Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

E.E.L.L. est soutenu par une subvention de la National Science Foundation PRFB 2011010. Nous tenons à remercier Tsuyoshi Momose et Evelyn Houliston pour nous avoir aidés à établir nos colonies Clytia, Jean-Baptiste Reynier pour la collecte des images de guérison des microplaies, Harry Kyriazes pour la construction des réservoirs pseudo-kreisel et Elizabeth Baldo pour le maintien de l’habitat de Clytia. La figure 1B a été créée avec BioRender.com.

Rien à divulguer.

Ici, la méthodologie est présentée pour l’imagerie des plaies in vivo chez Clytia, un organisme modèle d’invertébrés relativement nouveau40,43,58. Plusieurs facteurs font de ce système un outil de recherche unique et puissant, distinct des autres modèles utilisés pour étudier la cicatrisation et la réépithélialisation des plaies. Tout d’abord, l’épithélium monocouche est attaché à une ECM transparente, ressemblant ainsi à des tests de culture tissulaire in vitro (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4). Comme dans les essais in vitro, les cellules peuvent être imagées à haute résolution. Cependant, contrairement à la culture tissulaire, il existe un environnement cellulaire et une MCE authentiques, de sorte que la cicatrisation des plaies peut être considérée dans le contexte des événements de signalisation complexes qui se produisent chez un animal blessé vivant. Deuxièmement, Clytia manque de réponses inflammatoires, de fibroblastes migrateurs, de système vasculaire et de sang. Cela permet d’étudier le processus de réépithélialisation in vivo en l’absence des événements de chevauchement qui se produisent chez les animaux adultes plus complexes pendant la cicatrisation des plaies59. Troisièmement, l’ECM est acellulaire (film supplémentaire 1) et de grande taille, ce qui permet un accès facile avec une aiguille de micro-injection (Figure 5 et Figure 6). En utilisant cette approche, les chercheurs peuvent tester l’effet des réactifs pharmacologiques qui perturbent la structure ou la signalisation ECM sur la cicatrisation des plaies in vivo. Les réactifs peuvent également être introduits dans les cellules épithéliales et leurs effets sur la cicatrisation in vivo des plaies peuvent être évalués. Quatrièmement, il existe des protocoles pour créer des mutants et des animaux transgéniques dans le système Clytia42,43,44,45. La cicatrisation in vivo peut donc être observée chez les animaux présentant une expression accrue/diminuée des gènes d’intérêt.
Il y a plusieurs étapes critiques dans cette technique. Tout d’abord, comme le montre la figure 3, il est nécessaire d’utiliser un microscope correctement configuré pour la microscopie DIC car les cellules épithéliales plates et transparentes sont presque invisibles avec la microscopie optique standard. Il est également important de développer l’habileté de blesser doucement les animaux afin que l’épithélium soit endommagé sans arracher l’ECM. Un toucher tout aussi doux est nécessaire pour la micro-injection de matériel dans l’ECM, car des dommages importants à l’animal pendant l’injection pourraient compromettre une analyse ultérieure de la cicatrisation de la plaie. Bien qu’il y ait une courbe d’apprentissage à ces techniques, même les étudiants débutants les ont maîtrisées rapidement dans le laboratoire Malamy. En effet, ces protocoles ont été utilisés pour démontrer la migration cellulaire dans les cours de laboratoire de premier cycle à l’Université de Chicago.
Pour une imagerie optimale, il est important que l’animal ne bouge pas et que la zone de plaie choisie ne dérive pas hors du champ de vision. Si les animaux pulsent, le traitement avec Tricaine tel que décrit est très efficace. Pour la dérive, il est souvent nécessaire de repositionner manuellement l’échantillon. Ces mouvements peuvent être éliminés du film final à l’aide de la fonction d’enregistrement dans FIJI/ImageJ.
Une limitation de ce système est qu’il n’est pas possible de créer des plaies identiques, car les plaies varient en forme et en taille en utilisant les méthodes décrites ici. Par conséquent, il peut être difficile de quantifier le taux exact de fermeture de la plaie ou de migration cellulaire. Des marqueurs positionnels tels que les grains de carbone adhèrent à l’ECM exposé chez un animal blessé et peuvent être utilisés pour mesurer le taux de migration cellulaire collective dans les grandes plaies (non représenté). Pour l’analyse de la fermeture des petites plaies, même avec une taille et une forme variables, il existe une gamme limitée de taux de fermeture parmi les plaies de cette taille (figure 4). Il est donc possible de détecter quantitativement les effets des réactifs pharmacologiques promotifs ou répressifs.
Bien que ce travail décrive la caractérisation de la cicatrisation des plaies en utilisant uniquement la microscopie DIC, les mêmes approches peuvent être utilisées pour imager la cicatrisation en utilisant la fluorescence ou la microscopie confocale. Pour aider à cela, des protocoles sont en place pour générer des animaux transgéniques dans lesquels diverses protéines cellulaires et extracellulaires sont marquées par fluorescence. L’imagerie simultanée avec CIVD et fluorescence, combinée à la perturbation de la cicatrisation des plaies à l’aide d’agents pharmacologiques ou de lignées mutantes, constituera une approche puissante pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent le processus de cicatrisation des plaies dans l’épithélium.

Des feuilles de cellules épithéliales recouvrent la surface externe de tous les métazoaires, tapissent les organes internes et divisent le corps de l’animal en compartiments discrets. L’épithélium sépare également le corps interne de l’environnement extérieur et le protège des dommages et des infections. Par conséquent, l’avènement des couches épithéliales a été une partie essentielle de l’évolution des animaux multicellulaires, et les couches épithéliales sont observées chez tous les animaux, des vertébrés aux métazoaires les plus basaux1. L’épithélium de certains organes est une monocouche unique, comme dans les sacs aériens pulmonaires, les vaisseaux sanguins et l’intestin2, ainsi que dans l’épiderme d’invertébrés tels que les planaires et les cnidaires3. Dans d’autres tissus, tels que la peau4 et la cornée5 des vertébrés, l’épithélium est stratifié, ce qui signifie qu’il existe plusieurs couches de cellules épithéliales2. Dans tous les cas, la couche épithéliale la plus basale est fixée à la membrane basale, une feuille de protéines qui forme une région spécialisée de la matrice extracellulaire (MEC)6,7,8.
Les brèches dans l’épithélium doivent être rapidement réparées pour recréer une feuille épithéliale continue. Les dommages à l’épithélium se produisent au cours de processus naturels, tels que l’excrétion de cellules épithéliales dans l’intestin,9,10 et à la suite d’une inflammation ou d’un traumatisme physique. Lorsqu’une seule cellule épithéliale est endommagée, elle doit soit se réparer, soit être éliminée pour permettre aux cellules environnantes de se fixer les unes aux autres et de fermer le trou11,12. Dans les plaies plus grandes que la taille d’une seule cellule, les cellules épithéliales doivent se déplacer pour se rejoindre et réparer la feuille13. Ceci peut être réalisé par propagation cellulaire si les espaces sont petits ou peut nécessiter la migration des cellules épithéliales à partir des bords d’une plaie pour fermer l’espace de la plaie; Ce dernier processus est appelé réépithélialisation14,15. Dans les tissus embryonnaires, les cellules épithéliales se propagent et migrent vers des plaies rapprochées ou sont tirées à travers l’espace par la contraction des câbles d’actomyosine qui se forment entre les cellules au bord de la plaie, dans un mécanisme ressemblant à un cordon de bourse16. Dans de nombreux tissus adultes, la réépithélialisation implique la migration de feuillets cellulaires cohérents, où les cellules maintiennent leurs jonctions avec les cellules voisines14,17,18. Dans d’autres tissus, les connexions cellule-cellule sont démantelées et les cellules épithéliales se comportent davantage comme des cellules mésenchymateuses, se déplaçant de manière coordonnée mais indépendante dans la région de la plaie lors de la réépithélialisation 14,19,20,21.
Les mouvements des cellules épithéliales sont régulés par des interactions complexes entre les cellules migrantes et entre les cellules et l’ECM. Bien qu’il existe une énorme quantité de littérature expérimentale sur les mécanismes d’activation des cellules épithéliales et de migration ultérieure, il reste encore beaucoup à découvrir. Par exemple, le signal initial qui active les cellules épithéliales à migrer en réponse à une plaie n’a pas été définitivement identifié 22, ni ne comprend complètement comment l’actine est redéployée pour créer des lamellipodes du côté des cellules épithéliales les plus proches de la plaie 22,23,24,25,26,27. La migration cellulaire collective nécessite que les informations provenant des cellules de la plaie soient partagées avec les cellules distales de la plaie, et la voie de communication n’est toujours pas claire28. Les jonctions cellule:cellule et cellule:ECM doivent être désassemblées et reformées au fur et à mesure que les cellules de la feuille se réorganisent, mais la régulation de ce processus est mal comprise14,29. Faire des progrès sur ces questions et d’autres questions connexes est non seulement important en tant que problème biologique fondamental, mais aussi en raison de l’importance clinique d’une cicatrisation correcte des plaies. Les maladies qui compromettent la capacité des cellules épithéliales à migrer correctement entraînent des plaies chroniques; un exemple est la maladie génétique épidermolyse bulleuse, où les gènes impliqués dans la fixation des cellules épithéliales à l’ECM sont mutés, ce qui entraîne une peau fragile qui pèle et cloque. La réépithélialisation est également compromise dans les tissus naturellement vieillissants30,31. Une meilleure compréhension est donc essentielle pour développer des interventions visant à améliorer les résultats de cicatrisation des plaies.
La migration des cellules épithéliales dans la cicatrisation des plaies a été étudiée à l’aide d’approches in vitro et d’organismes modèles. La majorité des études sur la cicatrisation des plaies et les mécanismes de migration cellulaire ont été réalisées en culture tissulaire, où des monocouches d’un seul type de cellules épithéliales sont cultivées sur un substrat qui se substitue à l’ECM. Les monocouches cellulaires sont soit rayées, soit cultivées avec des pochoirs pour créer des espaces de formes et de tailles spécifiques, puis observées32,33,34. Le modèle in vitro permet une visualisation idéale du comportement cellulaire, ainsi que la possibilité de modifier les qualités du substrat, d’exposer les cellules à des médicaments et à des facteurs abiotiques et biotiques, et de transfecter des cellules avec des constructions qui expriment ou suppriment divers gènes d’intérêt. Cependant, cette approche réductionniste peut ne pas saisir certains des paramètres importants impliqués dans le comportement des cellules épithéliales dans un contexte in vivo, y compris la communication entre divers types de cellules et les événements de signalisation qui se produisent dans l’ECM11. Les modèles in vivo fournissent le contexte authentique d’une plaie, avec plusieurs types de cellules, des voies de signalisation qui se chevauchent et un ECMcomplexe 35. L’un de ces modèles pour les études sur la cicatrisation des plaies est la souris19, dans laquelle des progrès récents ont permis aux chercheurs d’observer les cellules épidermiques pendant la cicatrisation des plaies de pleine épaisseur chez les animaux vivants36. Cependant, la souris et d’autres systèmes in vivo présentent des défis pour étudier la réépithélialisation. Premièrement, le grand avantage d’observer le comportement cellulaire dans un contexte naturel est contrebalancé par la complexité des événements qui se chevauchent temporellement pendant la cicatrisation des plaies des vertébrés, y compris la coagulation du sang, le recrutement des cellules immunitaires et l’inflammation, le recrutement des fibroblastes et la dédifférenciation cellulaire, la revascularisation et le remodelage de l’ECM. De plus, les tissus opaques rendent l’imagerie difficile. Les systèmes de larve de drosophile et d’épiderme de poisson zèbre 37,38 ont surmonté certaines de ces difficultés en raison de leur relative simplicité39.
Notre laboratoire a récemment introduit un nouveau modèle pour étudier la cicatrisation des plaies épithéliales : la forme méduse (méduse) de l’hydrozoaire cnidaire Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia est un organisme modèle émergent avec un génome 41 entièrement séquencé et annoté, un transcriptome RNAseq unicellulaire42 et des protocoles en place pour la modification du génome (mutagénèse et transgénèse)43,44,45. Les cnidaires sont l’une des plus anciennes lignées existantes à avoir des couches épithéliales, de sorte que la compréhension de la cicatrisation des plaies cnidaires donne un aperçu des voies ancestrales qui assuraient l’intégrité épithéliale. Pour les voies qui ont été conservées tout au long de l’arbre de vie, Clytia propose un nouveau système passionnant pour étudier la dynamique des cellules épithéliales et la régulation fonctionnelle de la cicatrisation des plaies in vivo.
L’épithélium recouvrant la surface supérieure de la Clytia medusa (exumbrella) est une monocouche de cellules épithéliales épithéliales squameuses transparentes d’environ 50 μm de large sur 1-2 μm d’épaisseur (Figure 1). Ils sont attachés à un ECM appelé la mésogle - la « gelée » de la méduse. La composition de la mésogle est similaire à celle de l’ECM trouvée chez d’autres animaux 46,47,48, y compris les vertébrés, a une membrane basale 40 et est complètement transparente. La couche épithéliale de la Clytia medusa peut être facilement rayée ou blessée (voir ci-dessous). La simplicité et la transparence de l’épithélium et de l’ECM permettent une imagerie haute résolution des cellules et de leurs mouvements pendant la cicatrisation. Récemment, Kamran et al. ont caractérisé la cicatrisation de petites plaies dans l’épithélium Clytia en détail40. Il a été démontré que la guérison chez Clytia se produit par le rampement cellulaire à base de lamellipodes, la propagation cellulaire et la migration cellulaire collective, ainsi que par la fermeture du cordon de la bourse qui est plus typique des systèmes embryonnaires (bien que vu précédemment dans les structures animales adultes telles que la cornée49). La cicatrisation des plaies de Clytia est extrêmement rapide, comme on l’a vu dans d’autres systèmes qui n’ont pas de réponse inflammatoire40,50. La cicatrisation dans l’exumbrella de Clytia dépend entièrement des mouvements des cellules épithéliales existantes – aucune cellule ne prolifère ou ne migre à travers l’ECM vers le site de la plaie (film supplémentaire 1). Tous ces résultats suggèrent que Clytia est un système modèle utile pour étudier la cicatrisation des plaies épithéliales. En effet, la facilité d’imagerie des cellules épithéliales chez Clytia pendant la cicatrisation des plaies a conduit à la découverte que les lamellipodes des cellules épithéliales s’étendent et se propagent sur les zones d’ECM exposées tant qu’il y a une membrane basale intacte; Si la membrane basale est endommagée, la cicatrisation épithéliale passe à un mécanisme de cordon de bourse40. Il s’agissait de la première démonstration d’un mécanisme sous-jacent à la décision de fermer par rampement à base de lamellipodes plutôt que par fermeture de cordon de bourse, soulignant l’importance des interactions cellules:ECM spécifiques dans la guérison et de l’observation des cellules dans leur contexte naturel.
Ci-dessous, les protocoles sont décrits pour la création et l’imagerie de microplaies unicellulaires, de petites plaies qui se ferment principalement par propagation cellulaire et de grandes plaies qui nécessitent une migration cellulaire collective pour se fermer. En outre, un protocole est décrit pour l’introduction de petites molécules dans l’ECM et les cellules épithéliales, permettant des perturbations expérimentales des voies de régulation putatives de la cicatrisation des plaies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

Tous les organes animaux, de la peau aux yeux en passant par les intestins, sont recouverts de feuilles de cellules épithéliales qui leur permettent de maintenir l’homéostasie tout en les protégeant des infections. Par conséquent, il n’est pas surprenant que la capacité de réparer les plaies épithéliales soit essentielle pour tous les métazoaires. La cicatrisation épithéliale des plaies chez les vertébrés implique des processus qui se chevauchent, y compris les réponses inflammatoires, la vascularisation et la réépithélialisation. La régulation de ces processus implique des interactions complexes entre les cellules épithéliales, les cellules voisines et la matrice extracellulaire (ECM); l’ECM contient des protéines structurelles, des protéines régulatrices et de petites molécules actives. Cette complexité, ainsi que le fait que la plupart des animaux ont des tissus opaques et des ECM inaccessibles, rend la cicatrisation des plaies difficile à étudier chez les animaux vivants. Une grande partie du travail sur la cicatrisation des plaies épithéliales est donc effectuée dans des systèmes de culture tissulaire, avec un seul type de cellule épithéliale plaqué comme une monocouche sur une matrice artificielle. Clytia hemisphaerica (Clytia) fournit un complément unique et passionnant à ces études, permettant d’étudier la cicatrisation des plaies épithéliales chez un animal intact avec une ECM authentique. L’épithélium ectodermique de Clytia est une couche unique de grandes cellules épithéliales squameuses, permettant une imagerie à haute résolution utilisant la microscopie à contraste interférent différentiel (CIVD) chez les animaux vivants. L’absence de fibroblastes migrateurs, de réponses vasculaires ou inflammatoires permet de disséquer les événements critiques en réépithélialisation in vivo. La cicatrisation de divers types de plaies peut être analysée, y compris les microplaies unicellulaires, les petites et grandes plaies épithéliales et les plaies qui endommagent la membrane basale. La formation de lamellipodes, la contraction de la corde coulissante, l’étirement cellulaire et la migration cellulaire collective peuvent tous être observés dans ce système. De plus, des agents pharmacologiques peuvent être introduits via l’ECM pour modifier les interactions cellule:ECM et les processus cellulaires in vivo. Ce travail montre des méthodes pour créer des plaies dans Clytia vivant, capturer des films de guérison et sonder les mécanismes de guérison en microinjectant des réactifs dans l’ECM.

En suivant les protocoles ci-dessus, des microplaies unicellulaires, de petites plaies et de grandes plaies ont été imagées. Les piles enregistrées de fichiers image ont été enregistrées en tant que fichiers .avi.
Dans le film 1, on peut voir des microplaies se refermer entre et à l’intérieur des cellules (Figure 1 et Figure 2). De petits lamellipodes sont observés pendant la fermeture, suivie d’une contraction et d’une cicatrisation. Les débris sont exclus et rejetés dans l’eau. La guérison est terminée en une minute ou moins.
Dans les films 2 et 3, de petites plaies de formes différentes guérissent par la formation de lamellipodes, l’extension des contacts lamellipodiens et la propagation des cellules au bord de la plaie, comme décrit précédemment40 (Figure 1 et Figure 2). Les cellules situées en rangs derrière les cellules marginales ne participent pas à la cicatrisation des plaies de cette taille et il n’y a pas non plus de migration cellulaire collective. La fermeture rapide et progressive des lacunes épithéliales est suivie d’une contraction tissulaire le long de la couture de la plaie nouvellement formée40. Le taux normalisé de cicatrisation de ces deux plaies, exprimé en pourcentage de la surface d’origine au fil du temps, est présenté (figure 4C,D). Bien qu’il existe une certaine variabilité dans la dynamique de la fermeture des plaies, la moyenne du pourcentage de fermeture de la zone au fil du temps pour 14 plaies de formes variées allant de 0,02 à 0,125 mm2 permet d’établir une courbe moyenne pour la cicatrisation des plaies chez les animaux non traités (figure 4E).
Les dommages à la membrane basale sont clairement visibles lorsqu’ils se produisent (figure 2). Dans le film 4, les cellules à la marge d’une petite plaie dans laquelle il y a des dommages à la membrane basale répartis autour de la zone endommagée, et la fermeture de l’espace est complétée par une contraction de la corde de la bourse.
Si le tissu est déshydraté ou trop endommagé pour être réparé, les mouvements cellulaires peuvent s’arrêter ou toute la feuille de cellules peut éclater (film 5 et film 6). Cela se produit généralement après de longues périodes d’imagerie (45 minutes ou plus). Si l’éclatement cellulaire se produit tôt dans l’imagerie, l’échantillon est jeté.
Comme le montre le film 7, les grandes blessures guérissent en plusieurs étapes. Tout d’abord, le bord de la plaie devient lisse et régulier en raison des contractions à la marge, comme indiqué précédemment57. Ensuite, on voit la formation de lamellipodes à partir des cellules au bord de la plaie, les lamellipodes se déplaçant vers l’avant pour maximiser le contact avec les lamellipodes adjacents. Le suivi des noyaux dans les cellules au bord de la plaie et à plusieurs niveaux derrière les cellules marginales montre que de grandes lacunes se comblent par la migration cellulaire collective40. Les cellules ne se détachent jamais mais se déplacent ensemble comme une feuille.
L’introduction de colorants et d’agents pharmacologiques peut être un outil puissant pour disséquer les mécanismes biologiques. De nombreuses substances sont exclues de Clytia (non représentées), probablement en raison de la couche de mucus qui recouvre la surface de l’animal. Cependant, la micro-injection peut être utilisée pour introduire directement des molécules dans l’ECM, perturbant la structure de l’ECM ou perturbant les activités de régulation dans l’ECM. De plus, les colorants et autres molécules sont capables de pénétrer dans les cellules épithéliales par la face basale. Par exemple, la figure 6 montre la coloration nucléaire avec Hoechst, la coloration membranaire avec FM1-43 et l’inhibition de la formation de lamellipodes par la cytochalasine B après que ces réactifs ont été microinjectés dans l’ECM. L’introduction de ces molécules dans l’ECM et les cellules épithéliales avant la blessure permet des expériences qui testent l’effet des outils pharmacologiques sur le processus de guérison.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> Figure 6 : Cellules épithéliales de la méduse après micro-injection de colorants ou d’agents pharmacologiques. (A) Cellules épithéliales montrées dans le panneau supérieur 5 minutes après injection avec 20 μM Hoechst (noyaux) et 50 μM FM1-43 (membranes). (B,C) Cicatrisation après injection avec 1:1 000 DMSO témoin (B) ou 100 μM de cytochalasine B (C). Les plaies ont été faites 15 minutes après l’injection. Les images ont été prises 5 minutes après la blessure. La formation de lamellipodes est inhibée par la cytochalasine B. On pense que les « fibres » apparentes souvent observées entre les cellules de la zone de la plaie sont le résultat de la tension qui étire la membrane basale – elles ne se colorent pas avec la phalloïdine (non représentée). Barres d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Film 1: Film accéléré de cicatrisation de microplaies unicellulaires. Temps écoulé : 20 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 2: Film accéléré d’une petite plaie épithéliale cicatrisant. Temps écoulé : 9 min 54 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 3: Film en accéléré d’une petite plaie épithéliale cicatrisant. Cette blessure est plus grande et de forme plus irrégulière que celle du film 2. Temps écoulé : 20 min 54 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 4: Film en accéléré d’une petite plaie et d’une cicatrisation de microplaie avec une déchirure de la membrane basale. Les lamellipodes se propagent autour de la déchirure de la membrane basale, bien qu’ils puissent progresser sur le reste de l’ECM. Une fois que la région de la plaie avec les dommages à la membrane basale est entourée, une contraction de cordon de bourse tire les cellules sur la région. Temps écoulé : 19 min 4 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 5: Cellules mourant dans une petite plaie épithéliale. La mort cellulaire est probablement due à la déshydratation de l’animal. Temps écoulé : 4 min 24 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 6: Une petite blessure épithéliale ne parvient pas à compléter la guérison. Temps écoulé : 42 min 32 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film 7: Cicatrisation des grandes plaies épithéliales. Temps écoulé : 25 min 29 s. Fréquence d’images: 10 ips. Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Figure supplémentaire 1 : Schémas des dimensions du réservoir Clytia. Visualisation 3D des chars Clytia sur mesure. (A) Vue avant et arrière. (B) Vue latérale. La découpe dans la pièce montrée en vert est recouverte d’une maille de nylon. L’eau pénètre dans le réservoir directement sur le treillis, balaie le treillis et crée un courant circulaire. L’eau sort du système par le trou dans la pièce d’extrémité représentée en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Film supplémentaire 1: Matrice extracellulaire acellulaire dans Clytia. Z-stack de Clytia prélevé par microscopie confocale. La pile se concentre d’abord sur l’exumbrella, puis balaye tous les 10 μm à travers l’ECM jusqu’à l’endoderme et le sous-parapluie de la plaque. Les images utilisant la DIC (à gauche) et la coloration nucléaire de Hoechst (à droite) montrent l’absence de cellules dans l’ECM. Barre d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Cet article décrit une méthode pour créer des plaies dans l’épithélium d’une Clytia hemisphaerica medusa vivante et imager la cicatrisation des plaies à haute résolution in vivo. En outre, une technique pour introduire des colorants et des médicaments pour perturber les processus de signalisation dans les cellules épithéliales et la matrice extracellulaire pendant la cicatrisation des plaies est présentée.

Caractérisation de la cicatrisation épithéliale in vivo à l’aide de l’organisme modèle cnidaire Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Ce protocole permet la visualisation des cellules épithéliales pendant la cicatrisation des plaies chez les animaux vivants. Il nous permet de voir comment les cellules se comportent dans leur environnement complexe naturel. Cette technique introduit des réactifs dans la matrice extracellulaire et le cytoplasme cellulaire pour étudier l’effet de ces réactifs sur la propagation et la migration cellulaires pendant la cicatrisation des plaies chez les animaux vivants.La cicatrisation épithéliale des plaies et Clytia ressemble remarquablement à la guérison chez les animaux plus complexes. Par conséquent, nous pouvons apprendre beaucoup de ce système sur les mécanismes de cicatrisation des plaies et leur origine. Elizabeth Lee et la technicienne de recherche Emily Watto feront la démonstration de ces procédures.Pour commencer le processus de blessure, préparez une pipette de transfert modifiée en coupant la pointe de la pipette avec des ciseaux, créant ainsi une ouverture élargie mesurant environ 0,5 à 0,7 centimètre de diamètre. À l’aide de la pipette de transfert modifiée, placez la méduse recueillie dans les colonies de polypes établies sur une lame de dépression, avec le parapluie de la méduse X tourné vers le haut. Assurez-vous que juste assez d’eau de mer artificielle, ou ASW, couvre l’animal.Pour créer des micro-plaies à l’intérieur et entre les cellules, placez un couvercle sur l’animal. La glissière de couverture comprime la mésoglée et le rebond du tissu comprimé force les cellules à s’écarter légèrement. Imaginez immédiatement l’animal pour observer les micro-plaies créées.Pour créer de petites plaies épithéliales, placez la méduse sur une lame de dépression avec le parapluie méduse X vers le haut, à l’aide d’une pipette de transfert modifiée, comme démontré précédemment. À l’aide d’un embout de pipette de 200 microlitres, grattez doucement la surface de la méduse. Un léger grattage peut créer des déchirures dans la membrane basale.Couvrez l’animal avec un bordereau de couverture pour l’imagerie. Placer le couvercle est parfois suffisant pour créer de petites plaies épithéliales même sans rayures. Préparez une aiguille de micro-injection, à l’aide d’un pilier de micropipette et d’un tube capillaire en verre, en suivant les étapes décrites dans le texte.Placez l’aiguille de microinjection vide dans un support de micro-injection fixé à un micromanipulateur et coupez la pointe de l’aiguille, de telle sorte que l’ouverture soit d’environ 20 à 40 microns. Réglez la pression de maintien sur le micro-injecteur à zéro et la pression d’éjection à environ 20 livres par pouce carré. Réglez le micro-injecteur pour qu’il délivre une impulsion d’air de deux secondes.Pour créer de grandes plaies épithéliales, placez la méduse sur une lame de dépression, comme démontré précédemment. À l’aide du micromanipulateur, ajustez l’extrémité de l’aiguille de micro-injection pour qu’elle reste juste au-dessus de l’eau, en plongeant soigneusement la pointe dans l’eau, puis en la rétractant de manière à ce qu’elle soit proche de la surface épithéliale de la méduse. Pulsez de l’air en appuyant sur start sur l’injecteur.Répétez l’impulsion au même endroit deux à quatre fois, selon la largeur de la pointe. Les pointes plus grandes nécessitent moins d’impulsions. Couvrez l’animal blessé avec un bordereau de couverture pour imager les grandes plaies.Ajustez la mise au point sur le parapluie x. Les cellules hexagonales doivent être claires. Identifiez manuellement une plaie pour l’imager.Démarrez un programme qui collecte des images sous forme de film en temps réel, ou un programme qui collecte une série d’images à intervalles réguliers. Surveillez les progrès pour vous assurer que la zone de la plaie ne dérive pas hors du champ de vision et que les cellules d’intérêt restent nettes. Pour l’injection de colorants et de drogues, fabriquez une aiguille de micro-injection en suivant les étapes décrites dans le texte.Remplissez l’aiguille de micro-injection à l’aide d’une longue pointe de pipette avec un volume excessif de colorant ou de médicament pour injection dans la méduse. À l’aide d’une pipette de transfert modifiée, placer une méduse avec le sous-parasol vers le haut dans le polydiméthylsiloxane, ou boîte d’injection PDMS, avec juste assez d’ASW pour couvrir l’animal. Placez le plat sur une scène d’un microscope à dissection.Concentrez-vous sur la pointe de l’aiguille de micro-injection et avancez-la dans l’eau près de la méduse. Avec le micro-manipulateur, enfoncez l’aiguille dans le plat jusqu’à ce qu’il se plie et se casse. Création d’une ouverture de pointe d’environ 10 à 20 microns.À l’aide du micro-manipulateur, insérez la pointe de l’aiguille à travers le sous-parasol dans la mésogle sans perforer le parapluie X. Sur le micro-injecteur, réglez la pression de maintien à zéro et la pression d’injection inférieure ou égale à 20 livres par pouce carré. Injecter dans un ou deux quadrants, en remplissant chacun avec une tache de colorant ou de médicament environ un quart de la surface de ce quadrant.Selon le colorant ou le médicament injecté, les animaux sont placés dans un bécher d’ASW frais pour permettre la diffusion et l’incubation du colorant ou du médicament. Pour l’imagerie, montez la méduse sur une lame de dépression à l’aide d’une pipette de transfert modifiée, en positionnant l’animal avec le parapluie X tourné vers le haut. Les animaux peuvent être blessés à ce stade pour tester l’effet d’un réactif injecté.Les micro-plaies à l’intérieur et entre les cellules ont formé de petits lamellipodes lors de la fermeture de la plaie. Cela a été suivi d’une contraction, et les blessures ont guéri en moins d’une minute. Les petites plaies épithéliales ont également guéri par la formation de lamellipodes et l’extension des contacts lamellipodiens.La fermeture rapide et progressive de la plaie a précédé la contraction tissulaire le long de la couture de la plaie nouvellement formée. Le taux de cicatrisation normalisé de deux petites plaies, exprimé en pourcentage de la surface totale de la plaie au fil du temps, indiquait une certaine variabilité dans la dynamique de fermeture de la plaie. Les données de 14 plaies différentes ont été utilisées pour établir une courbe moyenne de cicatrisation chez les animaux non traités.Dans une petite plaie ayant des dommages à la membrane basale, les cellules marginales se sont répandues autour de la zone endommagée et l’espace s’est fermé avec une contraction de la corde de la bourse. Lorsque le tissu était déshydraté ou trop endommagé pour être réparé, les mouvements cellulaires pouvaient s’arrêter ou toute la feuille de cellules pouvait éclater. Grandes plaies guéries en plusieurs étapes.Le lissage du bord à la suite de contractions à la marge, la formation de lamellipodes et l’extension des contacts de lamellipodes La migration cellulaire collective à la marge et à plusieurs niveaux cellulaires de la marge a comblé de grandes lacunes. La coloration nucléaire et membranaire a été obtenue en microinjectant les réactifs dans l’ECM. La micro-injection de cytochalasine B a inhibé la formation de lamellipodes après la blessure.Manipulez les animaux avec douceur. Lorsque vous injectez des réactifs, assurez-vous que l’extrémité de l’aiguille de micro-injection se trouve dans la mésogle et n’a pas traversé complètement l’animal. Actuellement, les animaux transgéniques sont fabriqués avec des protéines de marquage fluorescentes, la fluorescence combinée et la microscopie de contraste interférent différentiel donneront une image encore plus claire des événements cellulaires dans la cicatrisation des plaies épithéliales.

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organisme modèle pour étudier la pathogenèse bactérienne - Interview

Recherche

Biologie

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

La production de transgéniques Xenopus laevis Intégration par médiation des enzymes de restriction et de la transplantation nucléaire

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

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Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

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Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...