbedret kvaliteten, anvendeligheten og nøyaktigheten av tilnærmingen. Nå, ved nøyaktig korrelasjon av store IF- og EM-bildefliser, letter teknikken screening for ultrastrukturen til fluorescerende merkede endogene cellulære komponenter 14,32,33. Dette er en fordel i forhold til klassisk immuno-EM, hvor søket etter gullmerkede strukturer vanligvis krever høy forstørrelse og derfor er mer arbeidskrevende og tidkrevende. Det er av denne grunn at lokalisering av LC3 til ultrastrukturen har stor nytte av CLEM. LC3-positive organeller er vanlige når autofagisk clearance er blokkert (dvs. når celler behandles med BafA1 eller pH-hevende midler), mens autofagiske organeller raskt ryddes i uendrede eller sultede celler, noe som resulterer i svært lave stabile nivåer. Under slike forhold kan det være utfordrende å finne LC3-merkede organeller ved hjelp av klassisk immun-EM, og CLEM gir en klar fordel.
Tidligere ble CLEM på harpiksseksjoner brukt i studier ved bruk av ektopisk uttrykk av LC3-GFP eller en LC3-GFP-RFP tandemsonde 35,36,37,38,39. I disse studiene ble fluorescensavbildning utført før embedding eller direkte i akrylharpiksseksjon40, og prøver ble deretter screenet av EM. Det er flere fordeler med harpiksinnebygging; Den autofagosomale ultrastrukturen er generelt godt bevart, spesielt hvis materialet er høytrykksfrosset40. Videre er kontrasten av tungmetallfarget harpiksinnebygd materiale generelt mer uttalt enn for uranylfargede kryoseksjoner. Harpiks-innebygde seksjoner er kompatible med volumetriske EM-metoder, for eksempel array-tomografi, FIB-SEM eller seriell blokkeringsflate SEM, mens kryoseksjoner ikke er det. I tilnærminger som utfører avbildning før innebygging, er levende celleavbildning et alternativ41 som ikke er tilgjengelig i CLEM på kryoseksjoner. Den viktigste fordelen med CLEM på kryoseksjoner over disse alternativene er det høye IF-signalet, noe som muliggjør immunlokalisering av sjeldne proteiner uten behov for membranpermeabilisering eller overekspresjon. Dette unngår potensiell membranekstraksjon, overekspresjonsartefakter42 og genetisk modifisering av motivet, som kombinert med muligheten til å korrelere store områder i IF og EM, gjør det til et utmerket verktøy for å studere LC3 og autofagi.
Her viste anvendelsen av CLEM på seksjonen til sultede HEPG2-celler at LC3 overveiende lokalisert til strukturer identifisert som autofagosomer. I tillegg ble det funnet noen få svakt fluorescerende flekker i autolysosomer. Dette står i direkte kontrast til celler behandlet med BafA19 og reflekterer den raske nedbrytningen av autofagosomale proteiner når autofagosomet smelter sammen med lysosomer. Samlet sett viste dataene at CLEM av tinte kryoseksjoner kan gi innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold. Dataene fremhever også følsomheten til teknologien, siden LC3 ble oppdaget selv i autolysosomer som bare inneholder lave nivåer av intakte LC3-epitoper. Videre anvendelse av denne teknikken ved avbildning av LC3 i forskjellige modeller og forhold vil forbedre vår forståelse av autofagi og andre LC3-medierte biologiske prosesser, som LC3-assosiert fagocytose eller konjugering av ATG8 til enkeltmembraner.
Utover autofagi kan CLEM på snitt brukes på andre sjeldne hendelser eller strukturer, som celledeling, infeksjon, sjeldne celletyper i vev, kinetokorer, primære flimmerhår eller celletypespesifikke organeller. Effektiv screening for emnet av interesse av IF kan i stor grad lette den ultrastrukturelle studien av disse sjeldenhetene. Videre ble det vist14 at teknikken kan brukes til å lokalisere proteiner på en mer sensitiv måte enn klassisk immun-EM. Justering av fikseringslengden kan ytterligere forlenge denne følsomheten, noe som muliggjør ultrastrukturell lokalisering av svært lite rikelig eller dårlig antigene proteiner. Endelig letter CLEM-metoden på seksjonen raskt utvalg av et kvantitativt antall organeller, noe som letter en mer robust analyse av den ultrastrukturelle fordelingen av et gitt protein.
CLEM på kryoseksjoner krever utstyr og ekspertise for kryoseksjonering. I grupper med tilgang til disse verktøyene (f.eks. kryomikrotomer), er implementeringen av CLEM på seksjonen enkel og krever bare tilgjengeligheten av et automatisert bredfeltmikroskop, et oppsett de fleste laboratorier har tilgang til. Videre er metoden tilgjengelig i EM-anlegg over hele verden. Siden CLEM på seksjon kombinerer anvendelse av etablerte IF- og EM-metoder, er metoden lett tilpasset og kan kombineres med for eksempel tomografi 20,33,43, seriesnittvolum EM av et begrenset antall seksjoner 44, eller superoppløsningsmikroskopi 45. Denne allsidigheten av metoden støtter applikasjoner til et bredt spekter av biologiske spørsmål.

Autofagi er en nøkkelprosess for rensing og resirkulering av cytoplasmatiske proteiner og organeller. Prosessen med makro-autofagi (heretter kalt autofagi) involverer dannelsen av dobbeltmembranorganeller, autofagosomer, som gjør det mulig for celler å omslutte cytoplasmatiske molekyler og organeller for lysosomal nedbrytning. Autofagi forekommer på basalnivå i de fleste celler og oppreguleres som respons på cellulære forhold, som sult eller cellulær stress. Autofagi forekommer enten på en substratspesifikk måte, rettet mot spesifikke strukturer eller proteiner for nedbrytning, eller som en ikke-selektiv bulkprosess som omfatter deler av cytosolen. I selektiv autofagi dannes autofagosomer ved konjugering av proteiner i Atg8-familien (mikrotubuliassosierte proteiner 1A/B lettkjede 3A/B/C [LC3] og GABARAPs) til membraner avledet fra resirkulering av endosomer, Golgi, og/eller endoplasmatisk retikulum (ER)1. LC3 gjenkjenner autofagisk last i cytosolen direkte eller via selektive autofagiadaptere som P62/SQSTM. Nye autofagiske membraner kan deretter konjugeres til LC3, utvide seg og smelte sammen for å danne en fullført dobbeltmembran som omslutter lasten kalt autofagosomet. Autofagosomet modnes og smelter til slutt sammen med et endosom eller lysosom, hvoretter den autofagiske lasten og adapterne brytes ned2.
Studier av autofagosomdannelse, modning og fusjon benytter ofte lysmikroskopiteknologier. Fluorescensmikroskopi av LC3 brukes vanligvis til å vurdere antall og cellulær lokalisering av autofagosomer under forskjellige forhold. Videre, ved å koble LC3 til pH-sensitiv GFP og pH-stabil RFP i en såkalt tandemprobe, kan den totale fluksen av autofagi måles i levende celler som en funksjon av GFP-fluorescenstap3. Disse tilnærmingene er verdifulle verktøy for forskere for å forstå autofagiens rolle og mekanisme under forskjellige forhold. Et annet uvurderlig verktøy er elektronmikroskopi (EM), som avslører ultrastrukturen til autofagiske organeller på forskjellige stadier av autofagi 4,5,6,7,8. Til dags dato er EM fortsatt den valgte metoden for å identifisere de nøyaktige stadiene av autofagosomdannelse ved å diskriminere forskjellige autofagiske membraner ved morfologi: fagofor (dobbeltmembran ikke helt lukket), autofagosom (lukket dobbeltmembran rundt cytosolisk last) og autolysosom ([delvis] tap av den indre autofagiske membranen). Morfologi uten molekylær informasjon kan imidlertid være utsatt for feilidentifikasjon eller tvetydighet. Immuno-EM er den mest omfattende metoden for samtidig molekylær karakterisering og morfologisk klassifisering av autofagiske organeller. For eksempel tillater immungullmerking av LC3 på tinte kryoseksjoner ultrastrukturell lokalisering av LC3 og presis identifisering av LC3-merkede organeller9.
En ulempe med EM er det lille synsfeltet som følger med den høye forstørrelsen som kreves for å observere den fine ultrastrukturen av autofagiske membraner og, når det gjelder immuno-EM, for å finne etiketten som markerer proteinet av interesse. På grunn av deres knapphet og lave proteinnivåer, hemmer dette generelt den kvantitative EM-analysen av autofagosomer. For å øke antall autofagosomer, blir celler ofte sultet og behandlet med Bafilomycin A1 (BafA1), en hemmer av lysosomal forsuring og nedbrytning. Uten BafA1-behandling er søket etter autofagosomer ved EM tidkrevende, på grunn av mangelen på disse organellene. Metoden som presenteres i dette manuskriptet løser dette problemet gjennom fluorescerende merking og avbildning av endogent LC3 på tinte kryoseksjoner i et fluorescensmikroskop før videre forberedelse til EM. De fluorescerende bildene styrer deretter søket etter LC3-merkede strukturer i EM. Etter innsamling er EM-bilder korrelert med fluorescensbildene for å legge til molekylær informasjon - tilstedeværelsen av LC3 - til cellens ultrastruktur. Denne "on-section CLEM"-metoden øker i stor grad evnen til å finne LC3-merkede strukturer, spesielt under ubehandlede forhold, for senere identifisering og klassifisering av EM.
Denne metoden ble brukt på sultet hepatoblastom-avledet HEPG210-celler for å finne autofagosomer i uendrede (dvs. ingen BafA1 ble brukt) forhold. Relativt få fluorescerende puncta (mindre enn en per celleprofil i en 90 nm seksjon) ble funnet, noe som er i samsvar med den høye omsetningen av LC311. Denne sparsomheten av LC3-puncta understreket verdien av CLEM; Ved å velge regioner med flere fluorescerende puncta for avbildning i EM, ble LC3-positive organeller funnet og karakterisert på en mye mer effektiv måte enn gjennom konvensjonell immun-EM. Dette viste at flertallet av LC3-positive organeller var autofagosomer, som definert av deres morfologi, som er i motsetning til resultatene oppnådd i BafA1-behandlede celler, hvor autolysosomer er vanligere9. Disse dataene viser at med CLEM, kan autofagi studeres på ultrastrukturelt nivå uten å måtte hemme autofagisk strømning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

Visualisering av autofagiske organeller på ultrastrukturelt nivå ved elektronmikroskopi (EM) er avgjørende for å etablere sin identitet og avsløre detaljer som er viktige for å forstå den autofagiske prosessen. Imidlertid mangler EM-metoder ofte molekylær informasjon, noe som hindrer korrelasjonen mellom ultrastrukturell informasjon oppnådd av EM til fluorescensmikroskopibasert lokalisering av spesifikke autofagiproteiner. Videre hemmer sjeldenheten av autofagosomer i uendrede cellulære forhold undersøkelse av EM, noe som krever høy forstørrelse, og gir dermed et begrenset synsfelt.
Som svar på begge utfordringene ble en korrelativ lyselektronmikroskopi (CLEM) -metode basert på fluorescerende merking anvendt for å korrelere en vanlig autofagosomal markør, LC3, til EM-ultrastruktur. Metoden ble brukt til raskt å screene celler i fluorescensmikroskopi for LC3-merking i kombinasjon med andre relevante markører. Deretter ble de underliggende ultrastrukturelle egenskapene til utvalgte LC3-merkede flekker identifisert av CLEM. Metoden ble brukt på sultede celler uten å tilsette hemmere av lysosomal surgjøring.
Under disse forholdene ble LC3 funnet hovedsakelig på autofagosomer og sjelden i autolysosomer, hvor LC3 raskt nedbrytes. Disse dataene viser både gjennomførbarheten og sensitiviteten til denne tilnærmingen, og viser at CLEM kan brukes til å gi ultrastrukturell innsikt i LC3-mediert autofagi under opprinnelige forhold - uten medikamentell behandling eller genetiske endringer. Samlet sett presenterer denne metoden et verdifullt verktøy for ultrastrukturelle lokaliseringsstudier av autofagiproteiner og andre knappe antigener ved å bygge bro mellom lysmikroskopi og EM-data.

En optimalisert immuno-EM-protokoll for immun-gullmerking av LC3 på ultratynne kryoseksjoner ble nylig publisert av De Maziere et al.9. Denne studien inkluderte utsultede tilstander uten BafA1, der LC3 var til stede, men relativt sjelden og vanskelig å finne ved EM. En CLEM-metode på seksjonen ble introdusert i en egen studie, som bruker følsomheten til fluorescensmerking for å visualisere relativt sjeldne og lavt uttrykte endogene proteiner og korrelere dette til EM-ultrastruktur14. Her kombineres disse to tilnærmingene ved bruk av den optimaliserte LC3-merkingsprotokollen som en del av en CLEM-tilnærming.
HEPG2-celler, leveravledede celler med relativt høye nivåer av basal autofagi22, ble sultet i minimalt medium (Earles balanserte saltløsning [EBSS]) i 2 timer før fiksering i 4% PFA. Dette ble etterfulgt av prøvepreparering ved Tokuyasu-metoden for ultratynn kryoseksjonering (seksjon 1-3; se Slot og Geuze12), som er svært kompatibel med CLEM 14,23 på seksjonen. Tinte kryoseksjoner ble fluorescerende merket (protokoll pkt. 4 og figur 1) ved bruk av musens anti-LC3 primære antistoff9. I tillegg ble kaninanti-LAMP1 brukt til å indikere endo-lysosomer, etterfulgt av anti-mus AlexaFluor488 og antikanin AlexaFluor568 sekundære antistoffer. Rutenett ble klemt mellom en coverslip og glass lysbilde og avbildet på RT på et widefield mikroskop (100x 1.47 NA olje objektiv, sCMOS kamera).
En fordel med fluorescensmerking av tynne seksjoner over konvensjonell helcelle IF er den økte oppløsningen i Z, siden den fysiske tykkelsen på seksjonen er 60-90 nm. Med denne forbedrede Z-oppløsningen avslører fluorescensmerkingen av LC3 og LAMP1 på tynne seksjoner svært lite samlokalisering (figur 2A). I celler behandlet med lysosomale hemmere, som BafA1, oppstår høy kolokalisering, siden lysosomalt lukket LC3 forblir udegradert9. I ubehandlede celler nedbrytes LC3 raskt ved kontakt med enzymatisk aktive, LAMP1-positive lysosomer, og derfor er samlokalisering sjelden ved disse tilstandene. Generelt ble mindre enn én LC3-punctum per celleprofil observert. Dette indikerer at selv i sultede forhold er omsetningen av autofagosomer rask, og holder autofagosomtallene lave. Det understreker også viktigheten av å bruke CLEM for å finne de sjeldne LC3-merkede strukturene, ved hjelp av det store synsfeltet som lysmikroskopi gir. Videre gjør den høyere følsomheten for fluorescensmerking i forhold til gullmerking det mulig å identifisere flere LC3-positive organeller enn i konvensjonell immuno-EM, noe som ytterligere hjelper deres karakterisering.
Etter å ha anskaffet et fullt flissett av båndet av seksjoner, ble ristene hentet fra mikroskopet og etterfarget for EM ved hjelp av UA og loop-out-metoden (protokolltrinn 4.4-4.6; Figur 1F,G). Denne "loop-out" -metoden sikrer at et tynt lag UA: metylcellulose forblir på rutenettet, noe som skaper ønsket kontrast i EM. Tykkelsen på laget avhenger av hastigheten og vinkelen som UA:metylcellulosen skylles av på filterpapiret. Hvis du drar sløyfen for raskt, kan det bli for mye UA:metylcellulose på rutenettet og gjøre utseendet til seksjonene i EM mørkere. Å dra for sakte kan trekke bort for mye UA:metylcellulose, noe som resulterer i for lite flekker og dårlig morfologi, og risikerer at rutenettet faller ut av sløyfen. 'Oil slick' coloring (figur 1G) på tørre rister indikerer en passende UA: metylcelluloselagtykkelse.
Etter loop-out og tørking ble ristene avbildet i en TEM ved ROI valgt av fluorescens. IF- og EM-datasettene ble korrelert ved å legge DAPI-signalet til konturene av kjerner som er synlige i EM, og generere et integrert bilde som inneholder informasjon om begge modaliteter.
Å finne samme område i EM som valgt i IF kan være utfordrende. Det anbefales derfor å ha et oversiktsbilde av IF-flisen for hånden når du søker i EM. Brukere bør se etter gjenkjennelige funksjoner i begge modaliteter, for eksempel bretter eller rifter i seksjonene, rutenettstengene eller arrangementet av kjerner. Det er også viktig å huske på at prøven kan vises rotert og speilet i EM. 'Finder-rutenett' med spesifikke funksjoner for å identifisere områder kan brukes til å lette korrelasjonen (se Materialfortegnelse).
Korrelasjon mellom LC3-positive organeller og EM-ultrastruktur viste at de forskjellige punctaene representerte forskjellige stadier av autofagi (figur 2B). Selv om bevaring av autofagosomal ultrastruktur er utfordrende i kryoseksjoner, ble organeller med cytoplasmatisk innhold og doble membraner ofte observert (figur 2C, piler i organeller 1-5; Tilleggsfigur S1), som definerer morfologiske trekk ved autofagosomer. Interessant nok ble ganske svake fluorescerende flekker identifisert av EM som LC3-positive autolysosomer (figur 2C, organelle 6; autofagisk innhold er merket *), preget av tett innhold og intraluminale vesikler. Dette viste at svært små mengder LC3 er synlige i IF av ultratynne kryoseksjoner, og indikerte at til tross for det nedbrytende miljøet, er noen LC3 detekterbare i steady-state autolysosomer. Imidlertid representerte flertallet av LC3-positive puncta autofagosomer, mens autolysosomer var svært sjeldne. Dette i motsetning til BafA1-behandlede celler, som primært akkumulerer autolysosomer og ikke autofagosomer9.
Oppsummert beskriver denne protokollen en CLEM-metode på seksjonen for å koble molekylær informasjon oppnådd ved fluorescensmikroskopi til ultrastrukturen til EM. Denne metoden øker følsomheten til immuno-EM, siden bare fluoroforer brukes til merking, og disse gir generelt mer signal enn EM-sonder. Metoden er spesielt egnet for bruk av ultratynne kryoseksjoner, hvor høye nivåer av spesifikk fluorescens over ubetydelig bakgrunnsfarging kan oppnås. Ved å bruke fluorescens for å screene for sjeldne strukturer eller hendelser og korrelere utvalgte avkastninger til EM, kan EM-driftstiden og tilhørende kostnader reduseres kraftig. Sensitiviteten og gjennomførbarheten av metoden er demonstrert ved visualisering av LC3 i ubehandlede, sultne celler, som viser at LC3 hovedsakelig assosierer med autofagosomer under disse forholdene, med svært lave nivåer synlige i autolysosomer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over CLEM . (A) Kryoseksjoner fra gelatin-innebygde celler samles på et formvarbelagt kobbergitter. (B) Rister behandles seksjon ned på dråper av de aktuelle løsningene. (C) Rister er merket med primære og fluorescerende sekundære antistoffer. (D) Rister er klemt mellom et deksel og glassglass i 50% glyserol. (E) Fluorescensbilder samles i et bredfeltsmikroskop. (F) Rister hentes fra glassglasset og behandles videre ved uranylfarging for EM. (G) Etter tørking kan ristene avbildes av TEM. (H) Høy forstørrelse TEM-bildeflissett er hentet fra et område valgt fra fluorescensdata. (I) Bilder fra fluorescensmikroskopi og EM er korrelert og overlagt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figur 2: CLEM av LC3 og LAMP1 i sultede HEPG2-celler. HEPG2-celler ble sultet i 2 timer i EBSS før fiksering med 4% PFA i 2 timer. (A) IF-avbildning av LC3 (grønn) og LAMP1 (rød) på seksjoner viser relativt få LC3-puncta og liten samlokalisering med LAMP1. (B) Kobling av molekylær informasjon fra IF (venstre panel) til den ultrastrukturelle informasjonen oppnådd i EM (midtpanel) ved å legge over de to avbildningsmodalitetene basert på DAPI og nukleære konturer (stiplede linjer, høyre panel). Ultrastrukturen til de enkelte LC3-merkede rommene, som eksemplifisert ved boks 1 (høyre panel), er vist i C. (C) Ultrastruktur av LC3-positive rom. CLEM-bilder vises til venstre og pseudofargede (beige) EM-bilder til høyre (ufargede EM-bilder vises i tilleggsfigur S1). Indre og ytre autofagosomale membraner er indikert med henholdsvis hvite og svarte pilehoder. Det autofagiske innholdet inne i autolysosomet i eksempel 6 er indikert med *. Skalastenger = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfigur S1: Ufargede EM-bilder av LC3-positive organeller. (VG Nett) Ufargede EM-bilder av pseudofargede eksempler 1-6 vist i figur 2C. Organellene ble selektert ved LC3-fluorescens, som beskrevet for figur 2. Indre og ytre autofagosomale membraner er indikert med henholdsvis hvite og svarte pilehoder. Det autofagiske innholdet inne i autolysosomet i eksempel 6 er indikert med *. Skalastenger = 200 nm. Forkortelser: AL = autolysosom; AP = autofagosom; M = mitokondrion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 1: Buffere og løsninger brukt i denne studien. Denne tilleggsfilen inneholder oppskriftene og protokollene som trengs for å lage bufferne og løsningene som brukes i denne studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Her presenterer vi en protokoll for optimalisert korrelativ lyselektronmikroskopi basert på endogen, fluorescerende merking som et verktøy for å undersøke lokalisering av sjeldne proteiner i forhold til cellulær ultrastruktur. Kraften i denne tilnærmingen er demonstrert ved ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 i sultede celler uten Bafilomycin-behandling.

Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 ved korrelativ lyselektronmikroskopi på snittet

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Lokalisering av proteiner i sammenheng med cellens ultrastruktur har vært et kraftig forskningsverktøy i flere tiår. Med denne protokollen utvidet vi proteinene som er lave i overflod eller vanskelige å finne. Vi bruker fluorescensmikroskopi for å merke proteiner på en sensitiv og screenbar måte og kombinere den med elektronmikroskopi for å fylle cellens ultrastruktur.Her vil vi demonstrere CLEM på autofagiproteiner, men det kan virkelig brukes på ethvert biologisk spørsmål der cellens ultrastruktur er av interesse, spesielt i studiet av sjeldne hendelser. Demonstrere prosedyren med meg vil være Tineke Veenendaal, en senior forskningstekniker fra laboratoriet vårt. For å begynne, erstatt PBS som inneholder 0,15% glycin med 1% gelatin i PBS forvarmet til 37 grader Celsius.Skrap og overfør cellene i gelatin til et mikrosentrifugerør. Pellet cellene ved 6.000 g i ett minutt ved romtemperatur i en mikrosentrifuge og fjern deretter gelatinen uten å forstyrre pelleten. Tilsett 12 % gelatin oppvarmet til 37 grader Celsius i pelleten og resuspender forsiktig ved pipettering med pipettespisser eller glasspastepipetter forvarmet til samme temperatur.Inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter og pellet deretter cellene ved 6.000 G i ett minutt. Stivne gelatinen på is i 30 minutter. For å fjerne de gelatininnebygde cellene fra røret, kutt rørenden som inneholder pelleten av fra resten av røret med et barberblad.Klipp deretter rørenden med cellepelleten i to vinkelrett på det første kuttet. Plasser de to rørendehalvdelene som inneholder cellepelleten i 2,3 molar sukrose og inkuber i 10 minutter ved fire grader Celsius. Dette fører til at cellepelletshalvdelene krymper litt og løsner fra plastrøret.Fjern rørhalvdelene med den gelatininnebygde cellepelleten fra sukrose, og fjern deretter cellepelletshalvdelene fra plastrørhalvdelene med pinsett. Skjær pelleten manuelt i blokker av passende størrelse med et barberblad, og bruk et stereodissekerende mikroskop for å forstørre motivet under skjæringen. Inkuber celleblokkene over natten i 2, 3 molar sukrose ved fire grader Celsius.Plasser dem på en holderpinne i aluminiumsprøven. La nok sukrose rundt kantene på blokken slik at den danner en tynn krage mellom blokken og tappen. Snap fryse og lagre den i flytende nitrogen.Trim fronten av blokken for å flate overflaten for å oppnå rundt 250 nanometer tykke seksjoner. Trim deretter sidene av blokken ved å seksjonere 50 til 100 mikrometer inn i siden av prøveblokkflaten med knivhjørnet. Trimming av fire sider av prøveblokkflaten vil skape et utstikkende rundt 250 x 375 mikrometer rektangel.Seksjon et bånd fra det utstikkende rektangelet som sikrer at seksjonene er mellom 70 og 90 nanometer tykke og har en sølvfarget gylden glans. Før seksjonene bort fra diamantknivens kant med et hår på en pinne for å lage et langt bånd. Plukk opp båndet ved å dyppe den tre millimeter pickup-sløyfen i en en-til-en-blanding av 2,3 molar sukrose og 2% metylcellulose.Sett sløyfen inn i kryokammeret til mikrotomen, og når dråpen begynner å fryse, plukk straks opp seksjonene ved å trykke dråpen forsiktig mot dem. Fjern sløyfen fra kryokammeret. Vent til dråpen har tint helt og trykk på dråpen på et forberedt rutenett.Plasser ristene med seksjoner på rundt en milliliter PBS i en liten tallerken eller flerbrønnsplate og inkuber ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Behandle ristene på rundt 75 mikroliter dråper på Parafilm og start med PBS-glycinvask ved romtemperatur. Inkuber ristene med en blokkeringsbuffer laget av 0,1% bovint serumalbumin C og 0,5% fiskeskinngelatin i PBS i 10 minutter ved romtemperatur som blokkeringstrinn.Fortynn primære antistoffer i blokkeringsbuffer i PBS og inkuber ristene på rundt 10 mikroliter dråper av denne løsningen i en time ved romtemperatur. Vask ristene i 0,1% bovint serumalbumin i PBS fem ganger ved romtemperatur. Fortynn de sekundære antistoffene og DAPI i blokkeringsbufferen i PBS.Inkuber deretter ristene på rundt 10 mikroliters dråper av denne løsningen i 30 minutter eller lenger ved romtemperatur før du vasker ristene i PBS fem ganger som vist tidligere. For å montere prøvene for lysmikroskopi, senk ristene i 50% glyserol i destillert vann to ganger i fem minutter ved romtemperatur. Plasser ett rutenett per deksel mellom et glassglass og et deksel i 50% glyserol, slik at seksjonene vender mot dekselet.For lysmikroskopi, ta et lysbilde med de sandwichede ristene til et bredt feltmikroskop med et automatisert stadium. Velg et oljemål med høy forstørrelse, og opprett et bildeflissett med inndelingsbåndet. Deretter, for avmontering og elektronmikroskopi eller EM-kontrast, tilsett 10 mikroliter destillert vann til siden av glassdekselets glidebrytersandwich, og vent på kapillærvirkning for å fylle glassdekselets sandwichgrensesnitt.Fjern dekselet forsiktig uten å blande nedsenkningsolje i glyserol. Hent ristene med pinsett og senk dem i destillert vann tre ganger ved romtemperatur for å vaske av 50% glyserol. Tørk forsiktig baksiden av risten med et lofritt silkepapir og legg ristseksjonssiden ned på destillerte vanndråper.For å flekke seksjonene for kontrast i elektronmikroskopi, inkuber dem med uranylacetat i fem minutter ved romtemperatur. Avkjøl uranylacetatmetylcelluloseoppløsningen ved å plassere dråpene på Parafilm på en metallplate på is. Vask deretter ristene med denne iskalde løsningen to ganger og inkuber dem i løsningen i 10 minutter.Sløyfe ristene ved å sette inn en tørkesløyfe i uranylacetatmetylcellulosedråpen under hvert rutenett og løft den forsiktig til rutenettet trekkes av dråpen. For å fjerne overflødig løsning, berør løkken i rundt 60 graders vinkel på det lofrie filterpapiret og dra det sakte langs papiret til ingen mer oppløsning absorberes. Plasser løkken med risten i et passende stativ, og la den tørke ved romtemperatur i mer enn 10 minutter.Bruk oversikten fra lysmikroskopi til å lokalisere et område av interesse for avbildning i transmisjonselektronmikroskopet eller TEM, og kommenter avkastningen på lysmikroskopidatasettet. Når et område er valgt, får du en bildeflis satt til 20 000x til 50 000x forstørrelse i TEM. Rekonstruer bildeflissettet i etterbehandlingsprogramvare.Utføre korrelasjonen basert på DAPI signal og fluorescens og nukleære konturer i elektronmikroskopi. Skift bildene for å legge dem nøyaktig og utfør den manuelle korrelasjonen nøyaktig. Hepatoblastomavledede HEPG2-celler ble sultet i to timer i EBSS før fiksering med 4% paraldehyd i to timer.IF-avbildning av LC3 og LAMP1 på seksjoner viser relativt få LC3-puncta og liten samlokalisering med LAMP1. Molekylær informasjon fra IF ble knyttet til den ultrastrukturelle informasjonen oppnådd i elektronmikroskopi ved å legge over de to avbildningsmodalitetene basert på DAPI og nukleære konturer. Korrelasjonen mellom de LC3-positive organellene og EM-ultrastrukturen viste at de forskjellige punctaene representerte forskjellige stadier av autofagi.Ultrastrukturen til de enkelte LC3-merkede rommene som eksemplifisert ved boks én er vist her. De korrelative lyselektronmikroskopibildene vises til venstre, og de pseudofargede elektronmikroskopibildene vises til høyre. Indre og ytre autofagosomale membraner er indikert med hvite og svarte pilspisser.Interessant nok identifiserte EM relativt svake fluorescerende flekker som LC3-positive autolysosomer, som er preget av tett innhold og intraluminale vesikler. Dette avslører minimal LC3-synlighet i IF av ultratynne kryoseksjoner, noe som tyder på detekterbar LC3 i steady state autolysosomer til tross for det nedbrytende miljøet. Imidlertid representerer LC3-positiv puncta hovedsakelig autofagosomer med få som representerer autolysosomer.For forskere som ønsker å gjøre immunogold-merking i stedet for CLEM, er protokollene og tipsene beskrevet her også fullt anvendelige for immunogold-merking. Vi brukte opprinnelig CLEM på seksjonen på endosomale regulatoriske proteiner med lav overflod og viste for første gang deres endogene ultrastrukturelle lokalisering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Korrelerende Confocal og 3D Elektronmikroskopi av en bestemt Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensjonal Super Resolution Mikroskopi av F-aktin filamenter av Interferometric PhotoActivated Lokalisering Mikroskopi (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysing: Et verktøy for Ultra og Immunolocalization Studier av suspensjonsceller i transmisjonselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Vurdere autophagic Flux ved å måle LC3, p62 og LAMP1 Co-lokalisering ved hjelp av flerspektral bildeflow-cytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Rask frysing ved hjelp av sandwichfrysingsenhet for god ultrastrukturell bevaring av biologiske prøver i elektronmikroskopi

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisering av subcellulær lokalisering av et protein i hjertet ved hjelp av kvanteprikkmediert immunmerking etterfulgt av transmisjonselektronmikroskopi