Name: Author Spotlight: Enhancements in Gene Expression Regulation Research
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00
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Merci à Yanyang Bai pour son aide avec l’immunoblot de la figure 5. Ces travaux ont été financés par les Instituts de recherche en santé du Canada [CRC-RS 950-232402 à AC] ; Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 à AC] ; la Scottish Rite Charitable Foundation [21103 à AC] et la Fondation Brain Canada [AWD-023132 à AC] ; Bourse d’études supérieures pour les Autochtones de l’Université de la Colombie-Britannique (6481 à MT) ; Bourse d’études supérieures de la Colombie-Britannique (6768 à MT) ; Bourse d’études de la Plateforme canadienne ouverte de neurosciences (10901 à JK) ; Bourse de doctorat de quatre ans de l’Université de la Colombie-Britannique (6569 à JK). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Mouse Brain Histone Modification Quantification Using Flow Cytometry

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	<li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans.">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Modifications+and+Their+Function.">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies.">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li><li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice.">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).</li><li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation.">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li><li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications,+Long-Term+Potentiation,+and+Long-Term+Memory.">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li><li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development,+Homeostasis,+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner.">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li><li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation.">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).</li><li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Microglia.">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li><li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Work+hard,+play+hard:+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior.">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis:+An+Integrated+Protocol.">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li><li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence.">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients.">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li><li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer's+disease.">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation.">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li><li>P&#246;sel, C., M&#246;ller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain.">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).</li><li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications:+A+MODEL-AD+Study.">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Microglia.">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry.">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li><li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain.">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li><li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry.">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li><li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+in+the+brain:+measuring+global+histone+modifications.">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li><li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies.">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté permet une évaluation quantitative des niveaux globaux de HPTM par cytométrie en flux. Bien que ce protocole présente une nouvelle méthode, des études antérieures ont effectué une évaluation quantitative des protéines en utilisant une approche similaire26. Les méthodes précédemment utilisées pour évaluer les niveaux globaux de HPTM comprennent l’immunohistochimie et le western blot 16,17,19,20. La méthode basée sur la cytométrie en flux présentée est une méthode facilement quantifiable, tandis que le western blot et l’immunohistochimie sont semi-quantitatifs et ont un débit plus faible. Le Western blot repose sur la lyse cellulaire et nécessite donc à la fois une normalisation de la protéine et une protéine de contrôle de la charge qui est supposée être inchangée par la condition expérimentale27. L’immunohistochimie est semi-quantitative et à très faible débit car il est difficile d’évaluer quantitativement la quantité de protéines sans examiner au niveau d’une seule cellule16. De même, pour la microglie isolée, il y a un avantage à utiliser la méthode de cytométrie en flux en raison du rendement limité, car le transfert Western nécessite un apport protéique beaucoup plus important19. Les exigences en matière de faible nombre de cellules permettent d’exécuter plusieurs panneaux de coloration à partir du même animal.
Cependant, comme pour toute autre méthode, cette technique présente des limites, notamment le coût et la disponibilité des anticorps, car tous les anticorps ne fonctionnent pas bien dans un contexte de cytométrie en flux. De plus, par rapport à l’immunoblot, la concentration d’anticorps requise est beaucoup plus élevée. Bien que le multiplexage permette d’utiliser plusieurs anticorps sur le même panel de cellules, les cellules ne peuvent pas être débarrassées de l’anticorps après analyse, limitant ainsi l’utilisation des cellules à une par espèce d’anticorps. Ceci est différent de l’immunoblot dans lequel le même blot peut être utilisé à plusieurs reprises. Cependant, en fonction de la disponibilité des anticorps et du nombre de canaux de détection sur un cytomètre, il serait possible d’examiner jusqu’à une douzaine de marques simultanément.
La méthode actuelle ne saisit que les niveaux globaux d’expression des protéines et non l’emplacement génomique spécifique, et les changements dans les niveaux globaux peuvent ne pas refléter les changements au niveau des loci génomiques individuels. De même, l’absence de changement dans les niveaux globaux peut ne pas signifier qu’il n’y a pas de changements génomiques, mais simplement que la somme des changements globaux ne correspond à aucune différence entre les traitements. En tant que telle, cette technique est destinée à être utilisée comme un crible pour identifier les HPTM d’intérêt pour l’analyse génomique. De plus, cette méthode ne permet pas de comparer différentes marques de protéines, sauf lorsqu’elles sont évaluées comme un changement de pli pour le contrôle. Par conséquent, cela est limité par rapport à une méthode standard basée sur des courbes telle que ELISA pour la détermination des protéines.
Le protocole présenté propose une stratégie d’isolement de la microglie cérébrale vivante. Ce protocole s’appuie sur l’expression de la protéine P2RY12 pour l’isolement de la microglie. Cependant, P2RY12 est un marqueur homéostatique de la microglie et peut être régulé à la baisse dans des modèles de maladie, tels que 5XFAD22. Par conséquent, lors de l’utilisation d’un animal modèle de maladie, assurez-vous de choisir d’autres protéines marqueurs telles que TMEM119, CD11b ou CD45 pour aider à isoler la microglie23. De même, nous présentons ce protocole comme un isolement de l’hippocampe et/ou du cortex. Ce protocole permettrait d’isoler la microglie d’autres régions du cerveau, y compris les régions de la substance blanche, mais plusieurs animaux peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de microglie en fonction de la taille des régions d’intérêt.
Le protocole présenté permet d’isoler de manière robuste des microglies cérébrales vivantes, mais il existe plusieurs étapes, décrites ci-dessous, dans la phase d’isolement qui peuvent diminuer le rendement cellulaire si elles ne sont pas effectuées correctement.
Les perfusions pour ce protocole se traduisent par un pourcentage plus élevé de microglie dans le fragment enrichi par le système immunitaire, ce qui réduira le temps passé au trieur. Cependant, la perfusion n’est pas requise et d’autres méthodes d’euthanasie peuvent être utilisées si nécessaire.
Lors de l’isolement de la microglie, la myéline doit être complètement éliminée. Les cytomètres en flux reposent sur la capacité des cellules à se déplacer à travers des tubes étroits à un rythme rapide. En raison de sa viscosité et de sa tendance à s’agglutiner, la myéline cause des problèmes avec les cytomètres, provoquant souvent des obstructions qui peuvent à la fois endommager l’équipement et détruire l’échantillon, réduisant considérablement le rendement. Veillez à retirer toute la myéline lors de la collecte de fragments enrichis par le système immunitaire pour éviter d’avoir des problèmes en aval.
Coloration sur plaque ou coloration sur tube : Dans ce protocole, nous avons décrit deux options pour colorer les cellules dans des tubes de 1,5 ml ou une plaque à 96 puits. Le cas d’utilisation de chacun dépend de l’expérience ; Cependant, en général, la coloration en tube présente un risque plus faible d’impact sur le rendement que la coloration sur plaque, car la coloration risque de perdre des cellules si elle n’est pas effectuée correctement. La coloration des plaques est beaucoup plus rapide car l’aspiration du surnageant pour chaque tube prend du temps. Avant la fixation (pour le tri, etc.), utilisez la coloration des tubes pour maximiser le rendement et réduire le risque de perte. Cependant, pour l’analyse HPTM, une fois que les cellules sont fixées pour la coloration intranucléaire, la pastille est plus stable et le risque de perte est réduit avec le scintillement.
Etablir le gradient de densité discontinu : Lors de l’établissement de la stratification, il est essentiel de mettre en place correctement les couches pour obtenir la fraction enrichie en système immunitaire. Si les couches sont perturbées ou mélangées et apparaissent troubles, les cellules ne seront pas triées à l’emplacement souhaité et il sera difficile d’obtenir la fraction cellulaire immuno-enrichie. Si cela se produit, essorez avec le milieu de densité pour éliminer la myéline, puis collectez toutes les fractions restantes, diluez avec 3 mL de tampon FACS à 1 mL de milieu de densité et mélangez bien (cela nécessitera plusieurs tubes). Tourner à 500 x g pendant 10 min avec le frein sur 0. Jeter le surnageant en ne laissant que ~300 μL de solution. Prélevez l’ensemble de l’échantillon et de la tache. Cela donnera des pourcentages de tri réduits et un temps passé plus longtemps au cytomètre, mais le rendement peut toujours être comparable.
Lors de l’utilisation de la méthode d’isolement, il est avantageux de pouvoir collecter des cellules pour l’ARN et l’évaluation HPTM du même cerveau de souris. Dans cette situation, après avoir trié la microglie vivante, les cellules peuvent être divisées pour allouer une partie à l’évaluation de l’ARN (le nombre minimum de cellules d’entrée pour obtenir un rendement en ARN décent est de 75 000 cellules) et une partie pour une analyse plus approfondie de la cytométrie en flux (minimum 10 000 cellules par puits pour une bonne détermination de l’IMF). Dans ce cas, un tri par cytomètre en flux est nécessaire. Cependant, lorsque l’on prévoit uniquement d’utiliser les cellules pour l’analyse HPTM, le tri n’est pas nécessaire et la fraction immunitaire peut être colorée avec l’anticorps P2RY12 et l’anticorps HPTM. Le déclenchement du cytomètre peut alors être réglé pour la microglie P2RY12+, comme cela serait fait pour le tri en flux, afin d’analyser uniquement le signal HPTM dans la microglie. L’élimination du tri permet au protocole d’être plus rapide et plus rentable. De plus, si l’on évalue les HPTM à partir de cellules en culture, il suffit de commencer par le protocole de coloration et aucun anticorps marqueur cellulaire n’est nécessaire, comme le montre la figure 6. Le protocole d’évaluation HPTM peut être utilisé pour de nombreux types de cellules, y compris les cellules en culture, les cellules primaires et les cellules dérivées de l’IPSC.
Enfin, si nous n’avons présenté que deux utilisations potentielles de la microglie en aval de l’isolement, il en existe de nombreuses autres dont des techniques épigénétiques telles que ChIP, CUT&Tag et CUT&RUN. Dans le cas des techniques épigénétiques génomiques, où la caractérisation des changements à des loci spécifiques est intéressante, choisir des inhibiteurs spécifiques pour les auteurs et les effaceurs de marques de chromatine11 adaptés aux expériences afin de s’assurer que les modifications épigénétiques microgliales profilées ne sont pas des artefacts techniques provenant de n’importe quelle étape de la procédure d’isolement telle que la digestion enzymatique. Lors de l’évaluation des changements dans les niveaux globaux de marques épigénétiques, par exemple en utilisant la cytométrie en flux quantitative, les changements induits par la procédure ne sont pas censés être si importants qu’ils soient détectés au niveau mondial.
Dans l’ensemble, les méthodes discutées fournissent une nouvelle méthode unicellulaire pour quantifier les niveaux globaux de modifications des histones et d’autres changements épigénétiques par cytométrie en flux. Nous avons démontré que cette méthode est suffisamment sensible pour détecter des changements globaux dans le marqueur enhancer H3K27ac dans la microglie en réponse au LPS in vivo. Ceci est cohérent avec le séquençage ChIP précédent de H3K27ac après stimulation LPS montrant un remodelage spectaculaire des amplificateurs sensibles à LPS28. Les applications de cette méthode permettront d’examiner les changements épigénétiques globaux dans différents types de cellules cérébrales au cours du développement et de la maladie.

L’épigénétique est l’étude des mécanismes qui régulent l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN sous-jacente. La régulation épigénétique de l’expression des gènes est dynamique au sein des cellules et peut permettre des réponses rapides et coordonnées à divers stimuli environnementaux. La régulation dynamique se produit en partie en raison de changements dans la structure de la chromatine au niveau du nucléosome, qui est composé de protéines histones (H2A, H2B, H3, H4) assemblées dans un noyau octamère étroitement enroulé par l’ADN1. Les interactions entre les protéines histones et l’ADN peuvent contrôler l’accessibilité de l’ADN à la machinerie de transcription, qui peut finalement contrôler l’expression des gènes et d’autres aspects de la biologie de la chromatine2. Les protéines histones ont des queues non structurées qui comportent des résidus chargés positivement qui forment des interactions électrostatiques avec le squelette de l’ADN chargé négativement. Ces interactions entraînent un compactage serré de l’ADN et une réduction de l’accessibilité de l’ADN. Des modifications covalentes des queues d’histones, appelées modifications post-traductionnelles des histones (HPTM), peuvent réguler ces interactions 3,4. Parmi les HPTM les mieux caractérisés, citons l’acétylation et la méthylation de la queue des histones, qui peuvent modifier l’affinité des interactions électrostatiques entre les queues d’histones et l’ADN, ce qui entraîne une accessibilité différentielle à l’ADN sous-jacent et le recrutement de facteurs de transcription qui reconnaissent ces HPTM sur des sites spécifiques. Les HPTM sont régulés par trois classes importantes d’enzymes appelées lecteurs, qui reconnaissent, écrivains, qui déposent, et effaceurs, qui éliminent les HPTM. Ainsi, le recrutement ou la dissolution d’enzymes lectrices, d’écriture ou d’effaceuses peut finalement changer le paysage des HPTM et régir la structure et la fonction de la chromatine, rendant leur régulation et leur lecture essentielles à la compréhension de la biologie cellulaire et de la fonction 3,4.
Les cellules du système nerveux central (SNC) sont épigénétiquement flexibles car elles modifient leur transcriptome pour s’adapter aux stimuli environnementaux. L’accumulation de preuves suggère que les changements dans l’épigénome, tels que la méthylation de l’ADN, les ARN non codants et les HPTM, jouent un rôle essentiel dans la formation de la mémoire et la fonction synaptique5. Perturber la dynamique HPTM par la manipulation des lecteurs, des écrivains ou des effaceurs pertinents peut bloquer ou améliorer l’apprentissage associatif et la potentialisation à long terme 6,7,8. Les microglies, les cellules immunitaires résidentes du SNC, régulent rapidement leur transcriptome en réponse à une stimulation immunitaire par des changements dynamiques dans leur épigénome 9,10,11. Ce haut niveau d’adaptation à leur environnement cérébral local les rend difficiles à examiner dans un contexte isolé, car des études ont montré que l’épigénome et le transcriptome de la microglie sont altérés après seulement quelques heures dans des milieux de culture après avoir été retirés de l’environnement cérébral11. De plus, comme les microglies ne représentent que 10 % des cellules du cerveau, les mesures examinant les changements au niveau de l’ensemble des tissus manquent de sensibilité et de spécificité12,13. Par conséquent, les microglies doivent être rapidement isolées pour examiner les changements épigénétiques tels que les niveaux de HPTM, ex vivo.
Les méthodes couramment utilisées pour examiner les HPTM comprennent le séquençage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) et le séquençage par clivage sous cibles et par marquage (CUT&Tag-seq)4. Bien que ces techniques soient très spécifiques à un HPTM individuel et puissent informer sur la présence de HPTM dans un contexte génomique spécifique, elles ne peuvent examiner qu’un seul des nombreux HPTM possibles dans une seule expérience11,14 Par conséquent, avant de procéder à de telles expériences, qui nécessitent un investissement important en temps et en argent, il est très utile de réduire la liste des HPTM potentiellement intéressants pour une étude plus approfondie en examinant d’abord les changements dans les niveaux de HPTM. Les deux principales approches pour examiner les niveaux globaux de HPTM sont l’immunohistochimie et l’analyse par transfert Western, mais les deux approches ne sont que semi-quantitatives, à faible débit et nécessitent un grand nombre de coupes de tissus ou de cellules isolées15,16. Ainsi, nous avons cherché à développer une méthode quantitative très sensible qui pourrait être utilisée pour examiner les niveaux globaux de HPTM rapidement et au niveau de la cellule unique.
Le protocole présenté permet de détecter rapidement les niveaux globaux de HPTM par cytométrie en flux intranucléaire. Des études antérieures sur les cellules cancéreuses ont justifié l’importance d’examiner les niveaux globaux d’un point de vue clinique17,18. Il est également courant que les études utilisent les niveaux globaux comme méthode de dépistage avant d’évaluer la localisation génomique de HPTM spécifiques d’intérêt19,20. Dans le cas de la microglie, il est difficile d’évaluer les niveaux globaux après l’isolement en raison du faible rendement cellulaire. Pan et al. présentent les niveaux globaux de HPTM à partir de microglies isolées, dans lesquelles la microglie de trois animaux a été mise en commun pour permettre la détection des niveaux de protéines par Western blot19. Grâce à notre protocole, nous sommes en mesure de détecter des changements globaux avec des entrées cellulaires beaucoup plus faibles, ce qui permet de dépister plusieurs marques par animal et d’éliminer le besoin de regrouper les échantillons.
Nous décrivons ici un protocole permettant de détecter rapidement les niveaux de HPTM par cytométrie en flux intranucléaire quantitative dans des microglies isolées. Bien que nous nous concentrions spécifiquement sur la quantification HPTM par souci de concision, ce protocole peut être utilisé de la même manière pour quantifier les niveaux globaux d’enzymes de lecture, d’écriture et d’effacement. Le protocole est livré en deux parties : premièrement, la méthode d’isolement de la microglie et, deuxièmement, la méthode basée sur la cytométrie en flux pour déterminer les niveaux de HPTM. La méthode d’isolement permet d’obtenir des cellules qui peuvent être utilisées à la fois pour l’isolement de l’ARN et l’évaluation du niveau HPTM, ce qui permet d’évaluer l’expression génique et les niveaux HPTM à partir du même échantillon. De plus, la méthode d’évaluation HPTM peut être utilisée sur d’autres types de cellules, comme indiqué dans le protocole.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Not Treated Plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>9649S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl Histone H4 K8 (2594)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>2594S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>8173S</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA523516</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>15021S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anisomycin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>2222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (tri methyl K4)&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab213224</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM Biolabs</td>
			<td>PTM-1411RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb</td>
			<td>PRM Biolabs</td>
			<td>PTM-1401RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>848006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>5217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyto-Last Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylsulfoxide, sterile</td>
			<td>Cell Signalling Technology</td>
			<td>12611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Mouse AlexaFluor488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-546-150</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AS035</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>406410</td>
			<td>Dilution: 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB12566502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K18ac Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>720095</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6002</td>
			<td>Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td>
			<td>PTM BIolabs</td>
			<td>PTM-1406RM</td>
			<td>Dilution: 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysacharide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads Compensation Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LK003178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RC57004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAshredder</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptolide</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>97539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>True Nuclear Transcription Factor Buffer Set</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>156604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of global histone post translational modifications using intranuclear flow cytometry in isolated mouse brain microglia

Le contrôle de l’expression génique se produit en partie par des modifications de la structure de la chromatine, y compris l’ajout et la suppression de modifications post-traductionnelles des queues d’histones. Les modifications post-traductionnelles des histones (HPTM) peuvent soit faciliter l’expression des gènes, soit leur répression. Par exemple, l’acétylation des résidus de lysine de la queue d’histones neutralise la charge positive et réduit les interactions entre la queue et l’ADN chargé négativement. La diminution des interactions entre les histones et l’ADN de la queue se traduit par une accessibilité accrue de l’ADN sous-jacent, ce qui permet un accès accru aux facteurs de transcription. La marque d’acétylation sert également de site de reconnaissance pour les activateurs transcriptionnels contenant des bromodomaines, ce qui entraîne une amélioration de l’expression des gènes. Les marques d’histones peuvent être régulées dynamiquement au cours de la différenciation cellulaire et en réponse à différents environnements et stimuli cellulaires. Bien que les approches de séquençage de nouvelle génération aient commencé à caractériser les emplacements génomiques des modifications individuelles des histones, une seule modification peut être examinée simultanément. Étant donné qu’il existe des centaines de HPTM différents, nous avons développé une mesure quantitative à haut débit des HPTM globaux qui peut être utilisée pour cribler les modifications des histones avant de mener des approches de séquençage du génome plus étendues. Ce protocole décrit une méthode basée sur la cytométrie en flux pour détecter les HPTM globaux et peut être réalisé à l’aide de cellules en culture ou de cellules isolées de tissus in vivo . Nous présentons des exemples de données provenant de microglies cérébrales de souris isolées pour démontrer la sensibilité du test pour détecter les changements globaux dans les HPTM en réponse à un stimulus immunitaire dérivé de bactéries (lipopolysaccharide). Ce protocole permet l’évaluation rapide et quantitative des HPTM et peut être appliqué à n’importe quel régulateur transcriptionnel ou épigénétique pouvant être détecté par un anticorps.

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Des souris adultes ont été perfusées par voie transcardique et sacrifiées pour l’isolement de la microglie. Les microglies ont été isolées sur de la glace et colorées avec des anticorps vivants P2RY12-APC et violet 525 vivants. Les cellules qui ont été déterminées positives pour P2RY12 et négatives pour la coloration vivante vivante 525 ont été triées comme microglies vivantes. Le rendement moyen de la microglie à partir d’un cerveau de souris disséqué était de 1,28 x 105 ± 0,05 (moyenne ± erreur type de la moyenne (MEB), N = 100). Il n’y a pas de différence dans le rendement de la microglie entre les souris femelles (1,25 x 105 ± 0,09 [moyenne ± MEB, N = 46]) et les souris mâles (1,32 x 105 ± 0,07 [moyenne ± MEB, N = 54]) (t(98)=0,6365, p=0,526). Lors de l’isolement de régions cérébrales spécifiques, le rendement moyen de la microglie à partir du cortex de souris est de 8,3 x 104 ± 0,08 (moyenne ± MEB, N = 15) et de l’hippocampe de souris est de 4,1 x 104 ± 0,02 (moyenne ± MEB, N = 16). Comme on pouvait s’y attendre, il existe une différence significative dans le rendement de la microglie de chaque région du cerveau (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Après l’isolement de la microglie, l’ARN a été extrait des cellules isolées à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN à faible entrée. De façon constante, le score d’intégrité de l’ARN (RIN) était supérieur à 9,0 (9,62 ± 0,05) et le rendement moyen en ARN par cellule était de 0,25 ± 0,01 pg (moyenne ± MEB, N = 32 ; Dossier supplémentaire S2).
Des souris adultes ont reçu une injection intrapéritonéale de 1 mg/kg de lipopolysaccharide (LPS) 24 h avant le sacrifice. Les souris ont été perfusées par voie transcardique avec HBSS, et la microglie a été isolée de l’ensemble du cerveau selon le protocole décrit (Figure 5A). Pour chaque coloration, 20 000 à 30 000 cellules ont été allouées à chaque panel d’anticorps. Les niveaux globaux d’acétylation de l’histone 3 lysine 27 (H3K27Ac) ont été évalués dans des microglies isolées par cytométrie en flux. Pour les souris mâles et femelles, le traitement LPS a induit une augmentation de H3K27Ac lorsque l’IMF est normalisée dans le sexe (t(6)=9,676, p<0,0001 ; Graphique 5B). Lors de l’examen des histogrammes des cellules colorées, les populations restent normalement distribuées avec des variations similaires ; cependant, les cellules sont passées à une fluorescence accrue, ce qui a entraîné une augmentation de l’IMF (figure 5C). Lors de l’examen de H3K9Ac dans le même traitement, il y a une augmentation similaire de H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003 ; Figure 5D,E), cependant, le changement de pli du LPS par rapport au PBS du signal H3K9Ac est inférieur au signal H3K27Ac.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> Figure 5 : Changements globaux dans l’acétylation des histones dans la microglie isolée. (A) Les souris sont injectées par voie intrapéritonéale avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou 1 mg/kg de lipopolysaccharide (LPS) 24 h avant le sacrifice. Les microglies sont prélevées à partir de la fraction immuno-enrichie et fixées pour la cytométrie en flux et l’évaluation globale des histones après modification traductionnelle. L’intensité fluorescente médiane est évaluée comme une approximation de l’expression des protéines. Créé avec BioRender.com. (B) Les niveaux globaux de H3K27Ac ont augmenté en réponse au traitement LPS. Changement de pli en PBS normalisé dans l’expérience et le sexe. Test t à deux queues non apparié, t(6)=9,676, p<0,0001. Le graphique à barres représente la moyenne ± MEB. N = 8 animaux ; 2 par condition dans 2 expériences indépendantes. (C) Exemple d’histogrammes illustrant le décalage de l’intensité fluorescente H3K27Ac. La fenêtre modale représente les histogrammes des souris injectées par PBS par rapport aux souris injectées par LPS. (D) Exemple d’histogrammes illustrant le décalage de l’intensité fluorescente H3K9Ac. La fenêtre modale représente les histogrammes des souris injectées par PBS par rapport aux souris injectées par LPS. (E) Les concentrations mondiales de H3K9Ac ont augmenté en réponse au traitement par LPS. Changement de pli en PBS normalisé dans l’expérience et le sexe. Test t à deux queues non apparié, t(6)=7,299, p=0,0003. Le graphique à barres représente la moyenne ± MEB. N = 8 animaux ; 2 par condition dans 2 expériences indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour confirmer que la méthode décrite était comparable à d’autres méthodes précédemment utilisées pour la quantification globale de la modification des histones, nous avons cherché à utiliser l’immunoblot comme outil comparatif. Cependant, le rendement de la microglie isolée est tout simplement trop faible pour permettre une évaluation raisonnable. Par conséquent, nous avons utilisé des cellules BV2 en culture pour comparer la méthode de cytométrie en flux intracellulaire à un Western blot (WB). Les cellules BV2 ont été cultivées dans des milieux complets (DMEMF12, 10 % de FBS, 1 x pénicilline/streptamycine et 1 x L-glutamine) à 37 °C, 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec 0,25 % de trypsine-EDTA et plaquées à une densité de 250 000 cellules/puits et traitées dans un milieu sérique réduit (DMEM F12, 2 % FBS, 1x pénicilline/streptamycine et 1x L-glutamine) et laissées récupérer pendant 12 h à 37 °C, 5% CO2. Les cellules ont été traitées avec 25 ng/mL de LPS pendant 24 h avant la fixation comme décrit ci-dessus ou la lyse avec un tampon de lyse WB. Le signal de H3K27Ac a été effectué par les deux méthodes, le GAPDH étant utilisé comme contrôle de charge pour WB. L’analyse de l’intensité fluorescente normalisée par rapport au témoin PBS a été déterminée pour chaque groupe (figure 6A). Lors de l’examen de la variation du signal H3K27Ac normalisé par WB, il y avait une augmentation de 1,527 fois de l’état traité au LPS par rapport au témoin H2O, ce qui a été déterminé comme significatif par le test t non apparié (t = 3,024, df = 5 ; p = 0,0293). Lors de l’examen du changement à l’aide de la cytométrie en flux, il y avait une augmentation de 1,482 fois de l’état traité au LPS, ce qui a été déterminé comme significatif (t = 7,843, df = 10 ; p < 0,0001). À l’aide d’une ANOVA à 2 facteurs pour comparer les méthodes, il a été déterminé qu’il y avait un effet significatif du traitement (F(1,15)=45,21,p<0,0001), mais pas de la méthode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ou de l’interaction (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). De plus, nous vérifions ici qu’il n’y a pas de changement dans les niveaux d’histone H3 à la fois par Western blot et par cytométrie en flux, car l’ANOVA à 2 facteurs n’a révélé aucun effet significatif du traitement LPS (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), de la méthode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ou de l’interaction (F(1,7=0,01191, p=0,9162 ; Graphique 6B). Des exemples de transferts et de décalages d’histogramme pour ces données sont également présentés (Figure 6C,D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> Figure 6 : Comparaison des méthodes de quantification de la modification globale des histones entre la cytométrie en flux et le transfert Western. (A) Les cellules BV2 sont traitées avec 25 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) ou H2O pendant 24 h avant l’analyse. L’intensité fluorescente de H3K27Ac est représentée par un changement de pli du véhicule témoin, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), à la fois pour la cytométrie en flux et le transfert Western. L’ANOVA à 2 facteurs a révélé un effet significatif du traitement LPS (F(1,15)=45,21, p<0,0001), mais pas la méthode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) ou l’interaction (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). La correction de Tukey pour les tests d’hypothèses multiples a été appliquée pour les résidus. * présente 0,0332, ** présente 0,0021. (B) L’intensité fluorescente de l’histone H3 est représentée par un changement de pli en PBS pour la cytométrie en flux et le transfert Western. L’ANOVA à 2 facteurs n’a révélé aucun effet significatif du traitement LPS (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) ou de la méthode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) ou de l’interaction (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Des exemples de transferts et (D) de décalages de cytométrie en flux sont présentés. La taille de l’histogramme est normalisée en pourcentage en fonction du nombre de cellules présentes à l’intensité fluorescente du mode. Le graphique à barres représente le MEB moyen. n = 2 expériences indépendantes, 2 par condition par expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’ensemble de ces résultats montre que cette technique peut être utilisée pour évaluer quantitativement les niveaux globaux de HPTM dans la microglie isolée. De plus, la méthode s’est avérée comparable aux techniques précédentes, mais nécessite des entrées de cellules beaucoup plus faibles. De plus, bien qu’elle ne soit pas illustrée, avec une compensation appropriée, la présente technique peut être utilisée avec plusieurs anticorps sur le même panel évaluant différents HPTM.
Fichier supplémentaire S1 : Exemples de fichiers d’analyse. Ce fichier contient un fichier d’analyse wsp et 7 fichiers fcs, y compris le no stain, le P2RY12FMO, le 568FMO, deux animaux traités au PBS et deux animaux traités au LPS colorés au H3K27Ac. Le but de ce fichier est de démontrer l’analyse et le déclenchement d’une expérience qui pourrait décrire à quoi ressemblait une expérience réussie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire S2 : Données d’isolement. Le fichier inclus contient les données pertinentes après le tri de la microglie qui contient la microglie et le rendement en ARN du protocole décrit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>POPULATION FERMÉE</td>
			<td>Fréquence des parents</td>
			<td>Fréquence des</td>
			<td>Compter</td>
		</tr><tr><td>S1 (Épisode 1)</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr><tr><td>S2>S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr><tr><td>APC+ > S2 > S1</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr><tr><td>610+ > APC+ > S2 > S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Un exemple de tableau de lignage d’échantillon illustre le pourcentage et le nombre d’événements requis pour une détection précise des protéines.

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Author Spotlight: Enhancements in Gene Expression Regulation Research

Ce travail décrit un protocole pour la quantification des modifications globales des histones par cytométrie en flux intranucléaire dans des microglies cérébrales isolées. L’ouvrage contient également le protocole d’isolement de la microglie qui a été utilisé pour la collecte de données.

Quantification des modifications post-traductionnelles des histones globales à l’aide de la cytométrie en flux intranucléaire dans la microglie cérébrale isolée de souris

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Notre recherche vise à comprendre les mécanismes de régulation fondamentaux qui contrôlent l’expression des gènes dans le cerveau, et nous nous intéressons particulièrement à la façon dont la perturbation de ces mécanismes contribue aux troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques. Nous nous concentrons sur la compréhension de la façon dont les facteurs de risque génétiques et environnementaux se combinent pour altérer la fonction cellulaire et produire des troubles du comportement. Ce protocole comprend des méthodes de criblage à haut débit des modifications des histones dans la microglie isolée, ce qui nous permet de passer au crible des dizaines de modifications épigénétiques différentes avant de nous engager dans le séquençage à haut débit et les études de suivi fonctionnel.Notre protocole fournit des mesures des modifications de l’histo globale similaires à celles de la parcelle occidentale. Cependant, notre technique est à la fois plus rapide, nécessite moins de cellules d’entrée, est plus quantitative et peut être multiplexée.