Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Благодарим коллег из Центра молекулярной медицины Университетской клиники Утрехта за плодотворные дискуссии и обратную связь. Мы благодарим бывших и нынешних коллег из лаборатории Клумпермана за постоянное совершенствование наших технологий микроскопии. Инфраструктура EM, используемая для этой работы, является частью исследовательской программы National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI), финансируемой Голландским исследовательским советом (NWO), проект номер 184.034.014 для JK.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Представленный здесь метод использует преимущества последних достижений в области криосекции КЛЭМ - высокую чувствительность маркировки ПЧ и точную (погрешность <100 нм) корреляцию между ФМ и ЭМ14,24. В результате получается метод с чувствительностью к флуоресцентным меткам дефицитных эндогенных белков и возможностью наложения их с высокой точностью на ультраструктуру ЭМ. Таким образом, этот метод позволяет избежать необходимости (чрезмерной) экспрессии экзогенно меченных белков и использования менее чувствительных ЭМ-меток. Целесообразность метода показана на примерах CLEM на эндогенных LC3 в клетках, лишенных голодания, без применения лизосомальных ингибиторов.
Размороженные криосрезы, полученные методом Токуясу, являются идеальными образцами для иммуно-ЭМ, так как в отличие от смоляных срезов проницаемы для антител. В сочетании с процедурами мягкой фиксации и контрастирования, это, как правило, обеспечивает превосходную эффективность мечения по сравнению с другими методами без ущерба для детализированной ультраструктуры и превосходно визуализирует клеточные мембраны 12,25,26. Кроме того, криосекции хорошо совместимы с флуоресцентной микроскопией, что делает их ценными субстратами для CLEM. Как классическое мечение иммунозолотом, так и CLEM на криосекциях дали плодотворную информацию в понимании субклеточной организации 14,27,28,29,30.
В настоящее время применение CLEM на размороженных криосекциях становится все более распространенным в результате непрерывных разработок и оптимизаций 14,20,24,31,32,33,34, которые улучшили качество, применимость и точность подхода. Теперь, благодаря точной корреляции больших наборов плиток ПЧ и ЭМ изображений, этот метод облегчает скрининг ультраструктуры флуоресцентно меченных эндогенных клеточных компонентов 14,32,33. Это является преимуществом по сравнению с классическим иммуно-ЭМ, где поиск меченых золотом структур обычно требует большого увеличения и, следовательно, является более трудоемким и трудоемким. Именно по этой причине локализация LC3 в ультраструктуре значительно выигрывает от CLEM. LC3-положительные органеллы часто встречаются, когда аутофагический клиренс блокируется (т.е. когда клетки обрабатываются BafA1 или агентами, повышающими pH), в то время как аутофагические органеллы быстро очищаются в неизмененных или истощенных клетках, что приводит к очень низким равновесным уровням. В таких условиях поиск LC3-меченых органелл с помощью классической иммуно-ЭМ может быть сложной задачей, и CLEM дает явное преимущество.
Ранее CLEM на срезах смолы применялся в исследованиях с использованием эктопической экспрессии LC3-GFP или тандемного зонда LC3-GFP-RFP 35,36,37,38,39. В этих исследованиях флуоресцентная визуализация проводилась перед встраиванием или непосредственно в секции40 акриловой смолы, а затем образцы были просеяны с помощью ЭМ. Есть несколько преимуществ встраивания смолы; Аутофагосомная ультраструктура, как правило, хорошо сохраняется, особенно если материал заморожен под высоким давлением40. Более того, контраст окрашенного тяжелыми металлами материала, содержащего смолу, как правило, более выражен, чем у криосекций, окрашенных уранилом. Участки с полимерной инструкцией совместимы с объемными ЭМ-методами, такими как матричная томография, FIB-SEM или последовательная блок-торцевая РЭМ, в то время как криосекции — нет. В подходах, которые выполняют визуализацию перед встраиванием, визуализация живых клеток является вариантом41, который недоступен в CLEM для криосекций. Ключевым преимуществом CLEM на криосекциях по сравнению с этими альтернативами является высокий сигнал IF, позволяющий иммунолокализовать редкие белки без необходимости мембранной пермеабилизации или гиперэкспрессии. Это позволяет избежать потенциальной мембранной экстракции, артефактов гиперэкспрессии42 и генетической модификации субъекта, что в сочетании с возможностью коррелировать большие области в ИФ и ЭМ делает его отличным инструментом для изучения LC3 и аутофагии.
Здесь применение CLEM на срезе к истощенным клеткам HEPG2 показало, что LC3 преимущественно локализуется в структурах, идентифицированных как аутофагосомы. Кроме того, в аутолизосомах было обнаружено несколько слабо флуоресцентных пятен. Это прямо противоположно клеткам, обработанным BafA19 , и отражает быструю деградацию аутофагосомных белков после слияния аутофагосом с лизосомами. В целом, данные продемонстрировали, что CLEM размороженных криосекций может дать представление о LC3-опосредованной аутофагии в нативных условиях. Полученные данные также подчеркивают чувствительность технологии, поскольку LC3 был обнаружен даже в аутолизосомах, которые содержат только низкие уровни интактных эпитопов LC3. Дальнейшее применение этого метода путем визуализации LC3 в различных моделях и условиях улучшит наше понимание аутофагии и других LC3-опосредованных биологических процессов, таких как LC3-ассоциированный фагоцитоз или конъюгация ATG8 с отдельными мембранами.
Помимо аутофагии, КЛЭМ на срезе может применяться к другим редким событиям или структурам, таким как деление клеток, инфекция, редкие типы клеток в тканях, кинетохоры, первичные реснички или органеллы, специфичные для типа клеток. Эффективный скрининг интересующего субъекта с помощью ИФ может значительно облегчить ультраструктурное изучение этих раритетов. Кроме того,было показано, что этот метод может быть использован для локализации белков более чувствительным образом, чем классическая иммуно-ЭМ. Регулировка длины фиксации может еще больше расширить эту чувствительность, позволяя ультраструктурно локализовать очень малораспространенные или плохо антигенные белки. Наконец, метод CLEM на срезах облегчает быстрый отбор количественного числа органелл, способствуя более надежному анализу ультраструктурного распределения данного белка.
Для криосекции требуется оборудование и опыт для криосекции. В группах, имеющих доступ к этим инструментам (например, криомикротомам), реализация КЛЭМ на срезе проста и требует только наличия автоматизированного широкопольного микроскопа, к которому имеет доступ большинство лабораторий. Кроме того, этот метод доступен в учреждениях EM по всему миру. Поскольку КЛЭМ на срезе сочетает в себе применение известных методов ПЧ и ЭМ, метод легко адаптируется и может сочетаться, например, с томографией 20,33,43, серийным срезом объемной ЭМ ограниченного числа секций44 или микроскопией сверхвысокого разрешения 45. Эта универсальность метода позволяет применять его к широкому кругу биологических вопросов.

Аутофагия является ключевым процессом для клиренса и переработки цитоплазматических белков и органелл. Процесс макроаутофагии (далее называемый аутофагией) включает в себя образование двухмембранных органелл, аутофагосом, что позволяет клеткам заключать цитоплазматические молекулы и органеллы для лизосомальной деградации. Аутофагия происходит на базальном уровне в большинстве клеток и усиливается в ответ на клеточные условия, такие как голодание или клеточный стресс. Аутофагия происходит либо субстрат-специфичным образом, нацеленным на определенные структуры или белки для деградации, либо как неселективный объемный процесс, охватывающий части цитозоля. При селективной аутофагии аутофагосомы образуются путем конъюгации белков семейства Atg8 (ассоциированных с микротрубочками белков легкой цепи 1A/B 3A/B/C [LC3] и GABARAPs) с мембранами, полученными из перерабатываемых эндосом, Гольджи и/или эндоплазматического ретикулума (ER)1. LC3 распознает аутофагический груз в цитозоле напрямую или через адаптеры селективной аутофагии, такие как P62/SQSTM. Новые аутофагические мембраны затем могут быть конъюгированы с LC3, расширяться и сливаться, образуя законченную двойную мембрану, содержащую груз, называемую аутофагосомой. Аутофагосома созревает и в конечном итоге сливается с эндосомой или лизосомой, после чего аутофагический груз и адапторы деградируют2.
В исследованиях формирования, созревания и слияния аутофагосом часто используются технологии световой микроскопии. Флуоресцентная микроскопия LC3 обычно используется для оценки количества и клеточной локализации аутофагосом в различных условиях. Кроме того, связывая LC3 с pH-чувствительным GFP и pH-стабильным RFP в так называемом тандемном зонде, можно измерить общий поток аутофагии в живых клетках в зависимости от потери флуоресценции GFP3. Эти подходы являются ценными инструментами для исследователей, позволяющими понять роль и механизм аутофагии в различных условиях. Еще одним бесценным инструментом является электронная микроскопия (ЭМ), которая выявляет ультраструктуру аутофагических органелл на разных стадиях аутофагии 4,5,6,7,8. На сегодняшний день ЭМ по-прежнему является методом выбора для определения точных стадий формирования аутофагосом путем различения различных аутофагических мембран по морфологии: фагофор (двойная мембрана, не полностью закрытая), аутофагосома (закрытая двойная мембрана вокруг цитозольного груза) и аутолизосома ([частичная] потеря внутренней аутофагической мембраны). Однако морфология без молекулярной информации может быть подвержена неправильной идентификации или двусмысленности. Иммуно-ЭМ является наиболее полным методом одновременной молекулярной характеристики и морфологической классификации аутофагических органелл. Например, мечение ЛК3 иммунозолотом на размороженных криосекциях позволяет ультраструктурно локализовать ЛК3 и точно идентифицировать ЛК3-меченые органеллы9.
Недостатком ЭМ является малое поле зрения, которое приходит с большим увеличением, необходимым для наблюдения тонкой ультраструктуры аутофагических мембран и, в случае иммуно-ЭМ, для определения метки, которая маркирует интересующий белок. Из-за их дефицита и низкого уровня белка это, как правило, затрудняет количественный ЭМ-анализ аутофагосом. Чтобы увеличить количество аутофагосом, клетки часто голодают и обрабатывают бафиломицином А1 (BafA1), ингибитором лизосомального закисления и деградации. Без лечения BafA1 поиск аутофагосом с помощью ЭМ занимает много времени из-за дефицита этих органелл. Метод, представленный в данной рукописи, решает эту проблему путем флуоресцентного мечения и визуализации эндогенного LC3 на размороженных криосекциях во флуоресцентном микроскопе перед дальнейшей подготовкой к ЭМ. Флуоресцентные изображения затем направляют поиск LC3-меченых структур в ЭМ. После сбора ЭМ-изображения коррелируют с флуоресцентными изображениями, чтобы добавить молекулярную информацию — наличие LC3 — к ультраструктуре клетки. Этот метод «на сечении» значительно повышает способность находить LC3-меченые структуры, особенно в необработанных условиях, для последующей идентификации и классификации с помощью ЭМ.
Этот метод был применен к истощенным клеткам гепатобластомы HEPG210 для поиска аутофагосом в неизмененных (т.е. без использования BafA1) условиях. Было обнаружено относительно небольшое количество флуоресцентных пунктов (менее одного на профиль клетки в срезе 90 нм), что согласуется с высокой оборачиваемостью LC311. Эта разреженность LC3-puncta подчеркивала ценность CLEM; путем отбора участков с несколькими флуоресцентными пунктами для визуализации в ЭМ были обнаружены и охарактеризованы LC3-положительные органеллы гораздо более эффективным образом, чем с помощью обычной иммуно-ЭМ. Это показало, что большинство LC3-положительных органелл были аутофагосомами, что определяется их морфологией, что контрастирует с результатами, полученными в клетках, обработанных BafA1, где аутолизосомыболее распространены. Эти данные показывают, что с помощью КЛЭМ на срезе аутофагия может быть изучена на ультраструктурном уровне без необходимости ингибирования аутофагического потока.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

Визуализация аутофагических органелл на ультраструктурном уровне с помощью электронной микроскопии (ЭМ) необходима для установления их идентичности и выявления деталей, важных для понимания аутофагического процесса. Однако в методах ЭМ часто отсутствует молекулярная информация, что затрудняет корреляцию ультраструктурной информации, полученной с помощью ЭМ, с локализацией специфических белков аутофагии с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, редкость аутофагосом в неизмененных клеточных условиях затрудняет исследование с помощью ЭМ, которое требует большого увеличения и, следовательно, обеспечивает ограниченное поле зрения.
В ответ на обе проблемы был применен метод коррелятивной световой электронной микроскопии (CLEM) на срезе, основанный на флуоресцентном мечении, для корреляции общего аутофагосомального маркера, LC3, с ультраструктурой ЭМ. Метод был использован для быстрого скрининга клеток во флуоресцентной микроскопии на мечение LC3 в сочетании с другими соответствующими маркерами. Впоследствии основные ультраструктурные особенности выбранных LC3-меченых пятен были идентифицированы с помощью CLEM. Метод применяли к истощенным клеткам без добавления ингибиторов лизосомального закисления.
В этих условиях LC3 был обнаружен преимущественно на аутофагосомах и редко в аутолизосомах, в которых LC3 быстро деградирует. Эти данные показывают как осуществимость, так и чувствительность этого подхода, демонстрируя, что CLEM может быть использован для получения ультраструктурного понимания LC3-опосредованной аутофагии в естественных условиях - без медикаментозного лечения или генетических изменений. В целом, этот метод представляет собой ценный инструмент для исследования ультраструктурной локализации белков аутофагии и других дефицитных антигенов путем связывания световой микроскопии с данными ЭМ.

Оптимизированный иммуно-ЭМ протокол для иммунозолотого мечения LC3 на ультратонких криосрезах был недавно опубликован De Maziere et al.9. Это исследование включало голодание без BafA1, в которых LC3 присутствовал, но относительно редко и его было трудно обнаружить с помощью ЭМ. В отдельном исследовании был представлен метод CLEM на срезе, который использует чувствительность флуоресцентного мечения для визуализации относительно редких и низкоэкспрессируемых эндогенных белков и соотнесения их с ультраструктурой ЭМ14. Здесь эти два подхода объединены с помощью оптимизированного протокола маркировки LC3 в рамках CLEM-подхода.
Клетки HEPG2, клетки печени с относительно высокими уровнями базальной аутофагии22, голодали в минимальной среде (сбалансированный раствор соли Эрла [EBSS]) в течение 2 ч до фиксации в 4% PFA. За этим последовала пробоподготовка методом ультратонкого криосекционирования Токуясу (разделы 1-3; см. Слот и Гёзе12), который хорошо совместим с CLEM 14,23 на сечении. Размороженные криосрезы флуоресцентно мечили (раздел протокола 4 и рис. 1) с использованием мышиного первичного антитела9 к LC3. Кроме того, для индикации эндолизосом использовался кроличий анти-LAMP1, за которым следовали вторичные антитела к мышам AlexaFluor488 и антикроличьи AlexaFluor568. Сетки были зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом и визуализированы на РТ на широкопольном микроскопе (масляный объектив 100x 1,47 NA, камера sCMOS).
Преимуществом флуоресцентного мечения тонких срезов перед обычными цельноклеточными ПЧ является повышенное разрешение по Z, так как физическая толщина среза составляет 60-90 нм. Благодаря этому улучшенному Z-разрешению, флуоресцентное мечение LC3 и LAMP1 на тонких срезах показывает очень слабую колокализацию (рис. 2A). В клетках, обработанных лизосомальными ингибиторами, такими как BafA1, наблюдается высокая колокализация, поскольку лизосомально заключенный LC3 остается недеградированным9. В необработанных клетках LC3 быстро разрушается при контакте с ферментативно активными, LAMP1-положительными лизосомами, и поэтому колокализация в этих условиях встречается редко. Как правило, наблюдалось менее одного LC3 punctum на профиль клетки. Это указывает на то, что даже в условиях голодания оборот аутофагосом происходит быстро, что приводит к низкому уровню аутофагосом. Это также подчеркивает важность использования CLEM для поиска редких структур, меченных LC3, используя большое поле зрения, обеспечиваемое световой микроскопией. Кроме того, более высокая чувствительность флуоресцентного мечения по сравнению с мечением золотом позволяет идентифицировать больше LC3-положительных органелл, чем в обычном иммуно-ЭМ, что еще больше облегчает их характеристику.
После получения полного набора тайлов ленты срезов, сетки извлекали из микроскопа и постокрашивали на ЭМ с использованием UA и методом loop-out (шаги протокола 4.4-4.6; Рисунок 1F,G). Этот метод «петли» гарантирует, что тонкий слой UA:метилцеллюлозы остается на сетке, что создает желаемый контраст в ЭМ. Толщина слоя зависит от скорости и угла, с которым UA:метилцеллюлоза смывается на фильтровальную бумагу. Слишком быстрое перетаскивание цикла может привести к тому, что на сетке останется слишком много UA:метилцеллюлозы и потемнеет внешний вид секций в EM. Слишком медленное перетаскивание может оттянуть слишком много UA:метилцеллюлозы, что приведет к слишком малому окрашиванию и плохой морфологии, а также рискует выпадением сетки из петли. «Масляное пятно» (рис. 1G) на сухих сетках указывает на подходящую толщину слоя UA:метилцеллюлозы.
После выхода из контура и сушки сетки визуализировались в ПЭМ при ROI, выбранных с помощью флуоресценции. Наборы данных ПЧ и ЭМ коррелировали путем наложения сигнала DAPI на контуры ядер, видимых в ЭМ, создавая интегрированное изображение, содержащее информацию об обеих модальностях.
Найти ту же область в EM, что и выбранная в ПЧ, может быть непросто. Поэтому рекомендуется иметь под рукой обзорное изображение набора тайлов IF при поиске в EM. Пользователи должны искать узнаваемые особенности в обеих модальностях, такие как складки или разрывы в сечениях, полосы сетки или расположение ядер. Также важно иметь в виду, что образец может выглядеть повернутым и зеркально отраженным в электромагнитном диапазоне. Для упрощения корреляции можно использовать «сетки поиска» со специфическими функциями для идентификации областей (см. Таблицу материалов).
Корреляция LC3-положительных органелл с ультраструктурой ЭМ показала, что различные пункты представляют собой различные стадии аутофагии (рис. 2B). Несмотря на то, что сохранение аутофагосомальной ультраструктуры в криосекциях является сложной задачей, часто наблюдались органеллы с цитоплазматическим содержимым и двойными мембранами (рис. 2C, стрелки в органеллах 1-5; Дополнительный рисунок S1), которые являются определяющими морфологическими особенностями аутофагосом. Интересно, что довольно слабые флуоресцентные пятна были идентифицированы ЭМ как LC3-положительные аутолизосомы (рис. 2С, органелла 6; аутофагическое содержание отмечено *), характеризующиеся плотным содержимым и внутрипросветными везикулами. Это показало, что очень малые количества LC3 видны в ПЧ ультратонких криосекций, и указало на то, что, несмотря на деградационную среду, некоторое количество LC3 обнаруживается в стационарных автолизосомах. Однако большинство LC3-положительных пунктатов представляли собой аутофагосомы, в то время как аутолизосомы встречались очень редко. Это отличается от клеток, обработанных BafA1, которые в основном накапливают аутолизосомы, а не аутофагосомы.
Таким образом, этот протокол описывает метод CLEM на срезе для связывания молекулярной информации, полученной с помощью флуоресцентной микроскопии, с ультраструктурой ЭМ. Этот метод повышает чувствительность иммуно-ЭМ, так как для мечения используются только флуорофоры, которые обычно дают больше сигнала, чем ЭМ-зонды. Метод особенно подходит для использования ультратонких криосекций, в которых можно получить высокие уровни специфической флуоресценции при незначительном фоновом окрашивании. Используя флуоресценцию для скрининга редких структур или событий и сопоставляя выбранные ROI с EM, можно значительно сократить время работы EM и связанные с этим затраты. Чувствительность и осуществимость метода демонстрируется визуализацией LC3 в необработанных, истощенных клетках, показывающей, что LC3 преимущественно связывается с аутофагосомами в этих условиях, с очень низкими уровнями, видимыми в аутолизосомах.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическое изображение КЛЭМ на разрезе . (А) Криосрезы из ячеек, внедренных в желатин, собираются на медной сетке, покрытой формваром. (Б) Сетки обрабатываются по частям на каплях соответствующих растворов. (C) Сетки помечены первичными и флуоресцентными вторичными антителами. (D) Сетки зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом в 50% глицерина. (E) Флуоресцентные изображения собираются с помощью широкопольного микроскопа. (F) Сетки извлекаются из предметного стекла и далее обрабатываются окрашиванием уранилом для ЭМ. (G) После высыхания сетки могут быть отображены с помощью TEM. (H) Набор тайлов изображений ПЭМ с большим увеличением получен из области, выбранной из данных флуоресценции. (I) Изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии и ЭМ, коррелируют и накладываются друг на друга. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Рисунок 2: КЛЭМ LC3 и LAMP1 в истощенных клетках HEPG2. Клетки HEPG2 голодали в течение 2 ч в EBSS перед фиксацией 4% PFA в течение 2 ч. (A) Визуализация LC3 (зеленый) и LAMP1 (красный) на срезах показывает относительно небольшое количество LC3 puncta и небольшую колокализацию с LAMP1. (B) Связывание молекулярной информации из ПЧ (левая панель) с ультраструктурной информацией, полученной в ЭМ (средняя панель), путем наложения двух модальностей визуализации, основанных на DAPI и ядерных контурах (пунктирные линии, правая панель). Ультраструктура отдельных компартментов, помеченных LC3, как показано на рисунке 1 (правая панель), показана на рисунке C. (C) Ультраструктура LC3-положительных компартментов. Слева показаны CLEM-изображения, а справа — псевдоцветные (бежевые) EM-изображения (неокрашенные EM-изображения показаны на дополнительном рисунке S1). Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 10 мкм (А), 1 мкм (В), 200 нм (С). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный рисунок S1: Неокрашенные ЭМ-изображения LC3-положительных органелл. (А-Ж) Неокрашенные ЭМ изображения псевдоцветных примеров 1-6 показаны на рисунке 2C. Органеллы отбирали методом флуоресценции LC3, как показано на рисунке 2. Внутренняя и наружная аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными стрелками соответственно. Аутофагическое содержание внутри аутолизосомы в примере 6 обозначается *. Масштабные линейки = 200 нм. Сокращения: AL = аутолизосома; AP = аутофагосома; M = митохондрия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.</a>
Дополнительный файл 1: Буферы и растворы, использованные в этом исследовании. Этот дополнительный файл содержит рецепты и протоколы, необходимые для создания буферов и растворов, используемых в этом исследовании. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

В данной работе мы представляем протокол оптимизированной коррелятивной световой электронной микроскопии на срезе на основе эндогенного флуоресцентного мечения в качестве инструмента для исследования локализации редких белков по отношению к клеточной ультраструктуре. Эффективность этого подхода демонстрируется ультраструктурной локализацией эндогенного LC3 в истощенных клетках без лечения бафиломицином.

Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Локализация белков в контексте ультраструктуры клетки была мощным исследовательским инструментом на протяжении десятилетий. С помощью этого протокола мы расширили количество белков, которые имеют низкую распространенность или которые трудно найти. Мы используем флуоресцентную микроскопию для мечения белков чувствительным и экранируемым способом и комбинируем ее с электронной микроскопией для восполнения ультраструктуры клетки.Здесь мы продемонстрируем CLEM на белках аутофагии, но он действительно может быть применен к любому биологическому вопросу, где представляет интерес ультраструктура клетки, особенно при изучении редких событий. Вместе со мной эту процедуру будет демонстрировать Тинеке Венендал, старший научный сотрудник нашей лаборатории. Для начала замените PBS, содержащий 0,15% глицина, на 1% желатин в PBS, предварительно подогретый до 37 градусов Цельсия.Соскребите и перенесите клетки в желатине в микроцентрифужную пробирку. Гранулируйте клетки при 6 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре в микроцентрифуге, а затем удалите желатин, не повредив гранулу. Добавьте в гранулу 12%-ный желатин, нагретый до 37 градусов Цельсия, и осторожно ресуспендируйте путем пипетирования наконечниками пипеток или стеклянными пастбищными пипетками, предварительно нагретыми до той же температуры.Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем гранулируйте клетки при температуре 6 000 г в течение одной минуты. Затвердевайте желатин на льду в течение 30 минут. Чтобы удалить желатиновые ячейки из трубки, отрежьте конец трубки, содержащий гранулу, от остальной части трубки лезвием бритвы.Затем разрежьте конец трубки с клеточной гранулой пополам перпендикулярно первому срезу. Поместите две половинки концов трубки, содержащие клеточную гранулу, в 2,3 молярную сахарозу и инкубируйте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Это приводит к тому, что половинки клеточных гранул слегка сжимаются и вытесняются из пластиковой трубки.Извлеките половинки пробирок с гранулами желатина из сахарозы, а затем извлеките половинки клеточных гранул из половинок пластиковой трубки пинцетом. Вручную разрежьте гранулу на блоки подходящего размера лезвием бритвы и используйте стереоанализирующий микроскоп, чтобы увеличить объект во время резки. Инкубируйте клеточные блоки в течение ночи в 2,3 молярной сахарозе при температуре четыре градуса Цельсия.Поместите их на алюминиевый штифт держателя образца. Оставьте достаточное количество сахарозы по краям блока, чтобы она образовала тонкий хомут между блоком и штифтом. Заморозьте и храните в жидком азоте.Обрежьте переднюю часть блока, чтобы сгладить его поверхность, чтобы получить участки толщиной около 250 нанометров. Затем обрежьте боковые стороны блока, сделав надрез от 50 до 100 микрометров в боковой части поверхности образца блока с помощью угла ножа. Обрезка четырех сторон грани блока образца создаст выступающий прямоугольник размером примерно 250 на 375 микрометров.Отрежьте ленту от выступающего прямоугольника, убедившись, что отрезки имеют толщину от 70 до 90 нанометров и серебристо-золотистый блеск. Отведите срезы от края алмазного ножа с помощью волоска на палочке, чтобы получилась длинная лента. Поднимите ленту, окунув трехмиллиметровую петлю захвата в смесь 2,3 молярной сахарозы и 2% метилцеллюлозы в соотношении один к одному.Вставьте петлю в криокамеру микротома, и как только капля начнет замерзать, быстро подберите срезы, осторожно прижимая к ним каплю. Извлеките петлю из криокамеры. Дождитесь, пока капля полностью оттает и прижмите каплю на подготовленную сетку.Поместите решетки с секциями примерно на один миллилитр PBS в небольшую посуду или многолуночную тарелку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Обработайте сетки примерно на 75 микролитрах капель на Parafilm и начните с промывки глицином PBS при комнатной температуре. Инкубируют сетки с блокирующим буфером, состоящим из 0,1% бычьего сывороточного альбумина С и 0,5% желатина рыбьей кожи в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре в качестве стадии блокировки.Разведите первичные антитела в блокирующем буфере в PBS и инкубируйте сетки примерно на 10 микролитровых каплях этого раствора в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте решетки в 0,1%-ном бычьем сывороточном альбумине в PBS пять раз при комнатной температуре. Разбавляют вторичные антитела и DAPI в блокирующем буфере в PBS.Затем инкубируйте решетки примерно на 10 микролитровых каплях этого раствора в течение 30 минут или дольше при комнатной температуре, прежде чем промыть решетки в PBS пять раз, как показано ранее. Чтобы смонтировать образцы для световой микроскопии, дважды погрузите решетки в 50%-ный глицерин в дистиллированную воду на пять минут при комнатной температуре. Поместите одну сетку на каждый покровный лист между предметным стеклом и защитным стеклом с 50%-ным глицерином, убедившись, что секции обращены к защитному стекле.Для световой микроскопии возьмите предметное стекло с многослойными сетками в широкопольный микроскоп с автоматическим столиком. Выберите масляный объектив с большим увеличением и создайте набор фрагментов изображения из ленты разделов. Затем для снятия и электронной микроскопии или электромагнитного контрастирования добавьте 10 микролитров дистиллированной воды на боковую сторону сэндвича со стеклянной крышкой предметного стекла и подождите, пока капиллярное действие заполнит интерфейс сэндвича со стеклянной крышкой.Осторожно снимите покровное стекло, не смешивая погружное масло с глицерином. Извлеките решетки пинцетом и трижды погрузите их в дистиллированную воду комнатной температуры, чтобы смыть 50% глицерина. Осторожно высушите тыльную сторону сетки безворсовой папиросной бумагой и положите сетку стороной вниз на капли дистиллированной воды.Чтобы окрасить срезы для контрастирования в электронной микроскопии, инкубируйте их с уранилацетатом в течение пяти минут при комнатной температуре. Охладите раствор метилцеллюлозы уранилацетата, поместив капли на Парапленку на металлическую пластину на льду. Затем дважды промойте решетки этим ледяным раствором и выдержите их в растворе в течение 10 минут.Удалите сетки, вставив петлю сушки сетки в каплю метилцеллюлозы уранилацетата под каждой сеткой и осторожно приподняв ее, пока сетка не снимется с капли. Чтобы промокнуть излишки раствора, прикоснитесь петлей под углом около 60 градусов к безворсовой фильтровальной бумаге и медленно проведите ею по бумаге, пока раствор не перестанет впитываться. Поместите петлю с сеткой на подходящую решетку и дайте ей высохнуть при комнатной температуре более 10 минут.Используйте обзор, полученный с помощью световой микроскопии, чтобы найти интересующую область для визуализации в просвечивающем электронном микроскопе или ПЭМ, и аннотировать ROI в наборе данных световой микроскопии. После того, как регион выбран, получите фрагмент изображения с увеличением от 20 000x до 50 000x в TEM. Восстановите набор плиток изображения в программном обеспечении для постобработки.Выполните корреляцию на основе сигнала DAPI и флуоресцентных и ядерных контуров в электронной микроскопии. Смещайте изображения, чтобы точно накладывать их друг на друга, и точно выполняйте ручную корреляцию. Клетки HEPG2, полученные из гепатобластомы, голодали в течение двух часов в EBSS перед фиксацией 4%-ным паральдегидом в течение двух часов.Визуализация IF LC3 и LAMP1 на срезах выявляет относительно небольшое количество LC3 puncta и небольшую колокализацию с LAMP1. Молекулярная информация, полученная с помощью IF, была связана с ультраструктурной информацией, полученной в электронной микроскопии, путем наложения двух модальностей визуализации, основанных на DAPI и ядерных контурах. Корреляция LC3-положительных органелл с ультраструктурой ЭМ показала, что различные пункты представляют собой различные стадии аутофагии.Ультраструктура отдельных отсеков, помеченных LC3, как показано на рисунке 1, показана здесь. Изображения коррелятивной световой электронной микроскопии показаны слева, а изображения псевдоцветной электронной микроскопии — справа. Внутренние и наружные аутофагосомные мембраны обозначены белыми и черными наконечниками стрелок.Интересно, что ЭМ идентифицировала относительно слабые флуоресцентные пятна как LC3-позитивные аутолизосомы, которые характеризуются плотным содержимым и внутрипросветными везикулами. Это показывает минимальную видимость LC3 в ПЧ ультратонких криосекций, что позволяет предположить, что LC3 обнаруживается в стационарных аутолизосомах, несмотря на деградационную среду. Тем не менее, LC3-положительные пункты в основном представляют аутофагосомы, и лишь немногие представляют аутолизосомы.Для исследователей, которые хотят делать маркировку иммунозолотом, а не CLEM на срезе, протоколы и советы, описанные здесь, полностью применимы и для мечения иммунозолотом. Первоначально мы применили on-section CLEM к эндосомальным регуляторным белкам низкой распространенности и впервые показали их эндогенную ультраструктурную локализацию.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Корреляционный конфокальной и 3D Электронная микроскопия конкретного чувственного Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Трехмерная Суперразрешение Микроскопия F-актин филаментов интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Оценка аутофагического потока путем измерения локализации LC3, p62 и LAMP1 с использованием мультиспектральной визуальной проточной цитометрии

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Быстрое замораживание с использованием сэндвич-морозильного устройства для хорошей ультраструктурной консервации биологических образцов в электронной микроскопии

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Визуализация субклеточной локализации белка в сердце с помощью иммуномаркировки, опосредованной квантовыми точками, с последующей просвечивающей электронной микроскопией