Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

E.E.L.L. נתמך על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע PRFB 2011010. ברצוננו להודות לצויושי מומוז ואוולין הוליסטון על עזרתם להקים את מושבות קליטיה שלנו, לז'אן-בטיסט ריינייה על איסוף תמונות ריפוי המיקרו-פצעים, להארי קירייזס על בניית מיכלי הפסאודו-קרייזל, ולאליזבת באלדו על שמירת בית הגידול של קליטיה. איור 1B נוצר באמצעות BioRender.com.

אין מה לחשוף.

כאן, המתודולוגיה מוצגת עבור הדמיה פצעים in vivo ב Clytia, אורגניזם מודל חדש יחסית של חסרי חוליות40,43,58. ישנם מספר גורמים שהופכים מערכת זו לכלי מחקר ייחודי ורב עוצמה, להבדיל ממודלים אחרים המשמשים לחקר ריפוי פצעים ואפיתל מחדש. ראשית, האפיתל החד-שכבתי מחובר ל-ECM שקוף, ולכן דומה למבחני תרביות רקמה חוץ גופית (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4). כמו במבחני מבחנה, ניתן לצלם תאים ברזולוציה גבוהה. עם זאת, שלא כמו בתרבית רקמות, קיימת סביבה תאית אותנטית ו- ECM, כך שניתן לראות ריפוי פצעים בהקשר של אירועי איתות מורכבים המתרחשים בחיה פצועה חיה. שנית, Clytia חסר תגובות דלקתיות, פיברובלסטים נודדים, כלי דם ודם. זה מאפשר את תהליך אפיתל מחדש להיחקר in vivo בהיעדר אירועים חופפים המתרחשים בבעלי חיים בוגרים מורכבים יותר במהלך ריפוי פצעים59. שלישית, ה-ECM הוא אצלולרי (סרט משלים 1) וגדול, ומאפשר גישה נוחה באמצעות מחט מיקרו-הזרקה (איור 5 ואיור 6). באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לבחון את ההשפעה של ריאגנטים פרמקולוגיים המפריעים למבנה ECM או איתות על ריפוי פצעים in vivo. ריאגנטים יכולים גם להיות הציג לתוך תאי אפיתל, ואת ההשפעות שלהם על ריפוי פצע in vivo ניתן להעריך. רביעית, קיימים פרוטוקולים ליצירת מוטנטים ובעלי חיים טרנסגניים במערכת קליטיה42,43,44,45. לכן ניתן לראות ריפוי פצעים In vivo בבעלי חיים עם ביטוי מוגבר/מופחת של גנים מעניינים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בטכניקה זו. ראשית, כפי שמוצג באיור 3, יש צורך להשתמש במיקרוסקופ שמוגדר כראוי למיקרוסקופ DIC מאחר שתאי האפיתל השטוחים והשקופים כמעט בלתי נראים במיקרוסקופ אור סטנדרטי. חשוב גם לפתח את המיומנות לפצוע בעלי חיים בעדינות, כך שהאפיתל ייפגע מבלי לעקור את ה- ECM. מגע עדין דומה נחוץ להזרקה זעירה של חומרים לתוך ה-ECM, מכיוון שנזק נרחב לבעל החיים במהלך ההזרקה עלול לפגוע בניתוח מאוחר יותר של ריפוי פצעים. אמנם יש עקומת למידה לטכניקות אלה, אפילו תלמידים מתחילים שולטים בהן במהירות במעבדת מלאמי. ואכן, פרוטוקולים אלה שימשו להדגמת נדידת תאים בקורסי מעבדה לתואר ראשון באוניברסיטת שיקגו.
להדמיה אופטימלית, חשוב שהחיה לא תזוז ואזור הפצע הנבחר לא ייסחף משדה הראייה. אם בעלי חיים פועמים, הטיפול בטריקאין כמתואר יעיל מאוד. עבור היסחפות, לעתים קרובות יש צורך למקם מחדש את הדגימה באופן ידני. ניתן לבטל תנועות אלה מהסרט הסופי באמצעות פונקציית הרישום ב- FIJI/ImageJ.
מגבלה במערכת זו היא שלא ניתן ליצור פצעים זהים, שכן פצעים משתנים הן בצורתם והן בגודלם בשיטות המתוארות כאן. לכן, זה יכול להיות קשה לכמת את הקצב המדויק של סגירת פצע או נדידת תאים. סמני מיקום כגון גרגרי פחמן נדבקים ל-ECM החשוף בחיה פצועה וניתן להשתמש בהם כדי למדוד את קצב נדידת התאים הקולקטיבית בפצעים גדולים (לא מוצג). עבור ניתוח סגירת פצעים קטנים, אפילו עם גודל וצורה משתנים של פצע, קיים טווח מוגבל של שיעורי סגירה בקרב פצעים בגודל זה (איור 4). לכן ניתן לזהות כמותית את ההשפעות של ריאגנטים פרמקולוגיים מניעים או דכאניים.
בעוד שעבודה זו מתארת אפיון ריפוי פצעים באמצעות מיקרוסקופ DIC בלבד, ניתן להשתמש באותן גישות כדי לדמיין ריפוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי. כדי לסייע בכך, קיימים פרוטוקולים ליצירת בעלי חיים טרנסגניים שבהם חלבונים תאיים וחוץ-תאיים שונים מסומנים באופן פלואורסצנטי. הדמיה במקביל עם DIC ופלואורסצנציה, בשילוב עם הפרעה של ריפוי פצעים באמצעות חומרים פרמקולוגיים או קווים מוטנטיים, תהיה גישה רבת עוצמה להבנת מנגנונים העומדים בבסיס תהליך ריפוי הפצע באפיתל.

יריעות של תאי אפיתל מכסות את פני השטח החיצוניים של כל המטזואנים, מרפדות איברים פנימיים ומחלקות את גוף החיה לתאים נפרדים. האפיתל גם מפריד את הגוף הפנימי מהסביבה החיצונית ומגן עליו מפני נזק וזיהום. לפיכך, הופעתן של שכבות אפיתל הייתה חלק מהותי באבולוציה של בעלי חיים רב-תאיים, ושכבות אפיתל נראות בכל בעלי החיים, החל מבעלי חוליות וכלה במטזואנים הבסיסיים ביותר1. האפיתל של איברים מסוימים הוא חד-שכבתי יחיד, כגון בשקי האוויר של הריאה, בכלי הדם ובמעיים2, כמו גם באפידרמיס של חסרי חוליות כגון פלנריה וקנידריאן3. ברקמות אחרות, כגון עור4 וקרנית5 של בעלי חוליות, האפיתל מרובד, כלומר יש שכבות מרובות של תאי אפיתל2. בכל המקרים, שכבת האפיתל הבסיסית ביותר מוצמדת לקרום המרתף, יריעת חלבון היוצרת אזור מיוחד של המטריצה החוץ תאית (ECM)6,7,8.
פרצות באפיתל חייבות להיות מתוקנות במהירות כדי ליצור מחדש יריעת אפיתל רציפה. נזק לאפיתל מתרחש במהלך תהליכים טבעיים, כגון שפיכת תאי אפיתל במעיים,9,10 וכתוצאה מדלקת או טראומה פיזית. כאשר תא אפיתל יחיד ניזוק, הוא חייב לתקן את עצמו או להיות מסולק כדי לאפשר לתאים הסובבים אותו להיצמד זה לזה ולסגור את החור11,12. בפצעים הגדולים מגודלו של תא בודד, תאי אפיתל חייבים לנוע כדי להגיע זה לזה ולתקן את היריעה13. זה יכול להיות מושג על ידי התפשטות תאים אם הפערים קטנים או עשוי לדרוש נדידה של תאי אפיתל משולי הפצע כדי לסגור את פער הפצע; תהליך אחרון זה נקרא אפיתל מחדש14,15. ברקמות עובריות, תאי אפיתל מתפשטים ונודדים לסגור פצעים או נמשכים על פני הרווח על ידי התכווצות של כבלי אקטומיוזין הנוצרים בין התאים בשולי הפצע, במנגנון הדומה לחוט ארנק16. ברקמות בוגרות רבות, אפיתל מחדש כרוך בנדידה של יריעות תאים קוהרנטיות, שם התאים שומרים על הצמתים שלהם עם תאים שכנים14,17,18. ברקמות אחרות, קשרי תאים:תאים מפורקים ותאי אפיתל מתנהגים יותר כמו תאים מזנכימליים, נעים באופן מתואם אך עצמאי לאזור הפצע במהלך אפיתל מחדש 14,19,20,21.
תנועות תאי אפיתל מווסתות על ידי אינטראקציות מורכבות בין התאים הנודדים ובין התאים לבין ECM. בעוד שיש כמות עצומה של ספרות ניסיונית העוסקת במנגנונים של הפעלת פצעים של תאי אפיתל ונדידה לאחר מכן, הרבה עדיין נותר לגלות. לדוגמה, האות הראשוני שמפעיל תאי אפיתל לנדוד בתגובה לפצע לא זוהה בוודאות 22, וגם לא לגמרי מובן כיצד אקטין נפרס מחדש כדי ליצור למליפודיה בצד תאי האפיתל הקרוב ביותר לפצע 22,23,24,25,26,27. נדידת תאים קולקטיבית דורשת שיתוף מידע מתאים בפצע עם תאים דיסטליים לפצע, ומסלול התקשורת עדיין אינו ברור28. Cell:cell junctions and cell:ECM attachments חייבים להיות מפורקים ומתוקנים כאשר תאים בגיליון מסדרים את עצמם מחדש, אך רגולציה של תהליך זה אינה מובנת היטב 14,29. התקדמות בשאלות אלה ואחרות חשובה לא רק כבעיה ביולוגית בסיסית, אלא גם בגלל המשמעות הקלינית של ריפוי פצעים נכון. מחלות הפוגעות ביכולתם של תאי אפיתל לנדוד כראוי גורמות לפצעים כרוניים; דוגמה לכך היא המחלה הגנטית Epidermolysis bullosa, שבה גנים המעורבים בחיבור תאי האפיתל ל- ECM עוברים מוטציה, וכתוצאה מכך עור שביר שמתקלף ושלפוחיות. אפיתל מחדש נפגע גם ברקמות הזדקנות טבעית30,31. לכן הבנה טובה יותר חיונית לפיתוח התערבויות לשיפור תוצאות ריפוי הפצעים.
נדידת תאי אפיתל בריפוי פצעים נחקרה הן בגישות מבחנה והן באורגניזמים מודל. רוב המחקרים על ריפוי פצעים ומנגנוני נדידת תאים בוצעו בתרבית רקמה, שבה מונושכבות מסוג תא אפיתל יחיד גדלות על מצע המחליף את ECM. חד-שכבות תאים נשרטות או גדלות עם שבלונות כדי ליצור רווחים של צורות וגדלים ספציפיים ולאחר מכן נצפו32,33,34. מודל המבחנה מאפשר הדמיה אידיאלית של התנהגות התא, כמו גם הזדמנות לשנות את איכויות המצע, לחשוף תאים לתרופות ולגורמים אביוטיים וביוטיים ולהדביק תאים במבנים המבטאים או מדכאים גנים שונים בעלי עניין. עם זאת, גישה רדוקציוניסטית זו עלולה להיכשל בללכוד כמה מהפרמטרים החשובים המעורבים בהתנהגות תאי אפיתל בהקשר in vivo, כולל תקשורת בין סוגי תאים שונים ואירועי איתות המתרחשים ב- ECM11. מודלים In vivo מספקים את ההקשר האותנטי של פצע, עם סוגי תאים מרובים, מסלולי איתות חופפים ו- ECM35 מורכב. מודל אחד כזה למחקרי ריפוי פצעים הוא עכבר19, שבו ההתקדמות האחרונה אפשרה לחוקרים לצפות בתאי אפידרמיס במהלך ריפוי פצעים בעובי מלא בבעלי חיים36. עם זאת, העכבר ומערכות in vivo אחרות מציבות אתגרים לחקר אפיתל מחדש. ראשית, היתרון הגדול של התבוננות בהתנהגות התא בהקשר טבעי מאוזן על ידי המורכבות של האירועים החופפים זמנית המתרחשים במהלך ריפוי פצעים בחוליות, כולל קרישת דם, גיוס תאי חיסון ודלקת, גיוס פיברובלסטים ודה-התמיינות תאים, וסקולריזציה מחדש ועיצוב מחדש של ECM. יתר על כן, רקמות אטומות מקשות על הדמיה. מערכות האפידרמיס של זחלי דרוזופילה ודגי זברה 37,38 התגברו על חלק מהקשיים הללו בגלל פשטותם היחסית 39.
המעבדה שלנו הציגה לאחרונה מודל חדש לחקר ריפוי פצעי אפיתל: צורת המדוזה (מדוזות) של Clytia hemisphaerica (Clytia)40. קליטיה היא אורגניזם מודל מתפתח עם גנום 41 מרוצף ומבואר במלואו, תעתיק RNAseq42 של תא בודד, ופרוטוקולים לשינוי גנום (מוטגנזה וטרנסגנזה)43,44,45. קנידארים הם אחת השושלות העתיקות ביותר שקיימות שיש להם שכבות אפיתל, כך שהבנת ריפוי פצעים קנידאריים מספקת תובנות לגבי מסלולי האבות שהבטיחו שלמות אפיתל. עבור אותם מסלולים שנשמרו לאורך עץ החיים, Clytia מציעה מערכת חדשה ומלהיבה לחקר דינמיקה של תאי אפיתל והרגולציה התפקודית של ריפוי פצעים in vivo.
האפיתל המכסה את פני השטח העליונים של Clytia medusa (exumbrella) הוא חד-שכבה של תאי אפיתל שקופים וקשקשיים שרוחבם כ-50 מיקרומטר ועובי 1-2 מיקרומטר (איור 1). הם מחוברים ל-ECM שנקרא mesoglea – ה"מדוזה" של המדוזות. המזוגליאה דומה בהרכבה ל-ECM שנמצא אצל בעלי חיים אחרים 46,47,48 כולל בעלי חוליות, יש לו קרום מרתף 40, והוא שקוף לחלוטין. שכבת האפיתל במדוזה Clytia ניתנת לשריטה או לפציעה בקלות (ראה להלן). הפשטות והשקיפות של האפיתל וה-ECM מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של התאים ותנועותיהם במהלך הריפוי. לאחרונה, Kamran et al. אפיינו את ריפוי פצעים קטנים באפיתל Clytia בפירוט40. הוכח כי ריפוי בקליטיה מתרחש באמצעות זחילת תאים מבוססת למליפודיה, התפשטות תאים ונדידת תאים קולקטיבית, כמו גם סגירת חוט ארנק האופיינית יותר למערכות עובריות (אם כי נראתה בעבר במבנים של בעלי חיים בוגרים כגון הקרנית49). ריפוי פצעי קליטיה הוא מהיר ביותר, כפי שנראה במערכות אחרות שאין בהן תגובה דלקתית40,50. הריפוי ב-Clytia exumbrella תלוי לחלוטין בתנועות של תאי האפיתל הקיימים – אין תאים שמתרבים או נודדים דרך ה-ECM לאתר הפצע (סרט משלים 1). כל הממצאים הללו מצביעים על כך שקליטיה היא מערכת מודל שימושית לחקר ריפוי פצעי אפיתל. ואכן, קלות ההדמיה של תאי אפיתל בקליטיה במהלך ריפוי פצעים הובילה לגילוי כי למליפודיה של תאי אפיתל מתרחבת ומתפשטת על פני אזורים של ECM חשוף כל עוד יש קרום מרתף שלם; אם קרום המרתף ניזוק, ריפוי אפיתל עובר למנגנון מיתרי ארנק40. זו הייתה ההדגמה הראשונה של מנגנון העומד בבסיס ההחלטה לסגור על ידי זחילה מבוססת למליפודיה לעומת סגירת חוט ארנק, תוך הדגשת החשיבות של אינטראקציות ספציפיות בין תאים ל-ECM בריפוי ובהתבוננות בתאים בהקשר הטבעי שלהם.
להלן מתוארים פרוטוקולים ליצירה והדמיה של מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעים קטנים שנסגרים בעיקר על-ידי התפשטות תאים, ופצעים גדולים שדורשים נדידת תאים קולקטיבית כדי להיסגר. יתר על כן, מתואר פרוטוקול להחדרת מולקולות קטנות לתאי ECM ואפיתל, המאפשר הפרעות ניסיוניות של מסלולי בקרה משוערים של ריפוי פצעים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

כל איברי בעלי החיים, מהעור, דרך העיניים ועד המעיים, מכוסים ביריעות של תאי אפיתל המאפשרים להם לשמור על הומאוסטזיס תוך הגנה עליהם מפני זיהום. לכן, אין זה מפתיע כי היכולת לתקן פצעים אפיתל הוא קריטי לכל metazoans. ריפוי פצעי אפיתל בבעלי חוליות כרוך בתהליכים חופפים, כולל תגובות דלקתיות, וסקולריזציה ואפיתל מחדש. ויסות תהליכים אלה כרוך באינטראקציות מורכבות בין תאי אפיתל, תאים שכנים והמטריצה החוץ תאית (ECM); ה-ECM מכיל חלבונים מבניים, חלבוני בקרה ומולקולות קטנות פעילות. מורכבות זו, יחד עם העובדה שלרוב בעלי החיים יש רקמות אטומות ואק"מ בלתי נגיש, מקשה על ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים. עבודה רבה על ריפוי פצעי אפיתל מתבצעת אפוא במערכות תרבית רקמה, עם סוג תא אפיתל יחיד מצופה כשכבה אחת על מטריצה מלאכותית. Clytia hemisphaerica (Clytia ) מספק השלמה ייחודית ומרגשת למחקרים אלה, ומאפשר ריפוי פצע אפיתל להיחקר בחיה שלמה עם ECM אותנטי. אפיתל אקטודרמלי של Clytia הוא שכבה אחת של תאי אפיתל קשקשיים גדולים, המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ ניגוד מפריע דיפרנציאלי (DIC) בבעלי חיים חיים. היעדר פיברובלסטים נודדים, כלי דם או תגובות דלקתיות מאפשר לנתח את האירועים הקריטיים באפיתל מחדש in vivo. ניתן לנתח ריפוי של סוגים שונים של פצעים, כולל מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעי אפיתל קטנים וגדולים ופצעים הפוגעים בקרום המרתף. במערכת זו ניתן לראות היווצרות למליפודיה, התכווצות מיתרי ארנק, מתיחת תאים ונדידת תאים קולקטיבית. יתר על כן, סוכנים פרמקולוגיים ניתן להציג באמצעות ECM כדי לשנות אינטראקציות תא:ECM ותהליכים תאיים in vivo. עבודה זו מציגה שיטות ליצירת פצעים בקליטיה חיה, לכידת סרטי ריפוי, וחקירת מנגנוני ריפוי על ידי מיקרו-הזרקת ריאגנטים לתוך ECM.

בהתאם לפרוטוקולים לעיל, צולמו מיקרו-פצעים חד-תאיים, פצעים קטנים ופצעים גדולים. ערימות רשומות של קובצי תמונה נשמרו כקובצי .avi.
בסרט 1 אפשר לראות מיקרו-פצעים נסגרים בין התאים ובתוכם (איור 1 ואיור 2). Lamellipodia קטנים נצפים במהלך הסגירה, ואחריו התכווצות וריפוי. פסולת נשללת ומשוחררת למים. הריפוי מסתיים תוך דקה או פחות.
בסרטים 2 ו-3, פצעים קטנים בצורות שונות נרפאים באמצעות היווצרות למליפודיה, הרחבה של מגעים למליפודיאליים והתפשטות תאים בשולי הפצע, כפי שתואר קודם לכן40 (איור 1 ואיור 2). תאים בשכבות מאחורי תאי השוליים אינם משתתפים בריפוי פצעים בגודל כזה וגם אין נדידת תאים קולקטיבית. סגירה מהירה ומתקדמת של פערי אפיתל מלווה בהתכווצות רקמות לאורך תפר הפצע החדש שנוצר40. קצב הריפוי המנורמל של שני הפצעים האלה, המתבטא כאחוז מהשטח המקורי לאורך זמן, מוצג (איור 4C,D). בעוד שקיימת שונות מסוימת בדינמיקה של סגירת פצעים, ממוצע אחוזי סגירת השטח לאורך זמן עבור 14 פצעים בצורות שונות בטווח של 0.02-0.125 מ"מ2 מאפשר לבסס עקומה ממוצעת לריפוי פצעים בחיות שלא טופלו (איור 4E).
נזק לקרום המרתף נראה בבירור כאשר הוא מתרחש (איור 2). בסרט 4, תאים בשולי פצע קטן שבו יש נזק לקרום המרתף מתפשטים סביב האזור הפגוע, וסגירת הפער מסתיימת עם כיווץ חוט ארנק.
אם הרקמה מיובשת או פגומה מכדי לתקן, תנועות התאים יכולות להיפסק, או שכל גיליון התאים יכול להתפוצץ (סרט 5 וסרט 6). זה קורה בדרך כלל לאחר תקופות ארוכות של הדמיה (45 דקות או יותר). אם התפוצצות התא מתרחשת בשלב מוקדם של ההדמיה, הדגימה מושלכת.
כפי שניתן לראות בסרט 7, פצעים גדולים מחלימים בכמה שלבים. ראשית, קצה הפצע הופך חלק וסדיר עקב התכווצויות בשוליים, כפי שדווח קודם לכן57. לאחר מכן, נראה כי למליפודיה נוצרת מהתאים בשולי הפצע, כאשר למליפודיה נעה קדימה כדי למקסם את המגע עם למליפודיה סמוכה. מעקב אחר הגרעינים בתאים בשולי הפצע ובכמה שכבות מאחורי תאי השוליים מראה כי פערים גדולים נסגרים על ידי נדידת תאים קולקטיבית40. תאים לעולם אינם מתנתקים אלא נעים יחד כגיליון.
הכנסת צבעים וחומרים פרמקולוגיים יכולה להיות כלי רב עוצמה לניתוח מנגנונים ביולוגיים. חומרים רבים אינם נכללים בקליטיה (לא מוצג), כנראה בגלל שכבת הריר שמצפה את פני השטח של החיה. עם זאת, ניתן להשתמש במיקרו-הזרקה כדי להחדיר מולקולות ישירות לתוך ה-ECM, לשבש את מבנה ה-ECM או להפריע לפעילות הרגולטורית ב-ECM. בנוסף, צבעים ומולקולות אחרות מסוגלים להיכנס לתאי אפיתל מהצד הבסיסי. לדוגמה, איור 6 מראה צביעה גרעינית עם Hoechst, צביעת קרום עם FM1-43, ועיכוב של היווצרות למליפודיה על-ידי ציטוכלסין B לאחר שהריאגנטים האלה מוזרקים במיקרו לתוך ה-ECM. החדרת מולקולות אלה לתאי ה-ECM והאפיתל לפני הפציעה מאפשרת ניסויים הבודקים את השפעת הכלים הפרמקולוגיים על תהליך הריפוי.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> איור 6: תאי אפיתל של מדוזה לאחר מיקרו-הזרקה של צבעים או חומרים פרמקולוגיים. (A ) תאי אפיתל מוצגים בלוח העליון 5 דקות לאחר ההזרקה עם 20 μM Hoechst (גרעינים) ו-50 μM FM1-43 (ממברנות). (ב,ג) ריפוי פצעים לאחר הזרקה עם בקרת DMSO בקנ "מ 1:1,000 (B) או 100 מיקרומטר ציטוכלסין B (C). פצעים נעשו 15 דקות לאחר ההזרקה. התמונות צולמו 5 דקות לאחר הפציעה. היווצרות של lamellipodia מעוכב על ידי cytochalasin B. ה"סיבים" הנראים לעתים קרובות בין תאים באזור הפצע הם ככל הנראה תוצאה של מתח המותח את קרום המרתף - הם אינם מכתימים בפלואידין (לא מוצג). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט 1: סרט קיטועי זמן של ריפוי מיקרו-פצעים בתא יחיד. הזמן שחלף: 20 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 2: סרט קיטועי זמן של ריפוי פצע אפיתל קטן. זמן שחלף: 9 דקות 54 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 3: סרט קיטועי זמן של ריפוי פצע אפיתל קטן. פצע זה גדול יותר וצורתו אינה סדירה יותר מהפצע בסרט 2. זמן שחלף: 20 דקות 54 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 4: סרט קיטועי זמן של פצע קטן ומיקרו-פצע המרפא עם קרע בקרום המרתף. Lamellipodia התפשט סביב קרע קרום המרתף, אם כי הם יכולים להתקדם על פני שאר ECM. ברגע שהאזור של הפצע עם הנזק לקרום המרתף מוקף, התכווצות חוט ארנק מושכת תאים מעל האזור. זמן שחלף: 19 דקות 4 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 5: תאים גוססים בפצע אפיתל קטן. מוות תאי נגרם ככל הנראה כתוצאה מהתייבשות החיה. זמן שחלף: 4 דקות 24 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 6: פצע אפיתל קטן לא מצליח להשלים את הריפוי. זמן שחלף: 42 דקות 32 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 7: ריפוי פצע אפיתל גדול. זמן שחלף: 25 דקות 29 שניות. קצב פריימים: 10 פריימים לשנייה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
איור משלים 1: סכמות ממד מיכל קליטיה. הדמיה תלת מימדית של מיכלי Clytia בהתאמה אישית. (A) מבט מלפנים ומאחור. (B) מבט מהצד. החיתוך ביצירה המוצגת בירוק מכוסה ברשת ניילון. מים נכנסים למיכל ישירות מעל הרשת, סוחפים את הרשת ויוצרים זרם מעגלי. מים יוצאים מהמערכת דרך החור בחלק הסופי המוצג בכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
סרט משלים 1: מטריצה חוץ-תאית אצלולרית בקליטיה. Z-stack של Clytia נלקח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. המחסנית מתמקדת תחילה באקסמטריה ולאחר מכן סורקת כל 10 מיקרומטר דרך ה-ECM אל אנדודרם הצלחת ותת-המטריה. תמונות המשתמשות ב-DIC (משמאל) ובצביעה גרעינית Hoechst (מימין) מדגימות את המחסור בתאים ב-ECM. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.

אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של תאי אפיתל במהלך ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים. זה מאפשר לנו לראות איך תאים מתנהגים בסביבה הטבעית המורכבת שלהם. טכניקה זו מציגה ריאגנטים לתוך המטריצה החוץ תאית וציטופלסמה התא כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים אלה על התפשטות תאים ונדידה במהלך ריפוי פצעים בבעלי חיים חיים.ריפוי פצעי אפיתל וקליטיה דומה להפליא לריפוי בבעלי חיים מורכבים יותר. לכן, אנו יכולים ללמוד הרבה ממערכת זו על מנגנוני ריפוי הפצעים וכיצד הם נוצרו. מי שידגימו את הנהלים הללו יהיו אליזבת לי, וטכנאית המחקר אמילי וואטו.כדי להתחיל את תהליך הפציעה, להכין פיפטה העברה שונה על ידי חיתוך קצה פיפטה עם מספריים, יצירת פתח מוגדל בגודל של 0.5 עד 0.7 ס"מ קוטר. באמצעות פיפטת ההעברה המתוקנת, מניחים את המדוזה שנאספה ממושבות הפוליפ המבוססות על מגלשת שקע, כאשר מטריית מדוזה X פונה כלפי מעלה. ודא כי מספיק של מי ים מלאכותיים, או ASW, מכסה את החיה.כדי ליצור מיקרו פצעים בתוך ובין תאים, הניחו כיסוי מעל החיה. החלקת הכיסוי דוחסת את המזוגליאה, והריבאונד של הרקמה הדחוסה מאלץ את התאים להתרחק מעט. דמיינו את החיה מיד כדי להתבונן בפצעי המיקרו שנוצרו.כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים, הניחו את המדוזה על מגלשת דיכאון כאשר מטריית מדוזה X פונה כלפי מעלה, באמצעות פיפטת העברה שונה, כפי שהודגם קודם לכן. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, מגרדים בעדינות את פני השטח של המדוזה. גירוד עדין עלול ליצור קרעים בקרום המרתף.כסו את בעל החיים בפתק כיסוי להדמיה. הנחת הכיסוי מספיקה לעיתים כדי ליצור פצעי אפיתל קטנים גם ללא שריטה. הכינו מחט מיקרו-הזרקה, באמצעות עמוד מיקרו פיפטה וצינור נימי זכוכית, בהתאם לשלבים המתוארים בטקסט.הכניסו את מחט המיקרו-הזרקה הריקה למחזיק מיקרו-הזרקה המודבק למיקרו-מניפולטור וחתכו את קצה המחט, כך שהפתח יהיה בגודל של כ-20 עד 40 מיקרון. הגדר את לחץ האחיזה על המזרק הזעיר לאפס, ואת לחץ הפליטה לכ -20 פאונד לאינץ 'מרובע. הגדר את המיקרו-מזרק כך שיספק פולס אוויר של שתי שניות.כדי ליצור פצעי אפיתל גדולים, הניחו את המדוזה על מגלשת דיכאון, כפי שהודגם קודם. באמצעות מניפולטור מיקרו, להתאים את קצה מחט מיקרו הזרקה להישאר ממש מעל המים, על ידי טבילה בזהירות את הקצה לתוך המים, ולאחר מכן למשוך אותו כך שהוא קרוב למשטח האפיתל של המדוזה. דופק אוויר על ידי לחיצה על התחל על המזרק.חזור על הדופק באותה נקודה פעמיים עד ארבע פעמים, בהתאם לרוחב הקצה. טיפים גדולים יותר דורשים פחות פולסים. כסו את בעל החיים הפצוע בתלוש כיסוי להדמיית פצעים גדולים.כוונן את המוקד למטריית x. תאים משושים צריכים להיות ברורים. זהה פצע באופן ידני כדי לדמות אותו.הפעל תוכנית שאוספת תמונות כסרט בזמן אמת, או תוכנית שאוספת סידרה של תמונות במרווחי זמן קבועים. עקוב אחר ההתקדמות כדי לוודא שאזור הפצע אינו נסחף אל מחוץ לשדה הראייה, ושהתאים המעניינים נשארים ממוקדים. להזרקת צבעים ותרופות, הכינו מחט מיקרו-הזרקה בהתאם לשלבים המתוארים בטקסט.מלאו את מחט המיקרו-הזרקה בעזרת קצה פיפטה ארוך עם נפח עודף של צבע או תרופה להזרקה למדוזה. בעזרת פיפטת העברה שעברה שינוי, הניחו מדוזה עם תת-מטריה הפונה כלפי מעלה לתוך פולידימתילסילוקסן, או צלחת הזרקת PDMS, עם מספיק ASW כדי לכסות את החיה. מניחים את המנה על במה של מיקרוסקופ מנתח.התמקדו בקצה מחט המיקרו-הזרקה, וקדמו אותה למים ליד המדוזה. עם מניפולטור מיקרו, לחץ על המחט לתוך הצלחת עד שהיא מתכופפת ונשברת. יצירת פתח חוד של כ-10 עד 20 מיקרון.באמצעות מניפולטור מיקרו, להחדיר את קצה המחט דרך מטריית המשנה לתוך mesoglea מבלי לנקב את מטריית X. במיקרו-מזרק, הגדר את לחץ האחיזה לאפס, ולחץ ההזרקה מתחת או שווה ל -20 פאונד לאינץ 'מרובע. יש להזריק לרביע אחד או שניים, ולמלא כל אחד מהם בכתם צבע או סם בערך רבע משטחו של אותו רביע.תלוי איזה צבע או סם מוזרקים, בעלי חיים מוכנסים לתוך של ASW טרי כדי לאפשר צבע או פיזור סמים ודגירה. להדמיה, הרכיבו את המדוזה על מגלשת שקע באמצעות פיפטת העברה שונה, והציבו את החיה עם מטריית X הפונה כלפי מעלה. בעלי חיים יכולים להיפצע בשלב זה כדי לבחון את ההשפעה של מגיב מוזרק.פצעי המיקרו בתוך ובין התאים יצרו למליפודיה קטנה במהלך סגירת הפצע. לאחר מכן הגיע התכווצות, והפצעים החלימו תוך פחות מדקה. פצעי האפיתל הקטנים נרפאו גם באמצעות היווצרות למליפודיה והרחבה של מגעי למליפודיה.סגירת פצע מהירה ומתקדמת קדמה להתכווצות הרקמה לאורך תפר הפצע שזה עתה נוצר. שיעור הריפוי המנורמל של שני פצעים קטנים המתבטא כאחוז משטח הפצע הכולל לאורך זמן הצביע על שונות מסוימת בדינמיקה של סגירת הפצע. נתונים מ-14 פצעים שונים שימשו לקביעת עקומת ריפוי פצעים ממוצעת בבעלי חיים שלא טופלו.בפצע קטן עם נזק לקרום המרתף, תאי השוליים התפזרו סביב האזור הפגוע, והפער נסגר בהתכווצות חוט ארנק. כאשר הרקמה הייתה מיובשת או פגומה מכדי לתקן, תנועות התאים יכלו להיפסק, או שכל יריעת התאים יכלה להתפוצץ. פצעים גדולים נרפאו בכמה שלבים.החלקת הקצה בעקבות התכווצויות בשוליים, היווצרות למליפודיה והארכת הלמליפודיה מגעים עם נדידת תאים קולקטיבית בשוליים ובמרחק של מספר שכבות תאים מהם, סגרו פערים גדולים. צביעת הגרעין והממברנה הושגו על ידי הזרקה זעירה של הריאגנטים לתוך ECM. מיקרו-הזרקה של ציטוכלסין B עיכבה היווצרות למליפודיה לאחר הפציעה.טפלו בבעלי החיים בעדינות. בעת הזרקת ריאגנטים, ודא שקצה מחט המיקרו-הזרקה נמצא במזוגליאה, ולא עבר את כל הדרך דרך החיה. כיום, בעלי חיים טרנסגניים מיוצרים עם חלבוני תג פלואורסצנטי, בשילוב פלואורסצנטיות ומיקרוסקופ ניגודיות מפריע דיפרנציאלי ייתן תמונה ברורה עוד יותר של האירועים התאיים בריפוי פצעי אפיתל.

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: אורגניזם מודל לחקר פתוגנזה חיידקית - ראיון

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...