Name: ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-31T13:45:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Vi tackar våra kollegor vid Center for Molecular Medicine vid University Medical Center Utrecht för givande diskussioner och feedback. Vi tackar tidigare och nuvarande kollegor i Klumperman-labbet för att de gör kontinuerliga förbättringar i vår mikroskopiteknik. EM-infrastrukturen som används för detta arbete är en del av forskningsprogrammet National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI) finansierat av det nederländska forskningsrådet (NWO), projektnummer 184.034.014 till JK.

1. Beredning av verktyg och reagenser
OBS: För nödvändiga reagenser, buffertar och lösningar, se Kompletterande File 1 eller 12 för mer information. För detaljer relaterade till alla material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll, se materialtabellen.
<ol><li>Fixeringsmedel<ol><li>Förbered 0,2 M fosfatbuffert (PB) eller 0,2 M RÖR, HEPES, EGTA, MgSO4 (PHEM) buffert, enligt beskrivningen i kompletterande fil 1, för att använda som bas för fixativa lösningar. OBS: Fixeringsmedel buffras rutinmässigt i 0,1 M PB- eller PHEM-buffert för att buffra mot försurning orsakad av aldehydreaktionen med det biologiska materialet.</li>
		<li>Eftersom kvaliteten på paraformaldehyden (PFA) är nyckeln till tillförlitlig fixering av provernas ultrastruktur, använd PFA av EM-klass. För att följa detta protokoll, använd 16 % stamlösningar, framställda av högkvalitativa PFA-prillor (se kompletterande fil 1). VARNING: Paraformaldehyd är en farlig kemikalie (faroangivelser H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350). När du arbetar med PFA, använd skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) och arbeta i en kemisk huva. Avfall som innehåller PFA ska samlas in och deponeras enligt institutets riktlinjer och föreskrifter.</li>
		<li>Kombinera 10 ml 0,2 M PB, 5 ml 16 % PFA (i demineraliserat vatten [dH 2 O]) och 5 ml dH2O för att bereda en fixativ lösning av 4 % PFA.</li>
		<li>Valfritt: Tillsats av 0,02%-0,5% glutaraldehyd (GA) till fixeringslösningen från steg 1.1.3 förbättrar bevarandet av ultrastrukturen, men minskar provets antigenicitet mot många antikroppar. OBS: När GA-fixering önskas, använd EM-grade GA från en lämplig leverantör. VARNING: Glutaraldehyd är en farlig kemikalie (faroangivelser H301, H302, H314, H317, H330, H332, H334, H335, H400, H411). Arbeta i en kemisk huva och använd skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) när du manipulerar GA. Avfall som innehåller GA ska samlas in och kasseras enligt institutets riktlinjer och föreskrifter.</li>
	</ol></li>
	<li>Verktyg och material<ol><li>Repa ytan på aluminiumprovhållarstift och sonikera dem i etanol 3 x 10 minuter för att ta bort metallrester och säkerställa optimal vidhäftning när gelatininbäddade cellblock är monterade på stiften.</li>
		<li>Använd en förvaringsbehållare som är lämplig för att förvara aluminiumprovhållarstiften med deras samples i flytande kväve (LN2).</li>
		<li>Gör en manipulator genom att fästa ett enda hårstrå eller ögonfrans i änden av ett träspett med nagellack.</li>
		<li>Gör en pickup-loop. Böj en 0,3 mm tjock rostfri ståltråd runt en rundstång med en diameter på 3 mm och vrid ihop ändarna så att det bildas en ögla i ena änden. Sätt in de tvinnade ändarna i en pipettspets. Sätt i ett träspett från andra änden och fäst med lim eller harts. OBS: En pickupslinga är också kommersiellt tillgänglig (se materialförteckning).</li>
		<li>För att förbereda gallertorköglorna, följ samma steg för att göra uppsamlingsöglor: forma en rostfri ståltråd i en 4 mm ögla och fäst på en stor pipettspets med lim eller harts.</li>
		<li>Belägg gallren med en tunn stödfilm som formvar (protokoll i kompletterande fil 1). Täck gallren med ett tunt lager kol före användning. OBS: Färdiga galler är kommersiellt tillgängliga (se materialförteckning). Formvar-belagda galler kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur (RT); kolbelagda galler kan lagras i flera månader på RT.</li>
		<li>Förbered rena glasskivor och stora täckglas (24 mm x 24 mm är idealiskt med 25 mm breda glasskivor), som i 13.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixering och provberedning
<ol><li>Fixering<ol><li>Använd fixeringsmedlet som beretts i steg 1.1.3 (4 % PFA i 0,1 M PB). För vidhäftande cellinjer, odla 1-5 × 10 6 celler i6 cm skålar. Tillsätt fixeringsmedlet till odlingsmediet i förhållandet 1:1 och inkubera provet i 5 minuter vid RT. Byt sedan ut den medelfixerande blandningen mot endast fixeringsmedel och inkubera i 2 timmar vid RT. OBS: Exakta cellantal, sammanflöde och odlingsförhållanden kan variera beroende på vilket modellsystem som används.</li>
		<li>Förvara proverna över natten eller i upp till 3-4 veckor i 0,5 % PFA i 0,1 M PB vid 4 °C. OBS: GA kan läggas till fixeringen (se steg 1.1.4) och fixeringslängden kan ändras för att hitta en optimal balans mellan bevarandet av morfologi och antigenicitet, som skiljer sig åt per prov och märkning. För mer information, se14.</li>
	</ol></li>
	<li>Exempel på inbäddning<ol><li>Diska disken med fasta celler 3x med PBS vid RT. Byt sedan ut mot PBS som innehåller 0,15 % glycin och inkubera i 10 minuter vid RT.</li>
		<li>Byt ut PBS som innehåller 0,15 % glycin mot 1 % gelatin i PBS förvärmt till 37 °C, och skrapa och överför cellerna i 1 % gelatin till ett mikrocentrifugrör. Pelletera cellerna vid 6 000 × g i 1 minut vid RT i en mikrocentrifug. Ta sedan bort 1 % gelatin utan att störa pelleten och tillsätt 12 % gelatin uppvärmt till 37 °C. Återsuspendera cellpelleten genom att försiktigt pipettera upp och ner med pipettspetsar eller Pasteur-pipetter av glas som förvärmts till 37 °C.</li>
		<li>Inkubera vid 37 °C i 10 minuter. Pelletera sedan cellerna med 6 000 × g i 1 minut. Stelna gelatinet på is i 30 min.</li>
		<li>För att ta bort de gelatininbäddade cellerna från röret, skär av röränden som innehåller pelleten från resten av röret med ett rakblad. Skär sedan röränden med cellpelleten på mitten vinkelrätt mot det första snittet.</li>
		<li>Inkubera de två halvorna av röränden som innehåller den gelatininbäddade cellpelleten i 2,3 M sackaros i 10 minuter vid 4 °C. Detta gör att de gelatininbäddade cellpelletshalvorna krymper något och lossnar från plaströret. OBS: De gelatininbäddade cellpelletsen bör förvaras vid 4 °C eller iskall så mycket som möjligt för att undvika att 2.3 M sackaros blir för trögflytande och gelatinet för mjukt. Under manipulation av de gelatininbäddade cellpelletsen i nästa steg, arbeta med endast ett prov åt gången och håll de andra på is, eller arbeta i ett kallt (~4 °C) rum. Undvik överhettning av de gelatininbäddade cellpelletsen av solljus, heta mikroskop lamps, eller andra värmekällor.</li>
		<li>Ta bort rörhalvorna med den gelatininbäddade cellpelleten från 2.3 M sackaros. Ta sedan bort de gelatininbäddade cellpelletshalvorna från plaströrshalvorna med en pincett. Skär pelleten manuellt till block av lämplig storlek (~1 mm3) med ett rakblad. Använd ett stereodissekeringsmikroskop för att förstora motivet under skärningen.</li>
		<li>Låt de gelatininbäddade cellblocken dra in 2,3 M sackaros i 3–16 timmar och vänd från ände till ände i en rotor vid 4 °C.</li>
		<li>Placera ett gelatininbäddat cellblock på en provhållarstift av aluminium (se steg 1.2.1). Lämna tillräckligt med 2,3 M sackaros runt kanterna på blocket så att det bildar en tunn "krage" mellan blocket och stiftet. Undvik för mycket 2,3 M sackaros som täcker toppen av blocket. Snap-frys och förvara i LN2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sektionering
<ol><li>Trimning (se även12)<ol><li>Ta ut en nål med ett block av gelatininbäddade celler ur LN2-förvaringen och placera den i en kryomikroom inställd på -80 °C.</li>
		<li>Trimma framsidan av blocket för att platta till ytan och få ~250 nm sektioner. Doppa 3 mm-öglan i pickup-lösning (1:1 2,3 M sackaros och 2 % metylcellulosa), sätt in öglan i mikrotomens kryokammare och vänta tills is börjar bildas i droppen (vanligtvis 5-7 s). Plocka sedan omedelbart upp sektionen genom att snabbt men försiktigt trycka droppen mot dem. Ta bort öglan från kryokammaren, vänta tills droppen har tinat helt och tryck droppen på en glasskiva.</li>
		<li>Kontrollera cellorienteringen genom att färga sektionerna med toluidinblått.<ol><li>Placera en droppe toluidinblå lösning (se kompletterande fil 1) ovanpå sektionerna på ett glasglas och torka på en 80 °C värmeplatta tills droppens kanter är torra.</li>
			<li>Ta bort glasskivan från värmeplattan och skölj försiktigt bort den toluidinblå med dH2O, samla upp den i en lämplig avfallsbehållare.</li>
			<li>Torka glasglaset och kontrollera cellorienteringen i sektionerna genom ett enkelt bordsmikroskop.</li>
		</ol></li>
		<li>Trimma blockets sidor genom att snitta 50-100 μm i sidan av provblockets yta med knivhörnet. Trimma fyra sidor av sample blockytan genom att vrida sample hållaren 90° efter att ha trimmat varje sida för att skapa en utskjutande ~250 μm x 375 μm rektangel. Välj det utskjutande området baserat på cellorienteringen som bestämdes i föregående steg.</li>
	</ol></li>
	<li>Sektionering och upphämtning<ol><li>Kyl kryomikrotomen till -100 °C. Skär ett band från den utskjutande rektangeln, sektionerna är 70-90 nm tjocka och med en silver-gyllene glans. För bort sektionerna från diamantknivens egg med ett hår på en pinne (se avsnitt 1.2.3) för att skapa ett långt (2-5 mm) band.</li>
		<li>När ett lämpligt band har bildats, sluta dela upp det för att plocka upp bandet. Doppa 3 mm upptagningsöglan i 2,3 M sackaros och 2 % metylcellulosa blandat 1:1, sätt in öglan i mikrotomens kryokammare och vänta tills droppen börjar frysa (vanligtvis 5-7 s). Plocka sedan omedelbart upp sektionerna genom att snabbt men försiktigt trycka droppen mot dem. Ta bort öglan från kryokammaren, vänta tills droppen har tinat helt och tryck droppen på ett förberett galler (steg 1.2.6). OBS: Galler med sektioner kan förvaras vid 4 °C i flera månader.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Märkning och ljusmikroskopi
<ol><li>Märkning<ol><li>Placera gallren med sektioner (Figur 1A) med sektionssidan nedåt på ~1 ml PBS i en liten skål eller tallrik med flera brunnar. Inkubera vid 37 °C i 30 min. OBS: Detta steg tar bort gelatinet som finns mellan cellerna; Gelatin behövs inte efter snittning och stör det återstående protokollet.</li>
		<li>Bearbeta gallren med sektionssidan nedåt på ~75 μL droppar på parafilm (se figur 1B). Börja med PBS + 0,15% glycintvättar (3 x 2 min) vid RT. Inkubera sedan gallren med 0,1 % bovint serumalbumin (BSA)-c + 0,5 % fiskhudsgelatin (FSG) i PBS i 10 minuter vid RT som blockeringssteg. Späd primära antikroppar i 0,1 % BSA-c + 0,5 % FSG i PBS och inkubera gallren på ~10 μL droppar av denna lösning i 1 timme vid RT (figur 1C).</li>
		<li>Tvätta gallren i 0,1% BSA i PBS 5x vid RT. Späd sedan sekundära antikroppar och 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; 10 μg/ml) i 0,1 % BSA-c + 0,5 % FSG i PBS och inkubera gallren på ~10 μL droppar av denna lösning i 30+ minuter vid RT (Figur 1C). Tvätta gallren i PBS 5x på RT. OBS: Alternativt kan en sekundär antikropp märkas med 5, 10, 15 eller 20 nm kolloidala guldpartiklar konjugerade till protein A (PAG) för lokalisering av proteinet av intresse i EM. Om så önskas, inkubera gallren med PAG i 20 min vid RT efter steg 4.1.3. Tvätta sedan 5 gånger med PBS vid RT. Undvik samtidig användning av flera primära antikroppar och notera PAG:s reaktivitet mot olika arters IgG för att förhindra oönskade korsreaktioner. Mer information finns i12.</li>
	</ol></li>
	<li>Monteringsprover för ljusmikroskopi<ol><li>Sänk gallren i 50 % glycerol i dH 2 O2x 5 min vid RT. Kläm in gallren mellan ett glasglas och täckglas i 50 % glycerol, ett galler per täckglas, med sektionerna vända mot täckglaset (Figur 1D). OBS: Kvaliteten på märkningen kan försämras när galler hålls monterade i 50 % glycerol i mer än 30 min. Det rekommenderas därför att montera och avbilda två eller tre galler åt gången och lämna de andra på den sekundära märkningslösningen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ljusmikroskopi<ol><li>Ta en glasskiva med inklämda rutnät till ett vidvinkelmikroskop med ett automatiserat steg. Välj ett oljemål med hög förstoring (63x eller 100x). Skapa en bilduppsättning med (en del av) menyfliksområdet med avsnitt (bild 1E). OBS: Vissa sekundära antikroppar kan bilda fluorescerande aggregat på galler, särskilt runt veck eller revor i sektionerna. Dessutom innehåller vissa celltyper och vävnader autofluorescerande strukturer. Om sådana problem förväntas rekommenderas att man inkluderar ett negativt kontrollgaller som inte inkuberats med primära antikroppar.</li>
	</ol></li>
	<li>Demontering och EM-kontrastering<ol><li>Tillsätt 10 μL dH2O på sidan av glasglas-täckglas-sandwichen och vänta tills kapillärverkan fyller glas-täckglas-sandwich-gränssnittet. Ta försiktigt bort täckglaset utan att blanda nedsänkningsolja i glycerolen. Ta upp gallren med en pincett och sänk ner dem i dH2O 3x vid RT för att tvätta bort 50 % glycerol. OBS: Olja kan störa uranylfärgning och försämra EM-kontrasten.</li>
		<li>Torka försiktigt gallrets baksida med luddfritt silkespapper. OBS: Om sample var också märkt med kolloidala guldpartiklar, utför följande steg: placera gallret med sektioner med sektionen nedåt på PBS-droppar och tvätta 2x vid RT. Postfix i 1% GA i 5 min vid RT (se varningsanmärkning under 1.1.4). Tvättas i PBS 2x på RT.</li>
		<li>Placera gallren med sektionen nedåt på dH2O droppar och tvätta 8x vid RT.</li>
		<li>För att färga sektionerna för kontrast i EM, inkubera med uranylacetat (UA), pH 7, i 5 minuter vid RT (figur 1F).</li>
		<li>Innan gallren placeras, kyl UA:metylcellulosa, pH 4, genom att placera droppar på parafilm på en metallplatta på is. Tvätta sedan gallren med iskall UA:metylcellulosa, pH 4,2x och inkubera med iskall UA:metylcellulosa, pH 4, i 10 min (Figur 1F). VARNING: Uranylacetat är en farlig kemikalie (faroangivelserna H300, H330, H373, H411). I steg som kräver UA, arbeta i en kemisk huva och använd skyddsutrustning (labbrock, handskar och skyddsglasögon). Samla in och deponera avfall som innehåller UA enligt institutens riktlinjer och föreskrifter.</li>
		<li>Slinga ut gallren genom att sätta in en gallertorkande slinga i UA:metylcellulosadroppen under gallret och försiktigt lyfta den tills gallret dras av droppen12. Torka bort överflödig UA:metylcellulosa genom att vidröra öglan i en ~60° vinkel (sektionerna nedåt) på luddfritt filterpapper (se Materialtabell) och dra det långsamt längs papperet tills ingen mer UA:metylcellulosa absorberas. Placera sedan öglan med gallret i ett lämpligt ställ och låt torka i >10 minuter vid RT (Figur 1G).</li>
	</ol></li>
</ol>5. EM
<ol><li>Använd översikten som erhålls med ljusmikroskopi för att lokalisera ett intresseområde (ROI) för avbildning i transmissionselektronmikroskopet (TEM; Figur 1H). Kommentera ROI på ljusmikroskopidatauppsättningen. När du har valt en region får du en bilduppsättning med 20 000x-50 000x förstoring i TEM. Rekonstruera bildbrickan i efterbehandlingsprogram15,16.</li>
</ol>6. Korrelation och analys
<ol><li>Ladda ljusmikroskopin och EM-datasetet i lämpligt bildbehandlingsprogram, till exempel ImageJ/Fiji17, ec-CLEM plug-in i Icy18 eller Photoshop. Beskär och rotera datauppsättningen för ljusmikroskopi så att den matchar EM-paneluppsättningen.<ol><li>Utför korrelationen baserad på DAPI-signalen i fluorescens och nukleära konturer i EM (Figur 1I). Flytta bilderna för att lägga över dem exakt och utför den manuella korrelationen korrekt. För att göra tillvägagångssättet mer exakt, använd landmärkesbaserad korrelation genom till exempel ec-CLEM-plugin-programmet i Icy eller BigWarp-plugin-programmet i ImageJ, för att korrelera bilderna genom manuellt val av motsvarande punkter. Ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för korrelation med ec-CLEM finns tillgängligt19. OBS: Detta tillvägagångssätt fungerar också bra med användning av bimodala fiduciella sonder20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysera de korrelerade bilderna genom att välja ROI baserat på fluorescerande signal i ett lämpligt program (t.ex. ImageJ). För kvantitativ analys skapar du en samling ROI:er för alla märkta organeller. Inspektera sedan motsvarande ultrastruktur för de enskilda ROI:erna och klassificera dem baserat på morfologiska element.</li>
</ol>

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Metoden som presenteras här drar nytta av de senaste framstegen inom kryosektionsbaserad CLEM - den höga känsligheten hos IF-märkning och noggrann (<100 nm fel) korrelation mellan FM och EM14,24. Detta resulterar i en metod med känslighet för fluorescerande märkning av knappa, endogena proteiner och förmågan att med hög precision överlagra detta till EM-ultrastrukturen. Således undviker denna metod behovet av (över)uttryck av exogent märkta proteiner och användningen av mindre känsliga EM-etiketter. Metodens genomförbarhet visas av exempel på CLEM på endogent LC3 i svältande celler, utan användning av lysosomala hämmare.
Upptinade kryosektioner erhållna med Tokuyasu-metoden är idealiska prover för immun-EM, eftersom de till skillnad från hartssnitt är permeabla för antikroppar. I kombination med mild fixering och kontrasterande procedurer ger detta i allmänhet utmärkt märkningseffektivitet jämfört med andra metoder utan att kompromissa med den detaljerade ultrastrukturen, och visualiserar utmärkt cellulära membran 12,25,26. Dessutom är kryosektioner mycket kompatibla med fluorescensmikroskopi, vilket gör dem till värdefulla substrat för CLEM. Både klassisk immunogold-märkning och CLEM på kryosektioner har gett viktiga insikter för att förstå subcellulär organisation 14,27,28,29,30.
För närvarande blir tillämpningar av CLEM på tinade kryosektioner allt vanligare, som ett resultat av kontinuerlig utveckling och optimeringar 14,20,24,31,32,33,34 som har förbättrat kvaliteten, tillämpligheten och noggrannheten i tillvägagångssättet. Nu, genom noggrann korrelation av stora IF- och EM-bildpaneler, underlättar tekniken screening för ultrastrukturen hos fluorescerande märkta endogena cellulära komponenter 14,32,33. Detta är en fördel jämfört med klassisk immuno-EM, där sökandet efter guldmärkta strukturer vanligtvis kräver hög förstoring och därför är mer mödosamt och tidskrävande. Det är av denna anledning som lokalisering av LC3 till ultrastrukturen har stor nytta av CLEM. LC3-positiva organeller är vanliga när autofagiskt clearance blockeras (dvs. när celler behandlas med BafA1 eller pH-höjande medel), medan autofagiska organeller snabbt elimineras i oförändrade eller svältande celler, vilket resulterar i mycket låga steady-state-nivåer. Under sådana förhållanden kan det vara svårt att hitta LC3-märkta organeller med hjälp av klassisk immuno-EM, och CLEM erbjuder en klar fördel.
Tidigare har CLEM på hartssnitt tillämpats i studier med ektopiskt uttryck av LC3-GFP eller en LC3-GFP-RFP tandemsond 35,36,37,38,39. I dessa studier utfördes fluorescensavbildning före inbäddning eller direkt i akrylhartssektion40, och proverna screenades därefter med EM. Det finns flera fördelar med hartsinbäddning; Den autofagosomala ultrastrukturen är i allmänhet välbevarad, särskilt om materialet är högtrycksfryst40. Dessutom är kontrasten mellan tungmetallfärgat hartsinbäddat material i allmänhet mer uttalad än för uranylfärgade kryosektioner. Hartsinbäddade sektioner är kompatibla med volymetriska EM-metoder, såsom arraytomografi, FIB-SEM eller seriell blockyta SEM, medan kryosektioner inte är det. I metoder som utför avbildning före inbäddning är avbildning av levande celler ett alternativ41 som inte är tillgängligt i CLEM för kryosektioner. Den viktigaste fördelen med CLEM på kryosektioner jämfört med dessa alternativ är den höga IF-signalen, vilket möjliggör immunlokalisering av sällsynta proteiner utan behov av membranpermeabilisering eller överuttryck. På så sätt undviks potentiell membranextraktion, överuttryck och genetisk modifiering av försökspersonen, vilket i kombination med möjligheten att korrelera stora områden i IF och EM gör det till ett utmärkt verktyg för att studera LC3och autofagi.
Här avslöjade appliceringen av CLEM på utsvultna HEPG2-celler att LC3 huvudsakligen lokaliserades till strukturer som identifierats som autofagosomer. Dessutom hittades några svagt fluorescerande fläckar i autolysosomer. Detta står i direkt kontrast till celler som behandlats med BafA19och återspeglar den snabba nedbrytningen av autofagosomala proteiner när autofagosomen smälter samman med lysosomer. Sammantaget visade data att CLEM av tinade kryosektioner kan ge insikter om LC3-medierad autofagi under naturliga förhållanden. Data belyser också teknikens känslighet, eftersom LC3 detekterades även i autolysosomer som endast innehåller låga nivåer av intakta LC3-epitoper. Ytterligare tillämpning av denna teknik genom att avbilda LC3 i olika modeller och förhållanden kommer att förbättra vår förståelse av autofagi och andra LC3-medierade biologiska processer, såsom LC3-associerad fagocytos eller konjugering av ATG8 till enstaka membran.
Utöver autofagi kan on-section CLEM tillämpas på andra sällsynta händelser eller strukturer, såsom celldelning, infektion, sällsynta celltyper i vävnader, kinetokorer, primära cilier eller celltypsspecifika organeller. Effektiv screening av det ämne som IF är intresserad av kan i hög grad underlätta den ultrastrukturella studien av dessa rariteter. Vidare visades14 att tekniken kan användas för att lokalisera proteiner på ett känsligare sätt än klassisk immuno-EM. Justering av fixeringslängden kan ytterligare utöka denna känslighet, vilket möjliggör ultrastrukturell lokalisering av mycket lågfrekventa eller dåligt antigena proteiner. Slutligen underlättar CLEM-metoden ett snabbt urval av ett kvantitativt antal organeller, vilket underlättar en mer robust analys av den ultrastrukturella fördelningen av ett givet protein.
CLEM om kryosektioner kräver utrustning och expertis för kryosektion. I grupper med tillgång till dessa verktyg (t.ex. kryomikrotomer) är implementeringen av CLEM i sektion enkel och kräver endast tillgång till ett automatiserat vidvinkelmikroskop, en inställning som de flesta laboratorier har tillgång till. Dessutom finns metoden tillgänglig i EM-anläggningar över hela världen. Eftersom on-section CLEM kombinerar tillämpningen av etablerade IF- och EM-metoder är metoden lätt att anpassa och kan kombineras med exempelvis tomografi 20,33,43, seriesnittsvolym EM med ett begränsat antal sektioner 44, eller superupplösningsmikroskopi 45. Metodens mångsidighet stöder tillämpningar på ett brett spektrum av biologiska frågeställningar.

Autofagi är en nyckelprocess för eliminering och återvinning av cytoplasmatiska proteiner och organeller. Processen med makroautofagi (hädanefter kallad autofagi) involverar bildandet av dubbelmembranorganeller, autofagosomer, som gör det möjligt för celler att innesluta cytoplasmatiska molekyler och organeller för lysosomal nedbrytning. Autofagi sker på basal nivå i de flesta celler och uppregleras som svar på cellulära tillstånd, såsom svält eller cellulär stress. Autofagi sker antingen på ett substratspecifikt sätt, som riktar sig mot specifika strukturer eller proteiner för nedbrytning, eller som en icke-selektiv bulkprocess som omfattar delar av cytosolen. Vid selektiv autofagi bildas autofagosomer genom konjugering av proteiner i Atg8-familjen (mikrotubuliassocierade proteiner 1A/B ljuskedja 3A/B/C [LC3] och GABARAPs) till membran som härrör från återvinningsendosomer, Goggi och/eller endoplasmatiskt retikulum (ER)1. LC3 känner igen autofagisk last i cytosolen direkt eller via selektiva autofagiadaptrar som P62/SQSTM. Nya autofagiska membran kan sedan konjugeras till LC3, expandera och smälta samman för att bilda ett komplett dubbelmembran som omsluter lasten - kallad autofagosomen. Autofagosomen mognar och smälter så småningom samman med en endosom eller lysosom, varefter den autofagiska lasten och adaptrarna bryts ned2.
Studier av autofagosombildning, mognad och fusion använder sig ofta av ljusmikroskopiteknik. Fluorescensmikroskopi av LC3 används i allmänhet för att bedöma antalet och cellulär lokalisering av autofagosomer under olika förhållanden. Genom att koppla LC3 till pH-känslig GFP och pH-stabil RFP i en så kallad tandemprob kan det totala flödet av autofagi mätas i levande celler som en funktion av GFP-fluorescensförlust3. Dessa tillvägagångssätt är värdefulla verktyg för forskare för att förstå autofagins roll och mekanism under olika förhållanden. Ett annat ovärderligt verktyg är elektronmikroskopi (EM), som avslöjar ultrastrukturen hos autofagiska organeller i olika stadier av autofagi 4,5,6,7,8. Till dags dato är EM fortfarande den metod som valts för att identifiera de exakta stadierna av autofagosombildning genom att särskilja olika autofagiska membran efter morfologi: fagofor (dubbelmembran inte helt stängt), autofagosom (slutet dubbelmembran runt cytosolisk last) och autolysosom ([partiell] förlust av det inre autofagiska membranet). Morfologi utan molekylär information kan dock vara benägen att felidentifieras eller vara tvetydig. Immuno-EM är den mest omfattande metoden för samtidig molekylär karakterisering och morfologisk klassificering av autofagiska organeller. Till exempel möjliggör immunogold-märkning av LC3 på tinade kryosektioner ultrastrukturell lokalisering av LC3 och exakt identifiering av LC3-märkta organeller9.
En nackdel med EM är det lilla synfältet som kommer med den höga förstoring som krävs för att observera den fina ultrastrukturen hos autofagiska membran och, när det gäller immun-EM, för att lokalisera etiketten som markerar proteinet av intresse. På grund av deras knapphet och låga proteinnivåer hämmar detta i allmänhet den kvantitativa EM-analysen av autofagosomer. För att öka antalet autofagosomer svälter man ofta cellerna och behandlar dem med Bafilomycin A1 (BafA1), en hämmare av lysosomal försurning och nedbrytning. Utan BafA1-behandling är EM:s sökande efter autofagosomer tidskrävande, på grund av bristen på dessa organeller. Metoden som presenteras i detta manuskript adresserar denna fråga genom fluorescerande märkning och avbildning av endogent LC3 på tinade kryosektioner i ett fluorescensmikroskop innan vidare förberedelse för EM. De fluorescerande bilderna vägleder sedan sökandet efter LC3-märkta strukturer i EM. Efter insamlingen korreleras EM-bilderna med fluorescensbilderna för att lägga till molekylär information - närvaron av LC3 - till cellens ultrastruktur. Denna "on-section CLEM"-metod ökar avsevärt förmågan att hitta LC3-märkta strukturer, särskilt under obehandlade förhållanden, för efterföljande identifiering och klassificering med EM.
Denna metod tillämpades på svältande hepatoblastom-härledda HEPG210-celler för att hitta autofagosomer i oförändrade (dvs. ingen BafA1 användes) förhållanden. Relativt få fluorescerande puncta (mindre än en per cellprofil i en 90 nm-sektion) hittades, vilket stämmer överens med den höga omsättningen av LC311. Denna gleshet av LC3-puncta underströk värdet av CLEM; Genom att välja regioner med flera fluorescerande puncta för avbildning i EM kunde LC3-positiva organeller hittas och karakteriseras på ett mycket mer effektivt sätt än genom konventionell immuno-EM. Detta visade att majoriteten av LC3-positiva organeller var autofagosomer, definierade av deras morfologi, vilket står i kontrast till de resultat som erhållits i BafA1-behandlade celler, där autolysosomer ärvanligare. Dessa data visar att autofagi kan studeras på ultrastrukturell nivå utan att autofagiskt flöde behöver hämmas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#A21202</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A#10042</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody mouse anti-LC3</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>CTB-LC3-2-IC</td>
			<td>use 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody rabbit anti-LAMP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9091</td>
			<td>use 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-c</td>
			<td>Aurion</td>
			<td>900.099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>BSAG 5 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-free Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02447.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10184322</td>
			<td>Use at end concentration of 10 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish-skin Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar, Vinylec E</td>
			<td>SPI</td>
			<td>02492-RA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Serva</td>
			<td>23115.01</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Boom</td>
			<td>MBAK 7044.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1042010250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose, 25 centipoises</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-6385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>12142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 (PB component A)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106580-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>806373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4 (PB component B)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221228-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxalic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>110220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A conjugated gold</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>PAG 5, 10, 15 or 20 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose D(+)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27483294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI</td>
			<td>020624-AB</td>
			<td>See CAUTION note</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools and consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pick-up loop</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper, qualitative, medium-fast</td>
			<td>LLG</td>
			<td>6.242 668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finder grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>G100F1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids</td>
			<td>Cell Microscopy Core, UMC Utrecht</td>
			<td>CU 100 mesh</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder widefield microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultracryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai T12</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ec-CLEM in icy</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Paul-Gilloteaux et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMOD</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>Mastronarde et al., 2018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrastructural localization of endogenous lc3 by on-section correlative light-electron microscopy

Visualisering av autofagiska organeller på ultrastrukturell nivå med elektronmikroskopi (EM) är avgörande för att fastställa deras identitet och avslöja detaljer som är viktiga för att förstå den autofagiska processen. EM-metoder saknar dock ofta molekylär information, vilket hindrar korrelationen mellan ultrastrukturell information erhållen med EM och fluorescensmikroskopibaserad lokalisering av specifika autofagiproteiner. Dessutom försvårar sällsyntheten av autofagosomer i oförändrade cellulära förhållanden undersökning av EM, vilket kräver hög förstoring och därmed ger ett begränsat synfält.
Som svar på båda utmaningarna användes en metod för korrelativ ljuselektronmikroskopi (CLEM) baserad på fluorescerande märkning för att korrelera en vanlig autofagosomal markör, LC3, till EM-ultrastruktur. Metoden användes för att snabbt screena celler i fluorescensmikroskopi för LC3-märkning i kombination med andra relevanta markörer. Därefter identifierades de underliggande ultrastrukturella egenskaperna hos utvalda LC3-märkta fläckar av CLEM. Metoden tillämpades på svältande celler utan att tillsätta hämmare av lysosomal försurning.
Under dessa förhållanden återfanns LC3 främst på autofagosomer och sällan i autolysosomer, där LC3 bryts ned snabbt. Dessa data visar både genomförbarheten och känsligheten av detta tillvägagångssätt, vilket visar att CLEM kan användas för att ge ultrastrukturella insikter om LC3-medierad autofagi vid naturliga tillstånd - utan läkemedelsbehandlingar eller genetiska förändringar. Sammantaget utgör denna metod ett värdefullt verktyg för ultrastrukturella lokaliseringsstudier av autofagiproteiner och andra knappa antigener genom att överbrygga ljusmikroskopi till EM-data.

Ett optimerat immuno-EM-protokoll för immuno-guldmärkning av LC3 på ultratunna kryosektioner publicerades nyligen av De Maziere et al.9. I denna studie ingick svält utan BafA1, där LC3 var närvarande men relativt sällsynt och svår att hitta med EM. En sektions-CLEM-metod introducerades i en separat studie, som använder känsligheten hos fluorescensmärkning för att visualisera relativt sällsynta och lågt uttryckta endogena proteiner och korrelera detta till EM-ultrastruktur14. Här kombineras dessa två tillvägagångssätt genom användning av det optimerade LC3-märkningsprotokollet som en del av en CLEM-metod.
HEPG2-celler, leverceller med relativt höga nivåer av basal autofagi22, svalt i minimalt medium (Earles balanserade saltlösning [EBSS]) i 2 timmar före fixering i 4 % PFA. Detta följdes av provberedning med Tokuyasu-metoden för ultratunn kryosektionering (sektion 1-3; se Slot och Geuze12), som är mycket kompatibel med on-section CLEM 14,23. Upptinade kryosektioner märktes fluorescerande (protokollavsnitt 4 och figur 1) med hjälp av primär anti-LC3-antikropp9 hos möss. Dessutom användes kanin-anti-LAMP1 för att indikera endolysosomer, följt av anti-mus AlexaFluor488 och anti-kanin AlexaFluor568 sekundära antikroppar. Rutnäten klämdes in mellan en täckglas och en glasskiva och avbildades vid RT på ett vidvinkelmikroskop (100x 1,47 NA oljeobjektiv, sCMOS-kamera).
En fördel med fluorescensmärkning av tunna snitt jämfört med konventionell helcells-IF är den ökade upplösningen i Z, eftersom snittets fysiska tjocklek är 60-90 nm. Med denna förbättrade Z-upplösning avslöjar fluorescensmärkningen av LC3 och LAMP1 på tunna sektioner mycket liten samlokalisering (figur 2A). I celler som behandlas med lysosomala hämmare, såsom BafA1, sker en hög samlokalisering, eftersom lysosomalt inneslutet LC3 förblir onedbrutet9. I obehandlade celler bryts LC3 snabbt ned vid kontakt med enzymatiskt aktiva, LAMP1-positiva lysosomer, och därför är samlokalisering sällsynt vid dessa tillstånd. I allmänhet observerades mindre än en LC3-punctum per cellprofil. Detta tyder på att omsättningen av autofagosomer är snabb även under svältande förhållanden, vilket håller antalet autofagosomer lågt. Det belyser också vikten av att använda CLEM för att hitta de sällsynta LC3-märkta strukturerna, med hjälp av det stora synfältet som ljusmikroskopi ger. Dessutom möjliggör den högre känsligheten hos fluorescensmärkning jämfört med guldmärkning identifiering av fler LC3-positiva organeller än i konventionell immuno-EM, vilket ytterligare underlättar deras karakterisering.
Efter att ha fått en fullständig uppsättning av sektionsbandet, hämtades rutnäten från mikroskopet och efterfärgades för EM med hjälp av UA och loop-out-metoden (protokollsteg 4.4-4.6; Figur 1F,G). Denna "loop-out"-metod säkerställer att ett tunt lager UA:metylcellulosa stannar kvar på gallret, vilket skapar den önskade kontrasten i EM. Skiktets tjocklek beror på hastigheten och vinkeln med vilken UA:metylcellulosan torkas av på filterpapperet. Att dra slingan för snabbt kan lämna för mycket UA:metylcellulosa på gallret och göra utseendet på sektionerna i EM mörkare. Att dra för långsamt kan dra bort för mycket UA:metylcellulosa, vilket resulterar i för lite färgning och dålig morfologi, och riskerar att nätet faller ur slingan. "Oljefläcksfärgning" (figur 1G) på torra galler indikerar en lämplig tjocklek på UA:metylcellulosaskiktet.
Efter loop-out och torkning avbildades rutnäten i ett TEM vid ROI selekterad genom fluorescens. IF- och EM-dataseten korrelerades genom att överlagra DAPI-signalen till konturerna av kärnor som är synliga i EM, vilket genererade en integrerad bild som innehöll information om båda modaliteterna.
Att hitta samma område i EM som valt i IF kan vara utmanande. Det rekommenderas därför att ha en översiktsbild av IF-paneluppsättningen till hands när du söker i EM. Användare bör leta efter igenkännbara funktioner i båda modaliteterna, såsom veck eller revor i sektionerna, rutnätsstänger eller arrangemang av kärnor. Det är också viktigt att tänka på att provet kan se roterat och speglat ut i EM. "Finder grids" med specifika funktioner för att identifiera områden kan användas för att underlätta korrelationen (se materialförteckningen).
Korrelationen mellan de LC3-positiva organellerna och EM-ultrastrukturen avslöjade att de olika puncta representerade distinkta stadier av autofagi (Figur 2B). Även om bevarandet av autofagosomal ultrastruktur är utmanande i kryosektioner, observerades ofta organeller med cytoplasmatiskt innehåll och dubbla membran (Figur 2C, pilar i organeller 1-5; Kompletterande figur S1), som definierar morfologiska egenskaper hos autofagosomer. Intressant nog identifierades ganska svaga fluorescerande fläckar av EM som LC3-positiva autolysosomer (Figur 2C, organell 6; autofagiskt innehåll är markerat *), kännetecknat av tätt innehåll och intraluminala vesiklar. Detta visade att mycket små mängder LC3 är synliga i IF i ultratunna kryosektioner, och indikerade att trots den nedbrytande miljön är en del LC3 detekterbar i steady-state autolysosomer. Majoriteten av LC3-positiva puncta representerade dock autofagosomer, medan autolysosomer var mycket sällsynta. Detta till skillnad från BafA1-behandlade celler, som i första hand ackumulerar autolysosomer och inte autofagosomer9.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en CLEM-metod för att länka molekylär information erhållen genom fluorescensmikroskopi till ultrastrukturen av EM. Denna metod ökar känsligheten hos immun-EM, eftersom endast fluoroforer används för märkning och dessa i allmänhet ger mer signal än EM-sonder. Metoden är särskilt lämpad för användning av ultratunna kryosektioner, där höga nivåer av specifik fluorescens över försumbar bakgrundsfärgning kan erhållas. Genom att använda fluorescens för att screena för sällsynta strukturer eller händelser och korrelera utvalda ROI:er till EM kan EM-driftstiden och tillhörande kostnader minskas avsevärt. Metodens känslighet och genomförbarhet demonstreras av visualiseringen av LC3 i obehandlade, svältande celler, som visar att LC3 främst associeras till autofagosomer under dessa förhållanden, med mycket låga nivåer synliga i autolysosomer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över CLEM på sektionen . (A) Kryosektioner från gelatininbäddade celler samlas på ett formvarbelagt koppargaller. (B) Rutnät bearbetas sektionsvis nedåt på droppar av lämpliga lösningar. (C) Galler är märkta med primära och fluorescerande sekundära antikroppar. (D) Galler är inklämda mellan ett täckglas och glasglas i 50 % glycerol. (E) Fluorescensbilder samlas in i ett vidvinkelmikroskop. F) Galler hämtas från glasglaset och bearbetas vidare genom uranylfärgning för EM. (G) Efter torkning kan gallren avbildas med TEM. (H) TEM-bilduppsättning med hög förstoring erhålls från ett område som valts från fluorescensdata. (I) Bilder från fluorescensmikroskopi och EM är korrelerade och överlagrade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65067/65067fig02.jpg"> Figur 2: CLEM för LC3 och LAMP1 i svältande HEPG2-celler. HEPG2-celler svalt i 2 timmar i EBSS före fixering med 4 % PFA i 2 timmar. (A) IF-avbildning av LC3 (grön) och LAMP1 (röd) på sektioner avslöjar relativt få LC3-puncta och liten samlokalisering med LAMP1. (B) Länka molekylär information från IF (vänster panel) till den ultrastrukturella informationen som erhålls i EM (mittpanel) genom att överlagra de två avbildningsmodaliteterna baserade på DAPI och nukleära konturer (streckade linjer, höger panel). Ultrastrukturen för de enskilda LC3-märkta facken, som exemplifieras av ruta 1 (höger panel), visas i C. (C) Ultrastruktur av LC3-positiva avdelningar. CLEM-bilder visas till vänster och pseudofärgade (beige) EM-bilder till höger (ofärgade EM-bilder visas i kompletterande figur S1). Inre och yttre autofagosomala membran indikeras med vita respektive svarta pilspetsar. Det autofagiska innehållet i autolysosomen i exempel 6 indikeras med *. Skalstreck = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Kompletterande figur S1: Ofärgade EM-bilder av LC3-positiva organeller. (A-F) Ofärgade EM-bilder av pseudofärgade exempel 1-6 som visas i figur 2C. Organellerna valdes ut genom LC3-fluorescens, som beskrivs i figur 2. Inre och yttre autofagosomala membran indikeras med vita respektive svarta pilspetsar. Det autofagiska innehållet i autolysosomen i exempel 6 indikeras med *. Skalstreck = 200 nm. Förkortningar: AL = autolysosom; AP = autofagosom; M = mitokondri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/FS1_v2.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 1: Buffertar och lösningar som används i denna studie. Denna kompletterande fil innehåller de recept och protokoll som behövs för att göra de buffertar och lösningar som används i denna studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65067/65067_Supplemental%20file%201.%20Buffers%20and%20solutions.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy at JoVE.com

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Här presenterar vi ett protokoll för optimerad korrelativ ljuselektronmikroskopi baserad på endogen, fluorescerande märkning som ett verktyg för att undersöka lokaliseringen av sällsynta proteiner i relation till cellulär ultrastruktur. Kraften i detta tillvägagångssätt demonstreras genom ultrastrukturell lokalisering av endogent LC3 i svältande celler utan Bafilomycin-behandling.

Ultrastrukturell lokalisering av endogen LC3 med korrelativ ljuselektronmikroskopi på snitt

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Lokalisering av proteiner i samband med cellens ultrastruktur har varit ett kraftfullt forskningsverktyg i decennier. Med detta protokoll utökade vi de proteiner som är låga i överflöd eller svåra att lokalisera. Vi använder fluorescensmikroskopi för att märka proteiner på ett känsligt och screenbart sätt och kombinerar det med elektronmikroskopi för att fylla på cellens ultrastruktur.Här kommer vi att demonstrera CLEM på autofagiproteiner, men det kan egentligen tillämpas på alla biologiska frågor där cellens ultrastruktur är av intresse, särskilt vid studier av sällsynta händelser. Tineke Veenendaal, en senior forskningstekniker från vårt laboratorium, kommer att demonstrera proceduren tillsammans med mig. Till att börja med, byt ut PBS som innehåller 0.15 % glycin mot 1 % gelatin i PBS förvärmt till 37 grader Celsius.Skrapa och överför cellerna i gelatin till ett mikrocentrifugrör. Pelletera cellerna med 6 000 G i en minut i rumstemperatur i en mikrocentrifug och ta sedan bort gelatinet utan att störa pelleten. Tillsätt 12 % gelatin uppvärmt till 37 grader Celsius till pelleten och återsuspendera försiktigt genom att pipettera med pipettspetsar eller glasbetespipetter förvärmda till samma temperatur.Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter och pelletera sedan cellerna vid 6 000 G i en minut. Stelna gelatinet på is i 30 minuter. För att ta bort de gelatininbäddade cellerna från röret, skär av röränden som innehåller pelleten från resten av röret med ett rakblad.Skär sedan röränden med cellpelleten på mitten vinkelrätt mot det första snittet. Placera de två rörändhalvorna som innehåller cellpelleten i 2,3 molar sackaros och inkubera i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Detta gör att cellpelletshalvorna krymper något och lossnar från plaströret.Ta bort rörhalvorna med den gelatininbäddade cellpelleten från sackarosen och ta sedan bort cellpelletshalvorna från plaströrshalvorna med en pincett. Skär pelleten manuellt i block av lämplig storlek med ett rakblad, och använd ett stereodissektionsmikroskop för att förstora motivet under skärningen. Inkubera cellblocken över natten i 2,3 molar sackaros vid fyra grader Celsius.Placera dem på en aluminiumprovhållarstift. Lämna tillräckligt med sackaros runt kanterna på blocket så att det bildar en tunn krage mellan blocket och stiftet. Snap, frys och förvara den i flytande kväve.Trimma framsidan av blocket för att platta till ytan för att få cirka 250 nanometer tjocka sektioner. Trimma sedan blockets sidor genom att snitta 50 till 100 mikrometer in i sidan av provblockets yta med knivhörnet. Trimning av fyra sidor av provblockets yta kommer att skapa en utskjutande rektangel på cirka 250 x 375 mikrometer.Sektionera ett band från den utskjutande rektangeln och se till att sektionerna är mellan 70 och 90 nanometer tjocka och har en silverglänsande gyllene glans. För bort sektionerna från diamantknivens egg med ett hår på en pinne för att skapa ett långt band. Plocka upp bandet genom att doppa den tre millimeter stora upptagningsöglan i en en-till-en-blandning av 2,3 molar sackaros och 2 % metylcellulosa.Sätt in öglan i mikrotomens kryokammare, och när droppen börjar frysa, plocka omedelbart upp sektionerna genom att försiktigt trycka droppen mot dem. Ta bort öglan från kryokammaren. Vänta tills droppen har tinat helt och tryck droppen på ett förberett galler.Placera gallren med sektioner på cirka en milliliter PBS i en liten skål eller tallrik med flera brunnar och inkubera vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Bearbeta gallren på cirka 75 mikroliter droppar på Parafilm och börja med PBS-glycintvättar i rumstemperatur. Inkubera gallren med en blockerande buffert bestående av 0,1 % bovint serumalbumin C och 0,5 % fiskhudgelatin i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur som blockeringssteg.Späd ut primära antikroppar i blockerande buffert i PBS och inkubera gallren på cirka 10 mikroliters droppar av denna lösning i en timme vid rumstemperatur. Tvätta gallren i 0,1 % bovint serumalbumin i PBS fem gånger i rumstemperatur. Späd ut de sekundära antikropparna och DAPI i blockeringsbufferten i PBS.Inkubera sedan gallren på cirka 10 mikroliters droppar av denna lösning i 30 minuter eller längre vid rumstemperatur innan gallren tvättas i PBS fem gånger som visats tidigare. För att montera proverna för ljusmikroskopi, sänk ner gallren i 50 % glycerol i destillerat vatten två gånger i fem minuter vid rumstemperatur. Placera ett galler per täckglas mellan ett glasglas och ett täckglas i 50 % glycerol, se till att sektionerna är vända mot täckglaset.För ljusmikroskopi, ta ett glasglas med de inklämda gallren till ett vidvinkelmikroskop med ett automatiserat steg. Välj ett oljemål med hög förstoring och skapa en bildbricka med band med sektioner. Därefter, för demontering och elektronmikroskopi eller EM-kontrastering, tillsätt 10 mikroliter destillerat vatten på sidan av glasskivans glidsandwich och vänta på kapillärverkan för att fylla glaslockets sandwichgränssnitt.Ta försiktigt bort täckglaset utan att blanda nedsänkningsolja i glycerolen. Ta upp gallren med en pincett och sänk ner dem i destillerat vatten tre gånger i rumstemperatur för att tvätta bort 50 % glycerol. Torka försiktigt gallrets baksida med ett luddfritt silkespapper och placera gallerdelen med sidan nedåt på destillerade vattendroppar.För att färga sektionerna för kontrast i elektronmikroskopi, inkubera dem med uranylacetat i fem minuter vid rumstemperatur. Kyl uranylacetatmetylcellulosalösningen genom att placera dropparna på Parafilm på en metallplatta på is. Tvätta sedan gallren med denna iskalla lösning två gånger och inkubera dem i lösningen i 10 minuter.Slinga ut gallren genom att föra in en gallertorkslinga i uranylacetatmetylcellulosadroppen under varje galler och försiktigt lyfta den tills gallret dras av droppen. För att torka av överflödig lösning, rör vid öglan i cirka 60 graders vinkel på det luddfria filterpapperet och dra den långsamt längs papperet tills ingen mer lösning absorberas. Placera öglan med gallret i ett lämpligt galler och låt den torka i rumstemperatur i mer än 10 minuter.Använd översikten som erhålls med ljusmikroskopi för att lokalisera ett område av intresse för avbildning i transmissionselektronmikroskopet eller TEM, och kommentera ROI på ljusmikroskopidatasetet. När du har valt en region får du en bildruta inställd på 20 000x till 50 000x förstoring i TEM. Rekonstruera bildbrickan i efterbehandlingsprogram.Utföra korrelationen baserad på DAPI-signal och fluorescens och nukleära konturer i elektronmikroskopi. Flytta bilderna för att lägga över dem exakt och utför den manuella korrelationen korrekt. Hepatoblastom-härledda HEPG2-celler svalt i två timmar i EBSS innan fixering med 4 % paraldehyd i två timmar.IF-avbildning av LC3 och LAMP1 på sektioner avslöjar relativt få LC3-punktering och liten samlokalisering med LAMP1. Molekylär information från IF kopplades till den ultrastrukturella informationen som erhölls i elektronmikroskopi genom att överlagra de två avbildningsmodaliteterna baserade på DAPI och nukleära konturer. Korrelationen mellan LC3-positiva organeller och EM-ultrastruktur avslöjade att de olika puncta representerade distinkta stadier av autofagi.Ultrastrukturen för de enskilda LC3-märkta facken som exemplifieras av ruta ett visas här. De korrelativa ljuselektronmikroskopibilderna visas till vänster och de pseudofärgade elektronmikroskopibilderna visas till höger. Inre och yttre autofagosomala membran indikeras med vita och svarta pilspetsar.Intressant nog identifierade EM relativt svaga fluorescerande fläckar som LC3-positiva autolysosomer, som kännetecknas av tätt innehåll och intraluminala vesiklar. Detta avslöjar minimal LC3-synlighet i IF av ultratunna kryosektioner, vilket tyder på detekterbar LC3 i steady state autolysosomer trots den nedbrytande miljön. LC3-positiva puncta representerar dock främst autofagosomer med få som representerar autolysosomer.För forskare som vill göra immunogold-märkning istället för on-section CLEM, är protokollen och tipsen som beskrivs här fullt tillämpliga även för immunogold-märkning. Vi applicerade initialt CLEM på endosomala reglerande proteiner med låg abundans och visade för första gången deras endogena ultrastrukturella lokalisering.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor avbildning av biologiska strukturer med fluorescens Fotoaktivering Lokalisering Mikroskopi

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Korrelat Confocal och 3D elektronmikroskopi av en specifik sensorisk Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

Tredimensionell Super Resolution mikroskopi av F-aktinfilament av interferometriska photoactivated Lokalisering Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Plunge Frysning: ett verktyg för Ultra och immunlokalisering Studier av suspensionsceller i transmissionselektronmikroskopi

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Bedömning av autophagic Flux genom mätning av LC3-, p62- och LAMP1-co-lokalisering med användning av multispektral bildflödescytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Snabb frysning med sandwichfrysningsenhet för god strukturella bevarande av biologiska exemplar i elektronmikroskopi

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

Visualisering av subcellulär lokalisering av ett protein i hjärtat med hjälp av kvantprickmedierad immunmärkning följt av transmissionselektronmikroskopi