Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

يتم دعم E.E.L.L. بمنحة من مؤسسة العلوم الوطنية PRFB 2011010. نود أن نشكر Tsuyoshi Momose و Evelyn Houliston لمساعدتنا في إنشاء مستعمرات Clytia الخاصة بنا ، وجان بابتيست رينييه لجمع صور التئام الجروح الدقيقة ، وهاري كيريازيس لبناء خزانات الكريزل الزائفة ، وإليزابيث بالدو للحفاظ على موطن Clytia. تم إنشاء الشكل 1B باستخدام BioRender.com.

لا شيء للكشف عنه.

هنا ، يتم تقديم المنهجية لتصوير الجروح في الجسم الحي في Clytia ، وهو كائن نموذجي لافقاري جديد نسبيا40،43،58. هناك العديد من العوامل التي تجعل هذا النظام أداة بحث فريدة وقوية ، متميزة عن النماذج الأخرى المستخدمة لدراسة التئام الجروح وإعادة الظهارة. أولا ، يتم توصيل ظهارة أحادية الطبقة ب ECM شفاف ، وبالتالي تشبه مقايسات زراعة الأنسجة في المختبر (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4). كما هو الحال في المقايسات المختبرية ، يمكن تصوير الخلايا بدقة عالية. ومع ذلك ، على عكس زراعة الأنسجة ، هناك بيئة خلوية أصيلة و ECM ، بحيث يمكن رؤية التئام الجروح في سياق أحداث الإشارات المعقدة التي تحدث في حي مصاب. ثانيا ، تفتقر Clytia إلى الاستجابات الالتهابية ، والخلايا الليفية المهاجرة ، والأوعية الدموية ، والدم. وهذا يسمح بدراسة عملية إعادة الظهارة في الجسم الحي في غياب الأحداث المتداخلة التي تحدث في الحيوانات البالغة الأكثر تعقيدا أثناء التئام الجروح59. ثالثا ، ECM غير خلوي (الفيلم التكميلي 1) وكبير ، مما يتيح سهولة الوصول إليه باستخدام إبرة الحقن المجهري (الشكل 5 والشكل 6). باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين اختبار تأثير الكواشف الدوائية التي تزعج بنية ECM أو الإشارات على التئام الجروح في الجسم الحي. يمكن أيضا إدخال الكواشف في الخلايا الظهارية ، ويمكن تقييم آثارها على التئام الجروح في الجسم الحي. رابعا ، هناك بروتوكولات موجودة لإنشاء المسوخ والحيوانات المعدلة وراثيا في نظام Clytia42،43،44،45. لذلك يمكن ملاحظة التئام الجروح في الجسم الحي في الحيوانات ذات التعبير المتزايد / المنخفض للجينات ذات الأهمية.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه التقنية. أولا ، كما هو موضح في الشكل 3 ، من الضروري استخدام مجهر تم تكوينه بشكل صحيح للفحص المجهري DIC لأن الخلايا الظهارية المسطحة والشفافة غير مرئية تقريبا باستخدام المجهر الضوئي القياسي. من المهم أيضا تطوير مهارة جرح الحيوانات بلطف حتى تتلف الظهارة دون التلاعب بوحدة التحكم في المحتوى. لمسة لطيفة مماثلة ضرورية لحقن المواد الدقيقة في ECM ، لأن الأضرار الجسيمة التي لحقت بالحيوان أثناء الحقن قد تعرض للخطر التحليل اللاحق لالتئام الجروح. في حين أن هناك منحنى تعليمي لهذه التقنيات ، حتى الطلاب المبتدئين قد أتقنوها بسرعة في مختبر Malamy. في الواقع ، تم استخدام هذه البروتوكولات لإثبات هجرة الخلايا في الدورات المعملية الجامعية في جامعة شيكاغو.
للحصول على التصوير الأمثل ، من المهم ألا يتحرك الحيوان ولا تنجرف منطقة الجرح المختارة خارج مجال الرؤية. إذا كانت الحيوانات تنبض ، فإن العلاج باستخدام Tricaine كما هو موضح فعال للغاية. للانجراف ، غالبا ما يكون من الضروري إعادة وضع العينة يدويا. يمكن حذف هذه الحركات من الفيلم النهائي باستخدام وظيفة التسجيل في FIJI / ImageJ.
يتمثل أحد قيود هذا النظام في أنه لا يمكن إنشاء جروح متطابقة ، حيث تختلف الجروح في الشكل والحجم باستخدام الطرق الموضحة هنا. لذلك ، قد يكون من الصعب تحديد المعدل الدقيق لإغلاق الجرح أو هجرة الخلايا. تلتصق العلامات الموضعية مثل حبيبات الكربون ب ECM المكشوف في جريح ويمكن استخدامها لقياس معدل هجرة الخلايا الجماعية في الجروح الكبيرة (غير معروض). بالنسبة لتحليل إغلاق الجرح الصغير ، حتى مع اختلاف حجم الجرح وشكله ، هناك نطاق محدود من معدلات الإغلاق بين الجروح بهذا الحجم (الشكل 4). لذلك من الممكن الكشف الكمي عن آثار الكواشف الدوائية التعزيزية أو القمعية.
بينما يصف هذا العمل توصيف التئام الجروح باستخدام الفحص المجهري DIC فقط ، يمكن استخدام نفس الأساليب لتصوير الشفاء باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو المجهري متحد البؤر. للمساعدة في ذلك ، توجد بروتوكولات لتوليد محورة وراثيا يتم فيها تمييز البروتينات الخلوية وخارج الخلية المختلفة بالفلورسنت. سيكون التصوير المتزامن مع مدينة دبي للإنترنت والتألق ، جنبا إلى جنب مع اضطراب التئام الجروح باستخدام العوامل الدوائية أو الخطوط الطافرة ، نهجا قويا لفهم الآليات التي تكمن وراء عملية التئام الجروح في الظهارة.

تغطي صفائح الخلايا الظهارية السطح الخارجي لجميع metazoans ، وتبطن الأعضاء الداخلية ، وتقسم جسم الحيوان إلى مقصورات منفصلة. تفصل الظهارة أيضا الجسم الداخلي عن البيئة الخارجية وتحميه من التلف والعدوى. ومن ثم ، كان ظهور الطبقات الظهارية جزءا أساسيا من تطور الحيوانات متعددة الخلايا ، وتظهر الطبقات الظهارية في جميع الحيوانات من الفقاريات إلى معظم metazoansالقاعدية 1. ظهارة بعض الأعضاء هي طبقة واحدة أحادية ، كما هو الحال في الأكياس الهوائية الرئوية والأوعية الدموية والأمعاء2 ، وكذلك في بشرة اللافقاريات مثل planaria و cnidarians3. في الأنسجة الأخرى ، مثل الجلد4 والقرنية5 من الفقاريات ، تكون الظهارة طبقية ، مما يعني وجود طبقات متعددة من الخلايا الظهارية2. في جميع الحالات ، يتم لصق الطبقة الظهارية القاعدية على الغشاء القاعدي ، وهي ورقة بروتينية تشكل منطقة متخصصة من المصفوفة خارج الخلية (ECM)6،7،8.
يجب إصلاح الخروقات في الظهارة بسرعة لإعادة إنشاء ورقة ظهارية مستمرة. يحدث تلف الظهارة أثناء العمليات الطبيعية ، مثل تساقط الخلايا الظهارية في الأمعاء ،9،10 ونتيجة للالتهاب أو الصدمة الجسدية. عند تلف خلية ظهارية واحدة ، يجب إما إصلاح نفسها أو التخلص منها للسماح للخلايا المحيطة بالالتصاق ببعضها البعض وإغلاق الثقب11,12. في الجروح الأكبر من حجم خلية واحدة ، يجب أن تتحرك الخلايا الظهارية للوصول إلى بعضها البعض وإصلاح الورقة13. يمكن تحقيق ذلك عن طريق انتشار الخلايا إذا كانت الفجوات صغيرة أو قد تتطلب هجرة الخلايا الظهارية من هوامش الجرح لسد فجوة الجرح. وتسمى هذه العملية الأخيرة إعادة الظهارة14,15. في الأنسجة الجنينية ، تنتشر الخلايا الظهارية وتهاجر لإغلاق الجروح أو يتم سحبها عبر الفجوة عن طريق تقلص كابلات الأكتوميوسين التي تتشكل بين الخلايا عند هامش الجرح ، في آلية تشبه سلسلة المحفظة16. في العديد من الأنسجة البالغة ، تتضمن إعادة الظهارة هجرة صفائح الخلايا المتماسكة ، حيث تحافظ الخلايا على تقاطعاتها مع الخلايا المجاورة14،17،18. في الأنسجة الأخرى ، يتم تفكيك الخلية: اتصالات الخلايا وتتصرف الخلايا الظهارية مثل خلايا اللحمة المتوسطة ، وتتحرك بطريقة منسقة ولكن مستقلة في منطقة الجرح أثناء إعادة الظهارة14،19،20،21.
يتم تنظيم حركات الخلايا الظهارية من خلال التفاعلات المعقدة بين الخلايا المهاجرة وبين الخلايا و ECM. في حين أن هناك كمية هائلة من الأدبيات التجريبية التي تتناول آليات تنشيط الجروح للخلايا الظهارية والهجرة اللاحقة ، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين اكتشافه. على سبيل المثال ، لم يتم تحديد الإشارة الأولية التي تنشط الخلايا الظهارية للهجرة استجابة للجرح بشكل قاطع 22 ، كما أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم إعادة نشر الأكتين لإنشاء صفائح الصفيحة على جانب الخلايا الظهارية الأقرب إلى الجرح 22،23،24،25،26،27. تتطلب هجرة الخلايا الجماعية مشاركة المعلومات من الخلايا الموجودة في الجرح مع الخلايا البعيدة عن الجرح ، ولا يزال مسار الاتصال غير واضح28. خلية:تقاطعات الخلايا والخلية: يجب تفكيك مرفقات ECM وإصلاحها حيث تعيد الخلايا الموجودة في الورقة ترتيب نفسها ، لكن تنظيم هذه العملية غير مفهومبشكل جيد 14,29. إن إحراز تقدم في هذه الأسئلة وغيرها من الأسئلة ذات الصلة ليس مهما فقط كمشكلة بيولوجية أساسية ولكن أيضا بسبب الأهمية السريرية للشفاء الصحيح للجروح. الأمراض التي تضر بقدرة الخلايا الظهارية على الهجرة بشكل صحيح تؤدي إلى جروح مزمنة. مثال على ذلك هو المرض الوراثي انحلال البشرة الفقاعي ، حيث يتم تحور الجينات المشاركة في ارتباط الخلايا الظهارية ب ECM ، مما يؤدي إلى جلد هش يتقشر ويتقرح. كما تتعرض إعادة الظهارة للخطر في أنسجة الشيخوخة الطبيعية30,31. لذلك فإن الفهم الأفضل ضروري لتطوير التدخلات لتحسين نتائج التئام الجروح.
تمت دراسة هجرة الخلايا الظهارية في التئام الجروح باستخدام كل من النهج في المختبر والكائنات الحية النموذجية. أجريت غالبية الدراسات حول التئام الجروح وآليات هجرة الخلايا في زراعة الأنسجة ، حيث تزرع الطبقات الأحادية من نوع واحد من الخلايا الظهارية على ركيزة تحل محل ECM. يتم خدش الطبقة الأحادية للخلية أو زراعتها باستخدام الإستنسل لإنشاء فجوات بأشكال وأحجام محددة ثم يتم ملاحظتها32،33،34. يسمح النموذج في المختبر بتصور مثالي لسلوك الخلية ، فضلا عن فرصة تغيير صفات الركيزة ، وتعريض الخلايا للأدوية والعوامل اللاأحيائية والحيوية ، ونقل الخلايا بتركيبات تعبر عن أو تقمع جينات مختلفة ذات أهمية. ومع ذلك ، قد يفشل هذا النهج الاختزالي في التقاط بعض المعلمات المهمة التي ينطوي عليها سلوك الخلية الظهارية في سياق في الجسم الحي ، بما في ذلك الاتصال بين أنواع الخلايا المختلفة وأحداث الإشارات التي تحدث في ECM11. توفر النماذج في الجسم الحي السياق الأصلي للجرح ، مع أنواع متعددة من الخلايا ، ومسارات إشارات متداخلة ، و ECM35 معقد. أحد هذه النماذج لدراسات التئام الجروح هو الفأر19 ، حيث سمحت التطورات الحديثة للباحثين بمراقبة خلايا البشرة أثناء التئام الجروح كاملة السماكة في الحيوانات الحية36. ومع ذلك ، فإن الفأر والأنظمة الأخرى في الجسم الحي تمثل تحديات لدراسة إعادة الظهارة. أولا ، يتم موازنة الميزة الكبيرة لمراقبة سلوك الخلية في سياق طبيعي من خلال تعقيد الأحداث المتداخلة زمنيا التي تحدث أثناء التئام جروح الفقاريات ، بما في ذلك تخثر الدم ، وتجنيد الخلايا المناعية والالتهابات ، وتجنيد الخلايا الليفية ، وإزالة تمايز الخلايا ، وإعادة الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل ECM. علاوة على ذلك ، فإن الأنسجة المعتمة تجعل التصوير صعبا. لقد تغلبت أنظمة يرقة ذبابة الفاكهة والبشرةالزرد 37،38 على بعض هذه الصعوبات بسبب بساطتها النسبية39.
قدم مختبرنا مؤخرا نموذجا جديدا لدراسة التئام الجروح الظهارية: شكل ميدوسا (قنديل البحر) من الهيدروزوان cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia) 40. Clytia هو كائن نموذجي ناشئ مع جينوم41 متسلسل بالكامل ومشروح ، ونسخة RNAseq أحادية الخلية42 ، وبروتوكولات معمول بها لتعديل الجينوم (الطفرات والجينات المحورة)43،44،45. Cnidarians هي واحدة من أقدم السلالات الموجودة التي لديها طبقات ظهارية ، لذا فإن فهم التئام الجروح cnidarian يوفر نظرة ثاقبة لمسارات الأجداد التي ضمنت السلامة الظهارية. بالنسبة لتلك المسارات التي تم الحفاظ عليها في جميع أنحاء شجرة الحياة ، تقدم Clytia نظاما جديدا مثيرا لدراسة ديناميكيات الخلايا الظهارية والتنظيم الوظيفي لالتئام الجروح في الجسم الحي.
الظهارة التي تغطي السطح العلوي ل Clytia medusa (exumbrella) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية الحرشفية الشفافة التي يبلغ عرضها حوالي 50 ميكرومتر وسمكها 1-2 ميكرومتر (الشكل 1). وهي متصلة ب ECM يسمى mesoglea - "هلام" قنديل البحر. يشبه mesoglea تركيبيا ECM الموجود في الحيواناتالأخرى 46،47،48 بما في ذلك الفقاريات ، وله غشاء قاعدي 40 ، وهو شفاف تماما. يمكن خدش الطبقة الظهارية في Clytia medusa أو جرحها بسهولة (انظر أدناه). تسمح بساطة وشفافية الظهارة و ECM بتصوير عالي الدقة للخلايا وحركاتها أثناء الشفاء. في الآونة الأخيرة ، وصف كامران وآخرون التئام الجروح الصغيرة في ظهارة Clytia بالتفصيل40. وقد ثبت أن الشفاء في Clytia يحدث من خلال زحف الخلايا القائم على lamellipodia ، وانتشار الخلايا ، وهجرة الخلايا الجماعية ، بالإضافة إلى إغلاق سلسلة المحفظة التي هي أكثر نموذجية للأنظمة الجنينية (على الرغم من رؤيتها سابقا في الهياكل الحيوانية البالغة مثل القرنية49). التئام الجروح Clytia سريع للغاية ، كما شوهد في الأنظمة الأخرى التي تفتقر إلى الاستجابة الالتهابية40,50. يعتمد الشفاء في Clytia exumbrella كليا على حركات الخلايا الظهارية الموجودة - لا تتكاثر أي خلايا أو تهاجر عبر ECM إلى موقع الجرح (الفيلم التكميلي 1). تشير كل هذه النتائج إلى أن Clytia هو نظام نموذجي مفيد لدراسة التئام الجروح الظهارية. في الواقع ، أدت سهولة تصوير الخلايا الظهارية في Clytia أثناء التئام الجروح إلى اكتشاف أن lamellipodia الخلايا الظهارية تمتد وتنتشر على مناطق ECM المكشوفة طالما أن هناك غشاء قاعدي سليم. في حالة تلف الغشاء القاعدي ، يتحول الشفاء الظهاري إلى آلية سلسلة محفظة40. كان هذا أول عرض للآلية الكامنة وراء قرار الإغلاق عن طريق الزحف القائم على الصفيحة مقابل إغلاق سلسلة المحفظة ، مما يسلط الضوء على أهمية تفاعلات خلية معينة: ECM في الشفاء ومراقبة الخلايا في سياقها الطبيعي.
أدناه ، يتم وصف البروتوكولات لإنشاء وتصوير الجروح الدقيقة أحادية الخلية ، والجروح الصغيرة التي تغلق بشكل أساسي عن طريق انتشار الخلية ، والجروح الكبيرة التي تتطلب هجرة الخلايا الجماعية لإغلاقها. علاوة على ذلك ، يتم وصف بروتوكول لإدخال جزيئات صغيرة في ECM والخلايا الظهارية ، مما يسمح بالاضطرابات التجريبية للمسارات التنظيمية المفترضة لالتئام الجروح.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

جميع الأعضاء الحيوانية، من الجلد إلى العينين إلى الأمعاء، مغطاة بصفائح من الخلايا الطلائية تسمح لها بالحفاظ على الاتزان الداخلي مع حمايتها من العدوى. لذلك ، ليس من المستغرب أن تكون القدرة على إصلاح الجروح الظهارية أمرا بالغ الأهمية لجميع metazoans. يتضمن التئام الجروح الظهارية في الفقاريات عمليات متداخلة ، بما في ذلك الاستجابات الالتهابية ، والأوعية الدموية ، وإعادة الظهارة. يتضمن تنظيم هذه العمليات تفاعلات معقدة بين الخلايا الظهارية والخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ؛ يحتوي ECM على بروتينات هيكلية وبروتينات تنظيمية وجزيئات صغيرة نشطة. هذا التعقيد ، إلى جانب حقيقة أن معظم الحيوانات لديها أنسجة معتمة و ECMs يتعذر الوصول إليها ، يجعل من الصعب دراسة التئام الجروح في الحيوانات الحية. لذلك يتم تنفيذ الكثير من العمل على التئام الجروح الظهارية في أنظمة زراعة الأنسجة ، مع نوع خلية ظهارية واحدة مطلية كطبقة أحادية على مصفوفة اصطناعية. توفر Clytia hemisphaerica (Clytia ) مكملا فريدا ومثيرا لهذه الدراسات ، مما يسمح بدراسة التئام الجروح الظهارية في سليم مع ECM أصيل. ظهارة الأديم الظاهر في Clytia هي طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الحرشفية الكبيرة ، مما يسمح بالتصوير عالي الدقة باستخدام الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي (DIC) في الحيوانات الحية. إن غياب الخلايا الليفية المهاجرة أو الأوعية الدموية أو الاستجابات الالتهابية يجعل من الممكن تشريح الأحداث الحرجة في إعادة الظهارة في الجسم الحي. يمكن تحليل شفاء أنواع مختلفة من الجروح ، بما في ذلك الجروح الدقيقة أحادية الخلية ، والجروح الظهارية الصغيرة والكبيرة ، والجروح التي تلحق الضرر بالغشاء القاعدي. يمكن ملاحظة تكوين الصفيحة ، وتقلص سلسلة المحفظة ، وتمدد الخلايا ، وهجرة الخلايا الجماعية في هذا النظام. علاوة على ذلك ، يمكن إدخال العوامل الدوائية عبر ECM لتعديل تفاعلات cell: ECM والعمليات الخلوية في الجسم الحي. يوضح هذا العمل طرقا لإنشاء الجروح في Clytia الحية ، والتقاط أفلام الشفاء ، والتحقيق في آليات الشفاء عن طريق الحقن الدقيق للكواشف في ECM.

باتباع البروتوكولات المذكورة أعلاه ، تم تصوير الجروح الدقيقة أحادية الخلية والجروح الصغيرة والجروح الكبيرة. تم حفظ مكدسات مسجلة من ملفات الصور كملفات .avi.
في الفيلم 1 ، يمكن رؤية الجروح الدقيقة تغلق بين الخلايا وداخلها (الشكل 1 والشكل 2). لوحظت الصفيحة الصغيرة أثناء الإغلاق ، تليها الانكماش والشفاء. يتم استبعاد الحطام وإطلاقه في الماء. اكتمال الشفاء في دقيقة واحدة أو أقل.
في الفيلم 2 و 3 ، تلتئم الجروح الصغيرة ذات الأشكال المختلفة من خلال تكوين الصفيحة ، وتمديد ملامسات الصفيحة ، وانتشار الخلايا على هامش الجرح ، كما هو موضح سابقا40 (الشكل 1 والشكل 2). لا تشارك الخلايا الموجودة في الطبقات خلف الخلايا الهامشية في التئام الجروح بهذا الحجم ولا توجد هجرة جماعية للخلايا. يتبع الإغلاق السريع والتدريجي للفجوات الظهارية تقلص الأنسجة على طول خط الجرحالمشكل حديثا 40. يظهر المعدل الطبيعي للشفاء من هذين الجرحين ، معبرا عنه كنسبة مئوية من المساحة الأصلية بمرور الوقت ، (الشكل 4C ، D). في حين أن هناك بعض التباين في ديناميكيات إغلاق الجرح ، فإن متوسط النسبة المئوية لإغلاق المنطقة بمرور الوقت ل 14 جرحا بأشكال مختلفة تتراوح من 0.02-0.125 مم2 يسمح بإنشاء منحنى متوسط لالتئام الجروح في الحيوانات غير المعالجة (الشكل 4E).
يمكن رؤية الأضرار التي لحقت الغشاء القاعدي بوضوح عند حدوثه (الشكل 2). في الفيلم 4 ، تنتشر الخلايا الموجودة على هامش جرح صغير يوجد فيه تلف في الغشاء القاعدي حول المنطقة المتضررة ، ويكتمل إغلاق الفجوة بتقلص سلسلة المحفظة.
إذا كانت الأنسجة مجففة أو تالفة للغاية بحيث لا يمكن إصلاحها ، يمكن أن تتوقف حركات الخلايا ، أو يمكن أن تنفجر ورقة الخلايا بأكملها (الفيلم 5 والفيلم 6). يحدث هذا عادة بعد فترات طويلة من التصوير (45 دقيقة أو أكثر). إذا حدث انفجار الخلية في وقت مبكر من التصوير ، يتم التخلص من العينة.
كما هو موضح في الفيلم 7 ، تلتئم الجروح الكبيرة على عدة مراحل. أولا ، تصبح حافة الجرح ناعمة ومنتظمة بسبب الانقباضات على الهامش ، كما ورد سابقا57. بعد ذلك ، ينظر إلى الصفيحة على أنها تتشكل من الخلايا الموجودة على هامش الجرح ، مع تحرك الصفيحة للأمام لزيادة ملامسة الصفيحة المجاورة. يظهر تتبع النوى في الخلايا عند هامش الجرح وعدة طبقات خلف الخلايا الهامشية أن الفجوات الكبيرة تغلق بهجرة الخلايا الجماعية40. لا تنفصل الخلايا أبدا ولكنها تتحرك معا كورقة.
يمكن أن يكون إدخال الأصباغ والعوامل الدوائية أداة قوية لتشريح الآليات البيولوجية. يتم استبعاد العديد من المواد من Clytia (غير معروضة) ، على الأرجح بسبب طبقة المخاط التي تغطي سطح الحيوان. ومع ذلك ، يمكن استخدام الحقن المجهري لإدخال الجزيئات مباشرة في ECM ، مما يعطل هيكل ECM أو يزعج الأنشطة التنظيمية في ECM. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأصباغ والجزيئات الأخرى قادرة على دخول الخلايا الظهارية من الجانب القاعدي. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 6 التلوين النووي باستخدام Hoechst ، وتلطيخ الغشاء باستخدام FM1-43 ، وتثبيط تكوين الصفيحة بواسطة السيتوكلاسين B بعد حقن هذه الكواشف الدقيقة في ECM. يسمح إدخال هذه الجزيئات إلى ECM والخلايا الظهارية قبل الجرح بإجراء تجارب تختبر تأثير الأدوات الدوائية على عملية الشفاء.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> الشكل 6: الخلايا الطلائية للميدوسا بعد الحقن المجهري للأصباغ أو العوامل الدوائية. (أ) الخلايا الظهارية الموضحة في اللوحة العلوية بعد 5 دقائق من الحقن مع 20 ميكرومتر Hoechst (النوى) و 50 ميكرومتر FM1-43 (الأغشية). (ب، ج) التئام الجروح بعد الحقن مع التحكم في 1: 1000 DMSO (B) أو 100 μM Cytochalasin B (C). تم إجراء الجروح بعد 15 دقيقة من الحقن. تم التقاط الصور بعد 5 دقائق من الإصابة. يتم تثبيط تشكيل الصفيحة بواسطة السيتوكلاسين ب. يعتقد أن "الألياف" الظاهرة التي غالبا ما تظهر بين الخلايا في منطقة الجرح ناتجة عن شد يمتد الغشاء القاعدي - فهي لا تلطخ بالقضيب (غير معروض). قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
الفيلم 1: فيلم الفاصل الزمني لشفاء الجرح الدقيق أحادي الخلية. الوقت المنقضي: 20 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 2: فيلم الفاصل الزمني لشفاء جروح ظهارية صغيرة. الوقت المنقضي: 9 دقائق و 54 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 3: فيلم الفاصل الزمني لشفاء جروح ظهارية صغيرة. هذا الجرح أكبر وأكثر انتظاما من الجرح في الفيلم 2. الوقت المنقضي: 20 دقيقة و 54 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 4: فيلم الفاصل الزمني لجرح صغير وشفاء جرح دقيق مع تمزق الغشاء القاعدي. تنتشر Lamellipodia حول تمزق الغشاء القاعدي ، على الرغم من أنها يمكن أن تتقدم على بقية ECM. بمجرد إحاطة منطقة الجرح مع تلف الغشاء القاعدي ، يسحب تقلص سلسلة المحفظة الخلايا فوق المنطقة. الوقت المنقضي: 19 دقيقة و 4 ثوان. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 5: خلايا تموت في جرح ظهاري صغير. من المحتمل أن يكون موت الخلايا بسبب جفاف الحيوان. الوقت المنقضي: 4 دقائق و 24 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 6: جرح ظهاري صغير يفشل في إكمال الشفاء. الوقت المنقضي: 42 دقيقة و 32 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الفيلم 7: التئام الجروح الظهارية الكبيرة. الوقت المنقضي: 25 دقيقة و 29 ثانية. معدل الإطارات: 10 إطارات في الثانية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيلم.</a>
الشكل التكميلي 1: مخططات أبعاد خزان Clytia. التصور 3D من الدبابات Clytia حسب الطلب. (أ) منظر أمامي وخلفي. (ب) منظر جانبي. القطع في القطعة الموضحة باللون الأخضر مغطاة بشبكة من النايلون. يدخل الماء الخزان مباشرة فوق الشبكة ، ويكتسح الشبكة ويخلق تيارا دائريا. يخرج الماء من النظام من خلال الفتحة الموجودة في القطعة النهائية الموضحة باللون الأزرق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الفيلم التكميلي 1: مصفوفة خارج الخلية اللاخلوية في Clytia. Z-كومة من Clytia التي اتخذت باستخدام المجهر متحد البؤر. يركز المكدس في البداية على المظلة الخارجية ثم يقوم بمسح كل 10 ميكرومتر من خلال ECM إلى الأديم الباطن الصفيحة والمظلة الفرعية. تظهر الصور التي تستخدم DIC (يسار) وتلطيخ Hoechst النووي (يمين) نقص الخلايا في ECM. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

تصف هذه الورقة طريقة لإنشاء جروح في ظهارة Clytia hemisphaerica medusa الحية وصورة التئام الجروح بدقة عالية في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تقنية لإدخال الأصباغ والأدوية لاضطراب عمليات الإشارات في الخلايا الظهارية والمصفوفة خارج الخلية أثناء التئام الجروح.

توصيف التئام الجروح الظهارية في الجسم الحي باستخدام الكائن الحي النموذجي Cnidarian Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

يسمح هذا البروتوكول بتصور الخلايا الظهارية أثناء التئام الجروح في الحيوانات الحية. يسمح لنا برؤية كيف تتصرف الخلايا في بيئتها الطبيعية المعقدة. تقوم هذه التقنية بإدخال الكواشف في المصفوفة خارج الخلية وسيتوبلازم الخلية لدراسة تأثير هذه الكواشف على انتشار الخلايا وهجرتها أثناء التئام الجروح في الحيوانات الحية.التئام الجروح الظهارية و Clytia يشبه بشكل ملحوظ الشفاء في الحيوانات الأكثر تعقيدا. لذلك ، يمكننا أن نتعلم الكثير من هذا النظام حول آليات التئام الجروح وكيف نشأت. ستوضح هذه الإجراءات إليزابيث لي وفني الأبحاث إميلي واتو.لبدء عملية الجرح ، قم بإعداد ماصة نقل معدلة عن طريق قطع طرف الماصة بالمقص ، وإنشاء فتحة موسعة يبلغ قطرها حوالي 0.5 إلى 0.7 سم. باستخدام ماصة النقل المعدلة ، ضع ميدوسا التي تم جمعها من مستعمرات الاورام الحميدة المنشأة على شريحة منخفضة ، مع توجيه مظلة medusa X لأعلى. تأكد من أن ما يكفي من مياه البحر الاصطناعية ، أو ASW ، يغطي الحيوان.لإنشاء جروح دقيقة داخل الخلايا وفيما بينها ، ضع غطاء فوق الحيوان. تضغط زلة الغطاء على الميزوجليا ويؤدي ارتداد الأنسجة المضغوطة إلى إبعاد الخلايا قليلا. تخيل الحيوان على الفور لمراقبة الجروح الدقيقة التي تم إنشاؤها.لإنشاء جروح ظهارية صغيرة ، ضع ميدوسا على شريحة منخفضة مع توجيه مظلة medusa X لأعلى ، باستخدام ماصة نقل معدلة ، كما هو موضح سابقا. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، خدش سطح ميدوسا برفق. قد يؤدي الخدش اللطيف إلى حدوث تمزقات في الغشاء القاعدي.تغطية الحيوان مع زلة غطاء للتصوير. يكون وضع زلة الغطاء كافيا في بعض الأحيان لإنشاء جروح ظهارية صغيرة حتى بدون خدش. قم بإعداد إبرة حقن مجهرية ، باستخدام عمود ماصة صغير وأنبوب شعري زجاجي ، باتباع الخطوات الموضحة في النص.ضع إبرة الحقن المجهري الفارغة في حامل حقن مجهري مثبت على مناور دقيق واقطع طرف الإبرة ، بحيث تكون الفتحة حوالي 20 إلى 40 ميكرون. اضبط ضغط الانتظار على الحاقن الدقيق على الصفر ، وضغط الطرد على حوالي 20 رطلا لكل بوصة مربعة. اضبط الحاقن الدقيق لتوصيل نبضة هواء لمدة ثانيتين.لإنشاء جروح ظهارية كبيرة ، ضع ميدوسا على شريحة اكتئاب ، كما هو موضح من قبل. باستخدام المناور الدقيق ، اضبط طرف إبرة الحقن المجهري ليبقى فوق الماء مباشرة ، عن طريق غمس الطرف بعناية في الماء ، ثم سحبه بحيث يكون قريبا من السطح الظهاري للميدوسا. نبض الهواء عن طريق الضغط على ابدأ على الحاقن.كرر النبض في نفس المكان مرتين إلى أربع مرات ، اعتمادا على عرض الحافة. تتطلب النصائح الأكبر نبضات أقل. قم بتغطية الحيوان المصاب بقسيمة غطاء لتصوير الجروح الكبيرة.اضبط التركيز على المظلة x. يجب أن تكون الخلايا السداسية واضحة. حدد الجرح يدويا لتصويره.ابدأ برنامجا يجمع الصور كفيلم في الوقت الفعلي ، أو برنامجا يجمع سلسلة من الصور على فترات منتظمة. راقب التقدم للتأكد من أن منطقة الجرح لا تنجرف خارج مجال الرؤية ، وأن الخلايا ذات الاهتمام تظل في بؤرة التركيز. لحقن الأصباغ والأدوية ، قم بعمل إبرة حقن مجهرية باتباع الخطوات الموضحة في النص.ردم إبرة الحقن المجهري باستخدام طرف ماصة طويل مع حجم زائد من الصبغة أو الدواء للحقن في ميدوسا. باستخدام ماصة نقل معدلة ، ضع ميدوسا مع توجيه المظلة الفرعية لأعلى في طبق حقن polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، مع ما يكفي من ASW لتغطية الحيوان. ضع الطبق على مرحلة من المجهر تشريح.ركز على طرف إبرة الحقن المجهري ، وادفعها في الماء بالقرب من ميدوسا. باستخدام المناور الصغير ، اضغط على الإبرة في الطبق حتى تنحني وتنكسر. إنشاء فتحة طرف من حوالي 10 إلى 20 ميكرون.باستخدام المناور الدقيق ، أدخل طرف الإبرة من خلال المظلة الفرعية في mesoglea دون ثقب المظلة X. على الحاقن الدقيق ، اضبط ضغط الانتظار على الصفر ، وضغط الحقن أقل أو يساوي 20 رطلا لكل بوصة مربعة. احقن في ربع واحد أو اثنين ، واملأ كل منهما ببقعة من الصبغة أو الدواء ما يقرب من ربع مساحة هذا الربع.اعتمادا على الصبغة أو الدواء الذي يتم حقنه ، يتم وضع الحيوانات في دورق من ASW الطازج للسماح بنشر الصبغة أو الدواء وحضانته. للتصوير ، قم بتركيب ميدوسا على شريحة منخفضة باستخدام ماصة نقل معدلة ، مع وضع الحيوان مع توجيه المظلة X لأعلى. يمكن إصابة الحيوانات في هذه المرحلة لاختبار تأثير الكاشف المحقون.شكلت الجروح الدقيقة داخل الخلايا وفيما بينها صفيحة صغيرة أثناء إغلاق الجرح. وأعقب ذلك تقلص ، وشفيت الجروح في أقل من دقيقة. تلتئم الجروح الظهارية الصغيرة أيضا من خلال تكوين الصفيحة وتمديد ملامسات الصفيحة.سبق إغلاق الجرح السريع والتدريجي تقلص الأنسجة على طول خط الجرح المشكل حديثا. يشير معدل الشفاء الطبيعي لجرحين صغيرين معبرا عنه كنسبة مئوية من إجمالي مساحة الجرح بمرور الوقت إلى بعض التباين في ديناميكيات إغلاق الجرح. تم استخدام بيانات من 14 جرحا مختلفا لإنشاء متوسط منحنى التئام الجروح في الحيوانات غير المعالجة.في جرح صغير به تلف في الغشاء القاعدي ، تنتشر الخلايا الهامشية حول المنطقة المتضررة ، وتغلق الفجوة بتقلص سلسلة المحفظة. عندما تكون الأنسجة مجففة أو تالفة للغاية بحيث لا يمكن إصلاحها ، يمكن أن تتوقف حركات الخلايا ، أو يمكن أن تنفجر ورقة الخلايا بأكملها. تلتئم الجروح الكبيرة على عدة مراحل.تنعيم الحافة بعد الانقباضات على الهامش ، وتشكيل الصفيحة ، وتمديد ملامسة الصفيحة لهجرة الخلايا الجماعية عند ، وعدة طبقات من الخلايا بعيدا ، أغلق الهامش فجوات كبيرة. تم تحقيق تلطيخ النووي والأغشية عن طريق الحقن الدقيق للكواشف في ECM. الحقن المجهري للسيتوكلاسين B يثبط تشكيل الصفيحة بعد الإصابة.تعامل مع الحيوانات بلطف. عند حقن الكواشف ، تأكد من أن طرف إبرة الحقن المجهري في الميزوجليا ، ولم يمر عبر الحيوان. حاليا ، يتم تصنيع الحيوانات المعدلة وراثيا باستخدام بروتينات علامة الفلورسنت ، وسيعطي الفحص المجهري المشترك للتألق والمجهر التماثلي المتداخل صورة أوضح للأحداث الخلوية في التئام الجروح الظهارية.

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

ضمة الكوليرا : النموذجي لدراسة الكائنات البكتيرية إمراض -- مقابلة

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection الجنين الميداكا لاستخدامها بوصفها كائنا النموذجي الوراثية

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...