Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a nuestros colegas del Centro de Medicina Molecular del Centro Médico Universitario de Utrecht por sus fructíferas discusiones y comentarios. Agradecemos a los colegas pasados y presentes del laboratorio de Klumperman por realizar mejoras continuas en nuestras tecnologías de microscopía. La infraestructura EM utilizada para este trabajo forma parte del programa de investigación National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) financiado por el Consejo de Investigación Holandés (NWO), número de proyecto 184.034.014 a JK.

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

El método presentado aquí aprovecha los avances recientes en CLEM en sección basado en criosección: la alta sensibilidad del etiquetado de FI y la correlación precisa (error de <100 nm) entre FM y EM14,24. Esto da como resultado un método con la sensibilidad para etiquetar fluorescentemente proteínas endógenas escasas y la capacidad de superponerlas con alta precisión a la ultraestructura EM. Por lo tanto, este método evita la necesidad de (sobre)expresión de proteínas marcadas exógenamente y el uso de marcadores EM menos sensibles. La viabilidad del método se demuestra mediante ejemplos de CLEM en LC3 endógena en células inexistentes, sin el uso de inhibidores lisosomales.
Las criosecciones descongeladas obtenidas con el método Tokuyasu son muestras ideales para inmuno-EM, ya que a diferencia de las secciones de resina, son permeables a los anticuerpos. Combinado con una fijación suave y procedimientos de contraste, esto generalmente produce una excelente eficiencia de etiquetado sobre otros métodos sin comprometer la ultraestructura detallada, y visualiza excelentemente las membranas celulares 12,25,26. Además, las criosecciones son altamente compatibles con la microscopía de fluorescencia, lo que las convierte en sustratos valiosos para CLEM. Tanto el marcaje clásico de inmunogold como el CLEM en criosecciones han proporcionado información fundamental para comprender la organización subcelular 14,27,28,29,30.
En la actualidad, las aplicaciones de CLEM en criosecciones descongeladas son cada vez más frecuentes, como resultado de los continuos desarrollos y optimizaciones 14,20,24,31,32,33,34 que han mejorado la calidad, aplicabilidad y precisión del abordaje. Ahora, mediante la correlación precisa de grandes conjuntos de imágenes de FI y EM, la técnica facilita el cribado de la ultraestructura de los componentes celulares endógenos marcados con fluorescencia 14,32,33. Esta es una ventaja con respecto a la inmuno-EM clásica, donde la búsqueda de estructuras marcadas con oro generalmente requiere un gran aumento y, por lo tanto, es más laboriosa y requiere más tiempo. Es por esta razón que la localización de LC3 en la ultraestructura se beneficia enormemente de CLEM. Los orgánulos LC3 positivos son comunes cuando se bloquea el aclaramiento autofágico (es decir, cuando las células se tratan con BafA1 o agentes que aumentan el pH), mientras que los orgánulos autofágicos se eliminan rápidamente en células inalteradas o hambrientas, lo que resulta en niveles muy bajos de estado estacionario. En tales condiciones, encontrar orgánulos marcados con LC3 utilizando inmuno-EM clásica puede ser un desafío, y CLEM ofrece una clara ventaja.
Anteriormente, CLEM en secciones de resina se aplicaba en estudios que utilizaban la expresión ectópica de LC3-GFP o una sonda en tándem LC3-GFP-RFP 35,36,37,38,39. En estos estudios, se realizaron imágenes de fluorescencia antes de la inclusión o directamente en secciones de resina acrílica40, y las muestras se analizaron posteriormente mediante EM. Hay varias ventajas de la incrustación de resina; La ultraestructura autofagosomal está generalmente bien conservada, especialmente si el material está congelado a alta presión40. Además, el contraste del material incrustado en resina teñido de metales pesados es generalmente más pronunciado que el de las criosecciones teñidas con uranilo. Las secciones incrustadas en resina son compatibles con los métodos volumétricos de EM, como la tomografía de matrices, FIB-SEM o SEM de cara de bloque en serie, mientras que las criosecciones no lo son. En los abordajes que realizan imágenes antes de la inclusión, las imágenes de células vivas son una opción41 que no está disponible en CLEM en criosecciones. La ventaja clave de CLEM en criosecciones sobre estas alternativas es la alta señal de FI, lo que permite la inmunolocalización de proteínas raras sin necesidad de permeabilización o sobreexpresión de la membrana. Esto evita la posible extracción de membranas, la sobreexpresión de artefactos42 y la modificación genética del sujeto, lo que, combinado con la posibilidad de correlacionar grandes áreas en FI y EM, lo convierte en una excelente herramienta para estudiar la LC3 y la autofagia.
Aquí, la aplicación de CLEM en sección a células HEPG2 hambrientas reveló que LC3 se localizaba predominantemente en estructuras identificadas como autofagosomas. Además, se encontraron algunas manchas débilmente fluorescentes en los autolisosomas. Esto contrasta directamente con las células tratadas con BafA19 y refleja la rápida degradación de las proteínas autofagosomales una vez que el autofagosoma se fusiona con los lisosomas. En general, los datos demostraron que el CLEM de criosecciones descongeladas puede proporcionar información sobre la autofagia mediada por LC3 en condiciones nativas. Los datos también ponen de manifiesto la sensibilidad de la tecnología, ya que la LC3 se detectó incluso en autolisosomas que contienen solo niveles bajos de epítopos de LC3 intactos. La aplicación adicional de esta técnica mediante la obtención de imágenes de LC3 en diferentes modelos y condiciones mejorará nuestra comprensión de la autofagia y otros procesos biológicos mediados por LC3, como la fagocitosis asociada a LC3 o la conjugación de ATG8 en membranas individuales.
Más allá de la autofagia, el CLEM en sección se puede aplicar a otros eventos o estructuras raras, como la división celular, la infección, los tipos de células raras en los tejidos, los cinetocoros, los cilios primarios o los orgánulos específicos del tipo celular. La detección efectiva del tema de interés por parte de IF puede facilitar en gran medida el estudio ultraestructural de estas rarezas. Además, se demostró14 que la técnica puede ser utilizada para localizar proteínas de una manera más sensible que la inmuno-EM clásica. El ajuste de la longitud de fijación puede ampliar aún más esta sensibilidad, lo que permite la localización ultraestructural de proteínas muy poco abundantes o poco antigénicas. Por último, el método CLEM en sección facilita la selección rápida de un número cuantitativo de orgánulos, lo que facilita un análisis más robusto de la distribución ultraestructural de una proteína determinada.
CLEM en criosecciones requiere el equipo y la experiencia para la criosección. En los grupos con acceso a estas herramientas (p. ej., criomicrótomos), la implementación de CLEM en sección es sencilla y solo requiere la disponibilidad de un microscopio automatizado de campo amplio, una configuración a la que la mayoría de los laboratorios tienen acceso. Además, el método está disponible en instalaciones de ME en todo el mundo. Dado que el CLEM en sección combina la aplicación de los métodos IF y EM establecidos, el método se adapta fácilmente y puede combinarse con, por ejemplo, la tomografía 20,33,43, el volumen de sección en serie EM de un número limitado de secciones 44 o la microscopía de superresolución 45. Esta versatilidad del método admite aplicaciones a una amplia gama de cuestiones biológicas.

La autofagia es un proceso clave para la eliminación y el reciclaje de proteínas y orgánulos citoplasmáticos. El proceso de macroautofagia (en lo sucesivo denominado autofagia) implica la formación de orgánulos de doble membrana, los autofagosomas, que permiten a las células encerrar moléculas citoplasmáticas y orgánulos para su degradación lisosomal. La autofagia ocurre a nivel basal en la mayoría de las células y se regula al alza en respuesta a las condiciones celulares, como la inanición o el estrés celular. La autofagia se produce de una manera específica del sustrato, dirigiéndose a estructuras o proteínas específicas para su degradación, o como un proceso a granel no selectivo que abarca partes del citosol. En la autofagia selectiva, los autofagosomas se forman por la conjugación de proteínas de la familia Atg8 (proteínas asociadas a microtúbulos 1A/B, cadena ligera 3A/B/C [LC3] y GABARAPs) a membranas derivadas del reciclaje de endosomas, el Golgi y/o el retículo endoplásmico (RE)1. LC3 reconoce la carga autofágica en el citosol directamente o a través de adaptadores de autofagia selectiva como P62/SQSTM. Las nuevas membranas autofágicas pueden conjugarse con LC3, expandirse y fusionarse para formar una membrana doble completa que encierra la carga, llamada autofagosoma. El autofagosoma madura y finalmente se fusiona con un endosoma o lisosoma, tras lo cual la carga autofágica y los adaptadores se degradan2.
Los estudios sobre la formación, maduración y fusión de autofagosomas a menudo hacen uso de tecnologías de microscopía óptica. La microscopía de fluorescencia de LC3 se utiliza generalmente para evaluar el número y la localización celular de los autofagosomas en diferentes condiciones. Además, al acoplar LC3 a GFP sensible al pH y RFP estable al pH en una llamada sonda en tándem, se puede medir el flujo general de autofagia en células vivas en función de la pérdida de fluorescencia de GFP3. Estos enfoques son herramientas valiosas para que los investigadores comprendan el papel y el mecanismo de la autofagia en diferentes condiciones. Otra herramienta invaluable es la microscopía electrónica (EM), que revela la ultraestructura de orgánulos autofágicos en diferentes etapas de la autofagia 4,5,6,7,8. Hasta la fecha, la EM sigue siendo el método de elección para identificar las etapas precisas de la formación de autofagosomas mediante la discriminación de diferentes membranas autofágicas por morfología: fagóforo (doble membrana no completamente cerrada), autofagosoma (doble membrana cerrada alrededor de la carga citosólica) y autolisosoma (pérdida [parcial] de la membrana autofágica interna). Sin embargo, la morfología sin información molecular puede ser propensa a la identificación errónea o a la ambigüedad. Immuno-EM es el método más completo para la caracterización molecular simultánea y la clasificación morfológica de orgánulos autofágicos. Por ejemplo, el marcaje inmunogold de LC3 en criosecciones descongeladas permite la localización ultraestructural de LC3 y la identificación precisa de orgánulos marcados con LC39.
Un inconveniente de la EM es el pequeño campo de visión que conlleva el gran aumento necesario para observar la fina ultraestructura de las membranas autofágicas y, en el caso de la inmuno-EM, para localizar la etiqueta que marca la proteína de interés. Debido a su escasez y bajos niveles de proteínas, esto generalmente dificulta el análisis cuantitativo de EM de los autofagosomas. Para aumentar el número de autofagosomas, las células a menudo se privan de alimentos y se tratan con bafilomycin A1 (BafA1), un inhibidor de la acidificación y degradación lisosomal. Sin el tratamiento con BafA1, la búsqueda de autofagosomas por EM requiere mucho tiempo, debido a la escasez de estos orgánulos. El método presentado en este manuscrito aborda este problema a través del marcaje fluorescente y la obtención de imágenes de LC3 endógena en criosecciones descongeladas en un microscopio de fluorescencia antes de la preparación adicional para la EM. A continuación, las imágenes fluorescentes guían la búsqueda de estructuras marcadas con LC3 en el EM. Después de la recolección, las imágenes EM se correlacionan con las imágenes de fluorescencia para agregar información molecular (la presencia de LC3) a la ultraestructura de la célula. Este método de "CLEM en sección" aumenta en gran medida la capacidad de encontrar estructuras marcadas con LC3, especialmente en condiciones no tratadas, para su posterior identificación y clasificación por EM.
Este método se aplicó a células HEPG210 derivadas de hepatoblastoma que no estaban saturadas para encontrar autofagosomas en condiciones inalteradas (es decir, no se utilizó BafA1). Se encontraron relativamente pocos puntos fluorescentes (menos de uno por perfil celular en una sección de 90 nm), lo que concuerda con el alto recambio de la CL311. Esta escasez de puntos de LC3 enfatizó el valor de CLEM; mediante la selección de regiones con varios puntos fluorescentes para la obtención de imágenes en el ME, se encontraron orgánulos positivos para LC3 y se caracterizaron de una manera mucho más efectiva que a través de la inmuno-EM convencional. Esto reveló que la mayoría de los orgánulos LC3 positivos eran autofagosomas, definidos por su morfología, lo que contrasta con los resultados obtenidos en células tratadas con BafA1, donde los autolisosomas son más comunes9. Estos datos muestran que con CLEM en sección, la autofagia se puede estudiar a nivel ultraestructural sin necesidad de inhibir el flujo autofágico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

La visualización de orgánulos autofágicos a nivel ultraestructural mediante microscopía electrónica (EM) es esencial para establecer su identidad y revelar detalles que son importantes para comprender el proceso autofágico. Sin embargo, los métodos de EM a menudo carecen de información molecular, lo que obstruye la correlación de la información ultraestructural obtenida por EM con la localización basada en microscopía de fluorescencia de proteínas específicas de autofagia. Además, la rareza de los autofagosomas en condiciones celulares inalteradas dificulta la investigación por parte de la EM, que requiere un gran aumento y, por lo tanto, proporciona un campo de visión limitado.
En respuesta a ambos desafíos, se aplicó un método de microscopía óptica y electrónica correlativa en sección (CLEM) basado en el marcaje fluorescente para correlacionar un marcador autofagosomal común, LC3, con la ultraestructura EM. El método se utilizó para cribar rápidamente las células en microscopía de fluorescencia para el marcaje de LC3 en combinación con otros marcadores relevantes. Posteriormente, CLEM identificó las características ultraestructurales subyacentes de puntos seleccionados marcados con LC3. El método se aplicó a células hambrientas sin añadir inhibidores de la acidificación lisosomal.
En estas condiciones, la LC3 se encontró predominantemente en los autofagosomas y raramente en los autolisosomas, en los que la LC3 se degrada rápidamente. Estos datos muestran tanto la viabilidad como la sensibilidad de este enfoque, demostrando que CLEM se puede utilizar para proporcionar información ultraestructural sobre la autofagia mediada por LC3 en condiciones nativas, sin tratamientos farmacológicos ni alteraciones genéticas. En general, este método presenta una herramienta valiosa para los estudios de localización ultraestructural de proteínas de autofagia y otros antígenos escasos al unir la microscopía óptica con los datos de EM.

De Maziere et al.9 han publicado recientemente un protocolo inmuno-EM optimizado para el marcaje inmuno-oro de LC3 en criosecciones ultrafinas9. Este estudio incluyó condiciones de inanición sin BafA1, en las que la LC3 estaba presente, pero era relativamente rara y difícil de encontrar por EM. En un estudio separado se introdujo un método CLEM en sección, que utiliza la sensibilidad del marcaje de fluorescencia para visualizar proteínas endógenas relativamente raras y de baja expresión y correlacionarlas con la ultraestructura EM14. En este caso, estos dos enfoques se combinan mediante el uso del protocolo de etiquetado LC3 optimizado como parte de un enfoque CLEM.
Las células HEPG2, células derivadas del hígado con niveles relativamente altos de autofagia basal22, se sometieron a inanición en un medio mínimo (solución salina equilibrada de Earle [EBSS]) durante 2 h antes de la fijación en PFA al 4%. A esto le siguió la preparación de la muestra mediante el método Tokuyasu de criosección ultrafina (secciones 1-3; ver Ranura y Geuze12), que es altamente compatible con CLEM en la sección14,23. Las criosecciones descongeladas se marcaron con fluorescencia (sección 4 del protocolo y Figura 1) utilizando el anticuerpo primario anti-LC3 de ratón9. Además, se utilizó anti-LAMP1 de conejo para indicar endolisosomas, seguido de anticuerpos secundarios anti-ratón AlexaFluor488 y anti-conejo AlexaFluor568. Las rejillas se intercalaron entre un cubreobjetos y un portaobjetos de vidrio y se tomaron imágenes en RT en un microscopio de campo amplio (objetivo de aceite de 100x 1,47 NA, cámara sCMOS).
Una ventaja del marcaje por fluorescencia de secciones delgadas sobre el IF convencional de célula entera es el aumento de la resolución en Z, ya que el espesor físico de la sección es de 60-90 nm. Con esta resolución Z mejorada, el marcaje de fluorescencia de LC3 y LAMP1 en secciones delgadas revela muy poca colocalización (Figura 2A). En las células tratadas con inhibidores lisosomales, como BafA1, se produce una alta colocalización, ya que la LC3 encerrada en lisosomales permanece sin degradar9. En las células no tratadas, la LC3 se degrada rápidamente al entrar en contacto con lisosomas positivos para LAMP1 enzimáticamente activos y, por lo tanto, la colocalización es rara en estas condiciones. En general, se observó menos de un punctum LC3 por perfil celular. Esto indica que incluso en condiciones de inanición, el recambio de autofagosomas es rápido, lo que mantiene bajos los números de autofagosomas. También destaca la importancia de utilizar CLEM para encontrar las raras estructuras marcadas con LC3, utilizando el gran campo de visión proporcionado por la microscopía óptica. Además, la mayor sensibilidad del marcaje de fluorescencia en comparación con el marcaje de oro permite la identificación de más orgánulos positivos para LC3 que en la inmuno-EM convencional, lo que ayuda aún más a su caracterización.
Después de adquirir un mosaico completo de la cinta de secciones, las cuadrículas se recuperaron del microscopio y se tiñeron posteriormente para EM utilizando UA y el método de bucle de salida (pasos de protocolo 4.4-4.6; Figura 1F,G). Este método de "bucle de salida" garantiza que una fina capa de UA:metilcelulosa permanezca en la rejilla, lo que crea el contraste deseado en el EM. El grosor de la capa depende de la velocidad y el ángulo con el que la UA:metilcelulosa se seca en el papel de filtro. Arrastrar el bucle demasiado rápido puede dejar demasiada UA:metilcelulosa en la cuadrícula y oscurecer la apariencia de las secciones en EM. Arrastrar demasiado despacio puede extraer demasiada UA:metilcelulosa, lo que da como resultado muy poca tinción y mala morfología, y corre el riesgo de que la rejilla se salga del bucle. La coloración "mancha de aceite" (Figura 1G) en rejillas secas indica un espesor adecuado de la capa de UA:metilcelulosa.
Después del bucle y el secado, las rejillas se visualizaron en un TEM a ROI seleccionadas por fluorescencia. Los conjuntos de datos de FI y EM se correlacionaron superponiendo la señal DAPI a los contornos de los núcleos visibles en el ME, generando una imagen integrada que contiene información de ambas modalidades.
Encontrar la misma área en EM que la seleccionada en IF puede ser un desafío. Por lo tanto, se recomienda tener a mano una imagen general del conjunto de mosaicos de FI mientras se busca en el EM. Los usuarios deben buscar características reconocibles en ambas modalidades, como pliegues o rasgaduras en las secciones, barras de cuadrícula o disposición de núcleos. También es importante tener en cuenta que la muestra puede aparecer rotada y reflejada en EM. Se pueden utilizar "cuadrículas de búsqueda" con características específicas para identificar áreas para facilitar la correlación (consulte la Tabla de materiales).
La correlación de los orgánulos LC3 positivos con la ultraestructura EM reveló que los diferentes puntos representaban distintas etapas de autofagia (Figura 2B). Aunque la preservación de la ultraestructura autofagosómica es un desafío en las criosecciones, se observaron con frecuencia orgánulos con contenido citoplasmático y membranas dobles (Figura 2C, flechas en orgánulos 1-5; Figura suplementaria S1), que son características morfológicas definitorias de los autofagosomas. Curiosamente, los puntos fluorescentes bastante débiles fueron identificados por EM como autolisosomas LC3 positivos (Figura 2C, orgánulo 6; el contenido autofágico está marcado con *), caracterizados por un contenido denso y vesículas intraluminales. Esto mostró que cantidades muy pequeñas de LC3 son visibles en el FI de las criosecciones ultrafinas, e indicó que, a pesar del entorno degradativo, algunas LC3 son detectables en autolisosomas en estado estacionario. Sin embargo, la mayoría de los punchas positivos para LC3 representaban autofagosomas, mientras que los autolisosomas eran muy raros. Esto contrasta con las células tratadas con BafA1, que acumulan principalmente autolisosomas y no autofagosomas9.
En resumen, este protocolo describe un método CLEM en sección para vincular la información molecular obtenida por microscopía de fluorescencia con la ultraestructura de EM. Este método aumenta la sensibilidad de la inmuno-EM, ya que solo se utilizan fluoróforos para el marcaje y estos generalmente producen más señal que las sondas EM. El método es especialmente adecuado para el uso de criosecciones ultrafinas, en las que se pueden obtener altos niveles de fluorescencia específica sobre una tinción de fondo insignificante. Mediante el uso de la fluorescencia para detectar estructuras o eventos raros y correlacionar los ROI seleccionados con los EM, el tiempo de operación de EM y los costos asociados pueden reducirse considerablemente. La sensibilidad y viabilidad del método queda demostrada por la visualización de LC3 en células no tratadas y hambrientas, mostrando que LC3 se asocia predominantemente a autofagosomas en estas condiciones, con niveles muy bajos visibles en autolisosomas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figura 1: Vista general esquemática del CLEM en sección . (A) Las criosecciones de células incluidas en gelatina se recogen en una rejilla de cobre recubierta de formvar. (B) Las rejillas se procesan de sección hacia abajo en gotas de las soluciones apropiadas. (C) Las rejillas están marcadas con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes. (D) Las rejillas se intercalan entre un cubreobjetos y un portaobjetos de vidrio en glicerol al 50%. (E) Las imágenes de fluorescencia se recogen en un microscopio de campo amplio. (F) Las rejillas se recuperan del portaobjetos de vidrio y se procesan posteriormente mediante tinción de uranilo para EM. (G) Después del secado, las rejillas pueden ser fotografiadas por TEM. (H) El mosaico de imágenes TEM de gran aumento se adquiere de un área seleccionada a partir de datos de fluorescencia. (I) Las imágenes de la microscopía de fluorescencia y la microscopía electromagnética se correlacionan y se superponen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figura 2: CLEM de LC3 y LAMP1 en células HEPG2 hambrientas. Las células HEPG2 se privaron de presencia durante 2 h en EBSS antes de la fijación con PFA al 4% durante 2 h. (A) Las imágenes de FI de LC3 (verde) y LAMP1 (rojo) en secciones revelan relativamente pocos puntos de LC3 y poca colocalización con LAMP1. (B) Vincular la información molecular de IF (panel izquierdo) con la información ultraestructural obtenida en EM (panel central) mediante la superposición de las dos modalidades de imagen basadas en DAPI y contornos nucleares (líneas discontinuas, panel derecho). La ultraestructura de los compartimentos individuales marcados con LC3, como se ejemplifica en el recuadro 1 (panel derecho), se muestra en C. (C) Ultraestructura de los compartimentos positivos para LC3. Las imágenes CLEM se muestran a la izquierda y las imágenes EM pseudocoloreadas (beige) a la derecha (las imágenes EM sin color se muestran en la Figura Suplementaria S1). Las membranas autofagosomales internas y externas están indicadas por puntas de flecha blancas y negras, respectivamente. El contenido autofágico dentro del autolisosoma en el ejemplo 6 se indica con *. Barras de escala = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Imágenes EM sin color de orgánulos LC3 positivos. (De la A a la F) Imágenes EM sin colorear de ejemplos pseudocoloreados 1-6 que se muestran en la Figura 2C. Los orgánulos se seleccionaron mediante fluorescencia LC3, como se describe en la Figura 2. Las membranas autofagosomales internas y externas están indicadas por puntas de flecha blancas y negras, respectivamente. El contenido autofágico dentro del autolisosoma en el ejemplo 6 se indica con *. Barras de escala = 200 nm. Abreviaturas: AL = autolisosoma; AP = autofagosoma; M = mitocondria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: Tampones y soluciones utilizadas en este estudio. Este archivo complementario contiene las recetas y protocolos necesarios para fabricar los tampones y soluciones utilizados en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Aquí, presentamos un protocolo para la microscopía correlativa de luz-electrónica optimizada en sección basada en el marcaje endógeno y fluorescente como herramienta para investigar la localización de proteínas raras en relación con la ultraestructura celular. El poder de este enfoque se demuestra mediante la localización ultraestructural de LC3 endógena en células hambrientas sin tratamiento con bafilomycina.

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

La localización de proteínas en el contexto de la ultraestructura de la célula ha sido una poderosa herramienta de investigación durante décadas. Con este protocolo, ampliamos las proteínas que son escasas en abundancia o difíciles de localizar. Utilizamos la microscopía de fluorescencia para marcar proteínas de una manera sensible y cribable y la combinamos con microscopía electrónica para rellenar la ultraestructura de la célula.Aquí demostraremos en la sección CLEM sobre las proteínas de la autofagia, pero realmente se puede aplicar a cualquier cuestión biológica en la que la ultraestructura de la célula sea de interés, especialmente en el estudio de eventos raros. Demostrando el procedimiento conmigo estará Tineke Veenendaal, una técnica de investigación sénior de nuestro laboratorio. Para comenzar, reemplace el PBS que contiene 0.15% de glicina con 1% de gelatina en PBS precalentado a 37 grados Celsius.Raspe y transfiera las células en gelatina a un tubo de microcentrífuga. Granular las células a 6.000 G durante un minuto a temperatura ambiente en una microcentrífuga y luego retirar la gelatina sin alterar el gránulo. Añadir un 12% de gelatina calentada a 37 grados centígrados al pellet y volver a suspender suavemente pipeteando con puntas de pipeta o pipetas de vidrio para pastos precalentadas a la misma temperatura.Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego pellet las células a 6.000 g durante un minuto. Solidifica la gelatina en hielo durante 30 minutos. Para eliminar las células incrustadas en gelatina del tubo, corte el extremo del tubo que contiene el gránulo del resto del tubo con una cuchilla de afeitar.A continuación, corte el extremo del tubo con el gránulo de la celda por la mitad perpendicular al primer corte. Coloque las dos mitades de los extremos del tubo que contienen el gránulo celular en sacarosa molar 2.3 e incube durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Esto hace que las mitades de los gránulos celulares se encojan ligeramente y se desprendan del tubo de plástico.Retire las mitades del tubo con el gránulo celular incrustado en gelatina de la sacarosa y luego retire las mitades del gránulo celular de las mitades del tubo de plástico con pinzas. Corta manualmente el gránulo en bloques de un tamaño adecuado con una cuchilla de afeitar y utiliza un microscopio de disección estereoscópica para ampliar el sujeto durante el corte. Incubar los bloques celulares durante la noche en sacarosa molar 2,3 a cuatro grados centígrados.Colóquelos en un pasador portamuestras de aluminio. Deje suficiente sacarosa alrededor de los bordes del bloque para que forme un collar delgado entre el bloque y el alfiler. Congélelo y guárdelo en nitrógeno líquido.Recorta la parte frontal del bloque para aplanar su superficie y obtener secciones de alrededor de 250 nanómetros de grosor. A continuación, recorte los lados del bloque seccionando de 50 a 100 micrómetros en el lado de la cara del bloque de muestra con la esquina de la cuchilla. Recortar cuatro lados de la cara del bloque de muestra creará un rectángulo que sobresale de alrededor de 250 por 375 micrómetros.Separe una cinta del rectángulo que sobresale, asegurándose de que las secciones tengan entre 70 y 90 nanómetros de grosor y tengan un brillo dorado plateado. Guíe las secciones lejos del filo del cuchillo de diamante con un pelo en un palo para crear una cinta larga. Levante la cinta sumergiendo el bucle de recogida de tres milímetros en una mezcla uno a uno de sacarosa molar 2,3 y metilcelulosa al 2%.Inserte el bucle en la cámara criogénica del micrótomo y, una vez que la gota comience a congelarse, recoja rápidamente las secciones presionando suavemente la gota contra ellas. Retire el asa de la cámara criogénica. Espere hasta que la gota se haya descongelado por completo y presione la gota sobre una rejilla preparada.Coloque las rejillas con secciones de alrededor de un mililitro de PBS en un plato pequeño o plato de pocillos múltiples e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Procese las rejillas en alrededor de 75 microlitros de gotas en Parafilm y comience con lavados de glicina PBS a temperatura ambiente. Incubar las rejillas con un tampón de bloqueo compuesto por 0,1 % de albúmina C sérica bovina y 0,5 % de gelatina de piel de pescado en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente como paso de bloqueo.Diluir los anticuerpos primarios en tampón de bloqueo en PBS e incubar las rejillas en unas 10 gotas de microlitros de esta solución durante una hora a temperatura ambiente. Lavar las rejillas en albúmina sérica bovina al 0,1% en PBS cinco veces a temperatura ambiente. Diluir los anticuerpos secundarios y DAPI en el tampón de bloqueo en PBS.A continuación, incube las rejillas en unas 10 gotas de microlitros de esta solución durante 30 minutos o más a temperatura ambiente antes de lavar las rejillas en PBS cinco veces, como se ha mostrado anteriormente. Para montar las muestras para microscopía óptica, sumerja las rejillas en glicerol al 50% en agua destilada dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque una rejilla por cubreobjetos entre un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos al 50% de glicerol, asegurándose de que las secciones estén orientadas hacia el cubreobjetos.Para microscopía óptica, lleve un portaobjetos de vidrio con las rejillas intercaladas a un microscopio de campo amplio con una platina automatizada. Seleccione un objetivo de óleo de gran aumento y cree un conjunto de mosaicos de imagen de la cinta de secciones. A continuación, para el desmontaje y la microscopía electrónica o el contraste EM, agregue 10 microlitros de agua destilada al costado del sándwich deslizante de la cubierta deslizante de vidrio y espere la acción capilar para llenar la interfaz del sándwich deslizante de la cubierta de vidrio.Retire con cuidado el cubreobjetos sin mezclar el aceite de inmersión en el glicerol. Recupere las rejillas con pinzas y sumérjalas en agua destilada tres veces a temperatura ambiente para eliminar el 50% de glicerol. Seque cuidadosamente la parte posterior de la rejilla con un papel de seda sin pelusa y coloque la sección de la rejilla con el lado hacia abajo sobre gotas de agua destilada.Para teñir las secciones para contrastar en microscopía electrónica, incubarlas con acetato de uranilo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Enfríe la solución de metilcelulosa de acetato de uranilo colocando las gotas en Parafilm en una placa de metal sobre hielo. Luego lave las rejillas con esta solución helada dos veces e incube en la solución durante 10 minutos.Realice un bucle de secado de rejilla insertando un bucle de secado de rejilla en la gota de metilcelulosa de acetato de uranilo debajo de cada rejilla y levantándola suavemente hasta que la rejilla se desprenda de la gota. Para secar el exceso de solución, toque el bucle en un ángulo de aproximadamente 60 grados sobre el papel de filtro sin pelusa y arrástrelo lentamente a lo largo del papel hasta que no se absorba más solución. Coloque el lazo con la rejilla en una rejilla adecuada y déjelo secar a temperatura ambiente durante más de 10 minutos.Utilice la visión general obtenida por microscopía óptica para localizar una región de interés para la obtención de imágenes en el microscopio electrónico de transmisión o TEM, y anote el ROI en el conjunto de datos de microscopía óptica. Una vez seleccionada una región, obtenga un mosaico de imagen establecido con un aumento de 20.000x a 50.000x en el TEM. Reconstruya el conjunto de mosaicos de imágenes en el software de posprocesamiento.Realizar la correlación basada en la señal DAPI y la fluorescencia y los contornos nucleares en microscopía electrónica. Cambie las imágenes para superponerlas con precisión y realice la correlación manual con precisión. Las células HEPG2 derivadas del hepatoblastoma se sometieron a privación de alimentos durante dos horas en EBSS antes de la fijación con paraldehído al 4% durante dos horas.Las imágenes de FI de LC3 y LAMP1 en secciones revelan relativamente pocos puntos de LC3 y poca colocalización con LAMP1. La información molecular de la FI se vinculó a la información ultraestructural obtenida en microscopía electrónica mediante la superposición de las dos modalidades de imagen basadas en DAPI y contornos nucleares. La correlación de los orgánulos positivos para LC3 con la ultraestructura EM reveló que los diferentes puntos representaban distintas etapas de la autofagia.Aquí se muestra la ultraestructura de los compartimentos individuales etiquetados con LC3, como se ejemplifica en el cuadro uno. Las imágenes de microscopía electrónica de luz correlativa se muestran a la izquierda, y las imágenes de microscopía electrónica pseudocoloreada se muestran a la derecha. Las membranas autofagosomales internas y externas están indicadas por puntas de flecha blancas y negras.Curiosamente, EM identificó puntos fluorescentes relativamente débiles como autolisosomas LC3 positivos, que se caracterizan por un contenido denso y vesículas intraluminales. Esto revela una visibilidad mínima de LC3 en FI de secciones criogénicas ultradelgadas, lo que sugiere LC3 detectable en autolisosomas de estado estacionario a pesar del entorno degradativo. Sin embargo, los puntos positivos de LC3 representan principalmente autofagosomas y pocos autolisosomas.Para los investigadores que desean realizar el marcaje de inmunogold en lugar de CLEM en sección, los protocolos y consejos descritos aquí también son totalmente aplicables para el etiquetado de immunogold. Inicialmente aplicamos CLEM en sección a proteínas reguladoras endosomales de baja abundancia y mostramos por primera vez su localización ultraestructural endógena.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Investigación

Biología

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Congelación rápida utilizando un dispositivo de congelación sándwich para una buena preservación ultraestructural de especímenes biológicos en microscopía electrónica

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión