Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

ई.ई.एल.एल. को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पीआरएफबी 2011010 से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम अपनी क्लिटिया कॉलोनियों को स्थापित करने में हमारी मदद करने के लिए त्सुयोशी मोमोसे और एवलिन हौलिस्टन को धन्यवाद देना चाहते हैं, जीन-बैपटिस्ट रेनियर को माइक्रोवाउंड उपचार छवियों के संग्रह के लिए, हैरी किरियाज़ेस को छद्म-क्रीसेल टैंक ों के निर्माण के लिए, और एलिजाबेथ बाल्डो को क्लिटिया निवास स्थान को बनाए रखने के लिए। चित्र 1B BioRender.com के साथ बनाया गया था।

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं।

यहां, क्लिटिया में विवो में इमेजिंग घावों के लिए कार्यप्रणाली प्रस्तुत की गई है, जो एक अपेक्षाकृत नया अकशेरुकी मॉडल जीव40,43,58 है। ऐसे कई कारक हैं जो इस प्रणाली को एक अद्वितीय और शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण बनाते हैं, जो घाव भरने और पुन: उपकलाकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य मॉडलों से अलग हैं। सबसे पहले, मोनोलेयर एपिथेलियम एक पारदर्शी ईसीएम से जुड़ा होता है, इसलिए इन विट्रो ऊतक संस्कृति परख (चित्रा 1, चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) जैसा दिखता है। जैसा कि इन विट्रो परख ों में, कोशिकाओं को उच्च रिज़ॉल्यूशन पर चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, ऊतक संस्कृति के विपरीत, एक प्रामाणिक सेलुलर वातावरण और ईसीएम है, ताकि घाव भरने को एक जीवित घायल जानवर में होने वाली जटिल सिग्नलिंग घटनाओं के संदर्भ में देखा जा सके। दूसरा, क्लिटिया में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, प्रवासी फाइब्रोब्लास्ट, वाहिका और रक्त की कमी होती है। यह घाव भरने के दौरान अधिक जटिल वयस्क जानवरों में होने वाली अतिव्यापी घटनाओं की अनुपस्थिति में विवो में पुन: उपकलाकरण प्रक्रिया काअध्ययन करने की अनुमति देता है। तीसरा, ईसीएम एककोशिकीय (पूरक मूवी 1) और बड़ा है, जो माइक्रोइंजेक्शन सुई (चित्रा 5 और चित्रा 6) के साथ आसान पहुंच की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, शोधकर्ता औषधीय अभिकर्मकों के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं जो विवो में घाव भरने पर ईसीएम संरचना या सिग्नलिंग को परेशान करते हैं। अभिकर्मकों को उपकला कोशिकाओं में भी पेश किया जा सकता है, और विवो घाव भरने में उनके प्रभाव का आकलन किया जा सकता है। चौथा, ऐसे प्रोटोकॉल हैं जो क्लिटिया प्रणाली 42,43,44,45 में उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक जानवरों को बनाने के लिए मौजूद हैं। विवो में घाव भरने को इसलिए जानवरों में रुचि के जीन की बढ़ी हुई / कम अभिव्यक्ति के साथ देखा जा सकता है।
इस तकनीक में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना आवश्यक है जो डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए सही ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है क्योंकि सपाट, पारदर्शी उपकला कोशिकाएं मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ लगभग अदृश्य हैं। जानवरों को धीरे से घाव करने के लिए कौशल विकसित करना भी महत्वपूर्ण है ताकि ईसीएम को प्रभावित किए बिना उपकला क्षतिग्रस्त हो जाए। ईसीएम में माइक्रोइंजेक्टिंग सामग्री के लिए एक समान सौम्य स्पर्श आवश्यक है, क्योंकि इंजेक्शन के दौरान जानवर को व्यापक नुकसान घाव भरने के बाद के विश्लेषण से समझौता कर सकता है। जबकि इन तकनीकों के लिए एक सीखने की अवस्था है, यहां तक कि शुरुआती छात्रों ने उन्हें मलामी प्रयोगशाला में जल्दी से महारत हासिल की है। दरअसल, इन प्रोटोकॉल का उपयोग शिकागो विश्वविद्यालय में स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में सेल माइग्रेशन का प्रदर्शन करने के लिए किया गया है।
इष्टतम इमेजिंग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि जानवर हिलता नहीं है और चुना हुआ घाव क्षेत्र दृश्य के क्षेत्र से बाहर नहीं निकलता है। यदि जानवर स्पंदन कर रहे हैं, तो वर्णित ट्राइकेन के साथ उपचार बहुत प्रभावी है। बहने के लिए, नमूने को मैन्युअल रूप से पुनर्स्थापित करना अक्सर आवश्यक होता है। इन आंदोलनों को फिजी / इमेजजे में पंजीकरण फ़ंक्शन का उपयोग करके अंतिम फिल्म से हटाया जा सकता है।
इस प्रणाली के साथ एक सीमा यह है कि समान घाव बनाना संभव नहीं है, क्योंकि घाव यहां वर्णित तरीकों का उपयोग करके आकार और आकार दोनों में भिन्न होते हैं। इसलिए, घाव बंद होने या सेल माइग्रेशन की सटीक दर की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है। कार्बन अनाज जैसे स्थितिगत मार्कर एक घायल जानवर में उजागर ईसीएम से चिपक जाते हैं और बड़े घावों में सामूहिक सेल प्रवास की दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (दिखाया नहीं गया)। छोटे घाव बंद करने के विश्लेषण के लिए, यहां तक कि परिवर्तनीय घाव के आकार और आकार के साथ, इस आकार के घावों के बीच बंद होने की दरों की एक सीमित सीमा है (चित्रा 4)। इसलिए मात्रात्मक रूप से प्रोत्साहक या दमनकारी औषधीय अभिकर्मकों के प्रभावों का पता लगाना संभव है।
जबकि यह काम केवल डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके घाव भरने के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है, उसी दृष्टिकोण का उपयोग प्रतिदीप्ति या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपचार की छवि बनाने के लिए किया जा सकता है। इसमें सहायता के लिए, ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल हैं जिसमें विभिन्न सेलुलर और बाह्य प्रोटीन फ्लोरोसेंटली लेबल किए जाते हैं। डीआईसी और प्रतिदीप्ति के साथ समवर्ती इमेजिंग, औषधीय एजेंटों या उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग करके घाव भरने की गड़बड़ी के साथ संयुक्त, उपकला में घाव भरने की प्रक्रिया को कम करने वाले तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण होगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

त्वचा से आंखों और आंतों तक सभी जानवरों के अंग, उपकला कोशिकाओं की चादरों से ढके होते हैं जो उन्हें संक्रमण से बचाते हुए होमियोस्टैसिस को बनाए रखने की अनुमति देते हैं। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि उपकला घावों की मरम्मत करने की क्षमता सभी मेटाज़ोन्स के लिए महत्वपूर्ण है। कशेरुक में उपकला घाव भरने में अतिव्यापी प्रक्रियाएं शामिल हैं, जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रियाएं, वैस्कुलराइजेशन और पुन: उपकलाकरण शामिल हैं। इन प्रक्रियाओं के विनियमन में उपकला कोशिकाओं, पड़ोसी कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच जटिल बातचीत शामिल है; ईसीएम में संरचनात्मक प्रोटीन, नियामक प्रोटीन और सक्रिय छोटे अणु होते हैं। यह जटिलता, इस तथ्य के साथ कि अधिकांश जानवरों में अपारदर्शी ऊतक और दुर्गम ईसीएम होते हैं, जीवित जानवरों में घाव भरने का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। उपकला घाव भरने पर बहुत काम इसलिए ऊतक संस्कृति प्रणालियों में किया जाता है, जिसमें एक कृत्रिम मैट्रिक्स पर एक मोनोलेयर के रूप में एक एकल उपकला कोशिका-प्रकार चढ़ाया जाता है। क्लिटिया हेमिसफेरिका (क्लिटिया) इन अध्ययनों के लिए एक अद्वितीय और रोमांचक पूरक प्रदान करता है, जिससे उपकला घाव भरने को एक प्रामाणिक ईसीएम के साथ एक बरकरार जानवर में अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। क्लिटिया का एक्टोडर्मल एपिथेलियम बड़े स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत है, जो जीवित जानवरों में अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देता है। प्रवासी फाइब्रोब्लास्ट्स, वास्कुलचर या भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की अनुपस्थिति विवो में पुन: उपकलाकरण में महत्वपूर्ण घटनाओं को विच्छेदित करना संभव बनाती है। विभिन्न प्रकार के घावों के उपचार का विश्लेषण किया जा सकता है, जिसमें एकल-कोशिका माइक्रोघाव, छोटे और बड़े उपकला घाव और घाव शामिल हैं जो तहखाने की झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं। लैमेलिपोडिया गठन, पर्स स्ट्रिंग संकुचन, सेल स्ट्रेचिंग और सामूहिक सेल माइग्रेशन सभी इस प्रणाली में देखे जा सकते हैं। इसके अलावा, विवो में सेल: ईसीएम इंटरैक्शन और सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित करने के लिए ईसीएम के माध्यम से औषधीय एजेंटों को पेश किया जा सकता है। यह काम लाइव क्लिटिया में घाव बनाने, उपचार की फिल्मों को कैप्चर करने और ईसीएम में अभिकर्मकों को माइक्रोइंजेक्ट करके उपचार तंत्र की जांच करने के तरीकों को दिखाता है।

उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एकल-कोशिका माइक्रोघाव, छोटे घाव और बड़े घावों की छवि बनाई गई थी। छवि फ़ाइलों के पंजीकृत ढेर .avi फ़ाइलों के रूप में सहेजे गए थे।
मूवी 1 में, माइक्रोवाउंड को कोशिकाओं के बीच और भीतर बंद होते देखा जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2)। बंद होने के दौरान छोटे लैमेलिपोडिया देखे जाते हैं, इसके बाद संकुचन और उपचार होता है। मलबे को बाहर रखा जाता है और पानी में छोड़ दिया जाता है। उपचार एक मिनट या उससे कम समय में पूरा हो जाता है।
मूवी 2 और 3 में, विभिन्न आकृतियों के छोटे घाव लैमेलिपोडिया के गठन, लैमेलिपोडियाल संपर्कों के विस्तार और घाव मार्जिन पर कोशिकाओं के प्रसार के माध्यम से ठीक हो जाते हैं, जैसा कि पहले वर्णित40 (चित्रा 1 और चित्रा 2)। सीमांत कोशिकाओं के पीछे स्तरों में कोशिकाएं इस आकार के घावों के उपचार में भाग नहीं लेती हैं और न ही सामूहिक सेल माइग्रेशन होता है। उपकला अंतराल के तेजी से और प्रगतिशील बंद होने के बाद नवगठित घाव सीम40 के साथ ऊतक संकुचन होता है। समय के साथ मूल क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त इन दो घावों के उपचार की सामान्यीकृत दर दिखाई गई है (चित्रा 4 सी, डी)। जबकि घाव बंद होने की गतिशीलता में कुछ परिवर्तनशीलता है, 0.02-0.125 मिमी2 से लेकर विभिन्न आकारों के 14 घावों के लिए समय के साथ प्रतिशत क्षेत्र बंद होने का औसत अनुपचारित जानवरों में घाव भरने के लिए एक औसत वक्र की स्थापना की अनुमति देता है (चित्रा 4 ई)।
तहखाने की झिल्ली को नुकसान स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब यह होता है (चित्रा 2)। मूवी 4 में, एक छोटे से घाव के मार्जिन पर कोशिकाएं जिसमें क्षतिग्रस्त क्षेत्र के चारों ओर तहखाने की झिल्ली की क्षति फैली हुई है, और गैप क्लोजर एक पर्स स्ट्रिंग संकुचन के साथ पूरा होता है।
यदि ऊतक निर्जलित है या मरम्मत के लिए बहुत क्षतिग्रस्त है, तो सेल आंदोलन बंद हो सकते हैं, या कोशिकाओं की पूरी शीट फट सकती है (मूवी 5 और मूवी 6)। यह आमतौर पर इमेजिंग की लंबी अवधि (45 मिनट या उससे अधिक) के बाद होता है। यदि इमेजिंग में सेल फटना जल्दी होता है, तो नमूना छोड़ दिया जाता है।
जैसा कि मूवी 7 में दिखाया गया है, बड़े घाव कई चरणों में ठीक हो जाते हैं। सबसे पहले, मार्जिन पर संकुचन के कारण घाव का किनारा चिकना और नियमित हो जाता है, जैसा किपहले बताया गया था। फिर, लैमेलिपोडिया को घाव के मार्जिन पर कोशिकाओं से बनते देखा जाता है, जिसमें लैमेलिपोडिया आसन्न लैमेलिपोडिया के साथ संपर्क को अधिकतम करने के लिए आगे बढ़ता है। घाव मार्जिन पर कोशिकाओं में नाभिक की ट्रैकिंग और सीमांत कोशिकाओं के पीछे कई स्तरों से पता चलता है कि सामूहिक सेल माइग्रेशन40 द्वारा बड़े अंतराल बंद हो जाते हैं। कोशिकाएं कभी अलग नहीं होती हैं, लेकिन एक शीट के रूप में एक साथ चलती हैं।
रंगों और औषधीय एजेंटों की शुरूआत जैविक तंत्र के विच्छेदन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है। कई पदार्थों को क्लिटिया (नहीं दिखाया गया) से बाहर रखा गया है, संभवतः बलगम परत के कारण जो जानवर की सतह को कोट करता है। हालांकि, माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग ईसीएम में अणुओं को सीधे पेश करने, ईसीएम संरचना को बाधित करने या ईसीएम में नियामक गतिविधियों को परेशान करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रंजक और अन्य अणु बेसल साइड से उपकला कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, चित्र 6 में होचस्ट के साथ परमाणु धुंधलापन, एफएम 1-43 के साथ झिल्ली धुंधला होना, और इन अभिकर्मकों को ईसीएम में माइक्रोइंजेक्ट किए जाने के बाद साइटोक्लासिन बी द्वारा लैमेलिपोडिया गठन का निषेध दिखाया गया है। घायल होने से पहले ईसीएम और उपकला कोशिकाओं में इन अणुओं का परिचय उन प्रयोगों की अनुमति देता है जो उपचार प्रक्रिया पर औषधीय उपकरणों के प्रभाव का परीक्षण करते हैं।
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> चित्रा 6: रंजक या औषधीय एजेंटों के माइक्रोइंजेक्शन के बाद मेडुसा की उपकला कोशिकाएं। (ए ) उपकला कोशिकाओं को 20 μM Hoechst (नाभिक) और 50 μM FM1-43 (झिल्ली) के साथ इंजेक्शन के 5 मिनट बाद शीर्ष पैनल में दिखाया गया। (बी, सी) 1: 1,000 डीएमएसओ नियंत्रण ( बी ) या 100 μM Cytochalasin B (C) के साथ इंजेक्शन के बाद घाव भरने। इंजेक्शन के 15 मिनट बाद घाव किए गए थे। चित्र घायल होने के 5 मिनट बाद लिए गए थे। लैमेलिपोडिया का गठन साइटोक्लासिन बी द्वारा बाधित होता है। घाव क्षेत्र में कोशिकाओं के बीच अक्सर देखे जाने वाले स्पष्ट "फाइबर" को तहखाने की झिल्ली को फैलाने वाले तनाव का परिणाम माना जाता है - वे फैलोइडिन के साथ दाग नहीं करते हैं (दिखाया नहीं गया है)। स्केल सलाखों: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
मूवी 1: सिंगल सेल माइक्रोवाउंड हीलिंग की टाइम-लैप्स फिल्म। समय बीत गया: 20 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
मूवी 2: एक छोटे उपकला घाव भरने की टाइम-लैप्स फिल्म। समय बीत गया: 9 मिनट 54 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
मूवी 3: एक छोटे से उपकला घाव भरने की टाइम-लैप्स फिल्म। यह घाव मूवी 2 में घाव की तुलना में बड़ा और अधिक अनियमित आकार का है। समय बीत गया: 20 मिनट 54 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
मूवी 4: एक छोटे से घाव की टाइम-लैप्स फिल्म और एक तहखाने की झिल्ली के आंसू के साथ एक माइक्रोवंड उपचार। लैमेलिपोडिया तहखाने की झिल्ली के चारों ओर फैल गया, हालांकि वे ईसीएम के बाकी हिस्सों पर आगे बढ़ सकते हैं। एक बार जब तहखाने की झिल्ली की क्षति के साथ घाव का क्षेत्र घिरा हुआ है, तो एक पर्स स्ट्रिंग संकुचन क्षेत्र पर कोशिकाओं को खींचता है। समय बीत गया: 19 मिनट 4 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
फिल्म 5: एक छोटे उपकला घाव में कोशिकाएं मर रही हैं। पशु के निर्जलीकरण के कारण कोशिका मृत्यु की संभावना है। समय बीत गया: 4 मिनट 24 सेकंड फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
फिल्म 6: एक छोटा उपकला घाव उपचार को पूरा करने में विफल रहता है। समय बीत गया: 42 मिनट 32 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
फिल्म 7: बड़े उपकला घाव उपचार। समय बीत गया: 25 मिनट 29 सेकंड। फ्रेम दर: 10 एफपीएस। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
पूरक चित्र 1: क्लिटिया टैंक आयाम योजनाबद्ध। कस्टम-निर्मित क्लिटिया टैंक का 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन। (ए) सामने और पीछे का दृश्य। (बी) साइड व्यू। हरे रंग में दिखाए गए टुकड़े में कट-आउट नायलॉन जाल से ढका हुआ है। पानी जाल के ऊपर सीधे टैंक में प्रवेश करता है, जाल पर झाड़ू लगाता है और एक गोलाकार प्रवाह बनाता है। नीले रंग में दिखाए गए अंतिम टुकड़े में छेद के माध्यम से पानी सिस्टम से बाहर निकलता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
पूरक मूवी 1: क्लिटिया में एककोशिकीय बाह्य मैट्रिक्स। क्लिटिया का जेड-स्टैक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लिया गया। स्टैक शुरू में एक्सअम्ब्रेला पर केंद्रित होता है और फिर ईसीएम के माध्यम से प्लेट एंडोडर्म और सबअम्ब्रेला में हर 10 μm स्कैन करता है। डीआईसी (बाएं) और होचस्ट परमाणु धुंधला (दाएं) का उपयोग करने वाली छवियां ईसीएम में कोशिकाओं की कमी को प्रदर्शित करती हैं। स्केल बार: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

यह पेपर एक जीवित क्लिटिया हेमिसफेरिका मेडुसा के उपकला में घाव बनाने और विवो में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर छवि घाव भरने की एक विधि का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, घाव भरने के दौरान उपकला कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स में सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को परेशान करने के लिए रंजक और दवाओं को पेश करने की एक तकनीक प्रस्तुत की गई है।

सीनिडेरियन मॉडल जीव क्लिटिया हेमिसफेरिका का उपयोग करके विवो में उपकला घाव भरने की विशेषता

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

यह प्रोटोकॉल जीवित जानवरों में घाव भरने के दौरान उपकला कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यह हमें यह देखने की अनुमति देता है कि कोशिकाएं अपने प्राकृतिक जटिल वातावरण में कैसे व्यवहार करती हैं। यह तकनीक जीवित जानवरों में घाव भरने के दौरान सेल प्रसार और प्रवास पर इन अभिकर्मकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स और सेल साइटोप्लाज्म में अभिकर्मकों का परिचय देती है।उपकला घाव भरने और क्लिटिया उल्लेखनीय रूप से अधिक जटिल जानवरों में उपचार जैसा दिखता है। इसलिए, हम घाव भरने के तंत्र के बारे में इस प्रणाली से बहुत कुछ सीख सकते हैं और उनकी उत्पत्ति कैसे हुई। इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन एलिजाबेथ ली, और अनुसंधान तकनीशियन एमिली वाट्टो होंगे।घायल होने की प्रक्रिया शुरू करने के लिए, कैंची के साथ पिपेट टिप को काटकर एक संशोधित ट्रांसफर पिपेट तैयार करें, जिससे व्यास में लगभग 0.5 से 0.7 सेंटीमीटर का एक बढ़ा हुआ उद्घाटन बनाया जा सके। संशोधित स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, स्थापित पॉलीप कॉलोनियों से एकत्र किए गए मेडुसा को एक अवसाद स्लाइड पर रखें, जिसमें मेडुसा एक्स छतरी ऊपर की ओर है। सुनिश्चित करें कि कृत्रिम समुद्री जल, या एएसडब्ल्यू का पर्याप्त हिस्सा, जानवर को कवर करता है।कोशिकाओं के भीतर और बीच सूक्ष्म घाव बनाने के लिए, जानवर के ऊपर एक कवर स्लिप रखें। कवर स्लिप मेसोग्लिया को संकुचित करती है और संपीड़ित ऊतक का पलटाव कोशिकाओं को थोड़ा अलग करता है। बनाए गए सूक्ष्म घावों का निरीक्षण करने के लिए तुरंत जानवर की छवि बनाएं।छोटे उपकला घाव ों को बनाने के लिए, मेडुसा को एक अवसाद स्लाइड पर रखें, जिसमें मेडुसा एक्स छाता ऊपर की ओर है, जैसा कि पहले दिखाया गया है। 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे से मेडुसा की सतह को खरोंचें। कोमल खरोंच तहखाने की झिल्ली में दरार पैदा कर सकती है।इमेजिंग के लिए जानवर को कवर स्लिप से कवर करें। कवर स्लिप रखना कभी-कभी खरोंच के बिना भी छोटे उपकला घाव बनाने के लिए पर्याप्त होता है। पाठ में उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए, एक माइक्रो पिपेट स्तंभ और ग्लास केशिका ट्यूब का उपयोग करके एक माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें।खाली माइक्रोइंजेक्शन सुई को माइक्रो मैनिपुलेटर से चिपके हुए माइक्रोइंजेक्शन धारक में रखें और सुई की नोक को काट दें, जैसे कि उद्घाटन लगभग 20 से 40 माइक्रोन हो। माइक्रोइंजेक्टर पर पकड़ का दबाव शून्य पर सेट करें, और इजेक्शन दबाव लगभग 20 पाउंड प्रति वर्ग इंच तक। हवा की दो सेकंड की पल्स देने के लिए माइक्रोइंजेक्टर सेट करें।बड़े उपकला घाव बनाने के लिए, मेडुसा को अवसाद स्लाइड पर रखें, जैसा कि पहले दिखाया गया था। माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करके, माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप को पानी के ठीक ऊपर रहने के लिए समायोजित करें, ध्यान से नोक को पानी में डुबोकर, और फिर इसे इस तरह से वापस लें कि यह मेडुसा की उपकला सतह के करीब हो। इंजेक्टर पर स्टार्ट दबाकर पल्स एयर।टिप की चौड़ाई के आधार पर पल्स को एक ही स्थान पर दो से चार बार दोहराएं। बड़े सुझावों के लिए कम दालों की आवश्यकता होती है। बड़े घावों की इमेजिंग के लिए घायल जानवर को कवर स्लिप से कवर करें।एक्स छाता पर फोकस समायोजित करें। हेक्सागोनल कोशिकाएं स्पष्ट होनी चाहिए। घाव को छवि बनाने के लिए मैन्युअल रूप से पहचानें।एक प्रोग्राम शुरू करें जो वास्तविक समय में एक फिल्म के रूप में छवियों को एकत्र करता है, या एक जो नियमित अंतराल पर छवियों की एक श्रृंखला एकत्र करता है। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रगति की निगरानी करें कि घाव क्षेत्र दृश्य के क्षेत्र से बाहर न जाए, और यह कि रुचि की कोशिकाएं फोकस में रहें। रंगों और दवाओं को इंजेक्ट करने के लिए, पाठ में उल्लिखित चरणों का पालन करते हुए एक माइक्रोइंजेक्शन सुई बनाएं।मेडुसा में इंजेक्शन के लिए डाई या दवा की अतिरिक्त मात्रा के साथ एक लंबी पिपेट टिप का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सुई को बैकफिल करें। एक संशोधित ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, उप-छतरी के साथ एक मेडुसा को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन, या पीडीएमएस इंजेक्शन डिश में रखें, जिसमें जानवर को कवर करने के लिए पर्याप्त एएसडब्ल्यू हो। पकवान को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के एक चरण पर रखें।माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप पर ध्यान केंद्रित करें, और इसे मेडुसा के पास पानी में आगे बढ़ाएं। माइक्रो मैनिपुलेटर के साथ, सुई को डिश में तब तक दबाएं जब तक कि यह झुक न जाए और टूट न जाए। लगभग 10 से 20 माइक्रोन का एक टिप ओपनिंग बनाना।माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करके, एक्स छतरी को घुमाए बिना मेसोग्लिया में उप छतरी के माध्यम से सुई की नोक डालें। माइक्रोइंजेक्टर पर, होल्ड दबाव को शून्य पर सेट करें, और इंजेक्शन दबाव 20 पाउंड प्रति वर्ग इंच से नीचे या उसके बराबर हो। एक या दो क्वाड्रंट में इंजेक्ट करें, प्रत्येक को डाई या ड्रग के एक स्थान से भरें, जो उस क्वाड्रंट के क्षेत्र का लगभग एक चौथाई है।डाई या दवा को किस तरह से इंजेक्ट किया जा रहा है, इसके आधार पर, जानवरों को डाई या दवा प्रसार और इनक्यूबेशन की अनुमति देने के लिए ताजा एएसडब्ल्यू के बीकर में रखा जाता है। इमेजिंग के लिए, एक संशोधित ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके मेडुसा को एक अवसाद स्लाइड पर माउंट करें, जानवर को एक्स छाता के साथ ऊपर रखें। इंजेक्शन अभिकर्मक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए जानवरों को इस स्तर पर घायल किया जा सकता है।कोशिकाओं के भीतर और बीच के सूक्ष्म घावों ने घाव बंद होने के दौरान छोटे लैमेलिपोडिया का निर्माण किया। इसके बाद संकुचन हुआ, और घाव एक मिनट से भी कम समय में ठीक हो गए। छोटे उपकला घाव भी लैमेलिपोडिया गठन और लैमेलिपोडिया संपर्कों के विस्तार के माध्यम से ठीक हो गए।तेजी से और प्रगतिशील घाव बंद होने से पहले नवगठित घाव सीम के साथ ऊतक संकुचन हुआ। समय के साथ कुल घाव क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त दो छोटे घावों की सामान्यीकृत उपचार दर ने घाव बंद करने की गतिशीलता में कुछ परिवर्तनशीलता का संकेत दिया। अनुपचारित जानवरों में औसत घाव भरने की अवस्था स्थापित करने के लिए 14 विभिन्न घावों के डेटा का उपयोग किया गया था।तहखाने की झिल्ली की क्षति वाले एक छोटे से घाव में, सीमांत कोशिकाएं क्षतिग्रस्त क्षेत्र के चारों ओर फैल जाती हैं, और अंतर पर्स स्ट्रिंग संकुचन के साथ बंद हो जाता है। जब ऊतक निर्जलित हो जाता है या मरम्मत के लिए बहुत क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो सेल आंदोलन बंद हो सकते हैं, या कोशिकाओं की पूरी शीट फट सकती है। बड़े घाव कई चरणों में ठीक हो जाते हैं।मार्जिन पर संकुचन, लैमेलिपोडिया गठन, और लैमेलिपोडिया के विस्तार के बाद किनारे का चिकनापन सामूहिक सेल माइग्रेशन से संपर्क करता है, और कई सेल स्तरों से दूर, मार्जिन ने बड़े अंतराल को बंद कर दिया। ईसीएम में अभिकर्मकों को माइक्रोइंजेक्ट करके परमाणु और झिल्ली धुंधला पन हासिल किया गया था। साइटोक्लासिन बी के माइक्रोइंजेक्शन ने घाव के बाद लैमेलिपोडिया गठन को रोक दिया।जानवरों को धीरे से संभालें। अभिकर्मकों को इंजेक्शन देते समय, सुनिश्चित करें कि माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक मेसोग्लिया में है, और जानवर के माध्यम से सभी तरह से नहीं गई है। वर्तमान में, ट्रांसजेनिक जानवरों को फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के साथ बनाया जा रहा है, संयुक्त प्रतिदीप्ति और अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी उपकला घाव भरने में सेलुलर घटनाओं की एक और भी स्पष्ट छवि देगा।

Research

JoVE Journal

Biology

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

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In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

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