Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
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E.E.L.L.は、全米科学財団PRFB 2011010からの助成金によってサポートされています。クリティアコロニーの設立に協力してくれた百瀬剛さんとエブリン・フーリストンさん、微小創傷治癒画像の収集をしてくれたジャン・バティスト・レイニエさん、疑似クライゼルタンクを建設してくださったハリー・キリアゼスさん、クリティアの生息地を維持してくれたエリザベス・バルドさんに感謝します。図1Bは BioRender.com で作成されました。

開示するものは何もありません。

ここでは、比較的新しい無脊椎動物モデル生物であるClytiaにおけるインビボで創傷を画像化するための方法論が提示される40、43、58。このシステムをユニークで強力な研究ツールにするいくつかの要因があり、創傷治癒と再上皮化の研究に使用される他のモデルとは異なります。まず、単層上皮は透明なECMに付着しているため、in vitro組織培養アッセイに似ています(図1、図2、図3、図4)。in vitroアッセイと同様に、細胞を高解像度でイメージングすることができます。しかし、組織培養とは異なり、本物の細胞環境とECMが存在するため、創傷治癒は、生きた傷害動物で発生する複雑なシグナル伝達イベントのコンテキストで見ることができます。第二に、クリティアは炎症反応、移動性線維芽細胞、血管系、および血液を欠いています。これにより、創傷治癒中により複雑な成体動物において起こる重複事象がない場合に、インビボで再上皮化プロセスを研究することができる59。第三に、ECMは無細胞(補足動画1)で大きく、マイクロインジェクションニードルで簡単にアクセスできます(図5および図6)。このアプローチを使用して、研究者は、ECM構造またはシグナル伝達を乱す薬理学的試薬がin vivoでの創傷治癒に及ぼす影響をテストできます。試薬は上皮細胞に導入することもでき、in vivo創傷治癒に対するそれらの効果を評価することができます。第四に、Clytiaシステム42、43、44、45において突然変異体およびトランスジェニック動物を作成するために存在するプロトコルがある。したがって、in vivo創傷治癒は、目的の遺伝子の発現が増加/減少した動物で観察できます。
この手法にはいくつかの重要な手順があります。まず、 図3に示すように、扁平で透明な上皮細胞は標準的な光学顕微鏡ではほぼ見えないため、DIC顕微鏡用に正しく構成された顕微鏡を使用する必要があります。また、ECMをえぐらずに上皮が損傷するように動物を優しく傷つけるスキルを開発することも重要です。注射中に動物に広範囲の損傷を与えると、その後の創傷治癒の分析が損なわれる可能性があるため、ECMに材料をマイクロ注入する場合も同様に穏やかなタッチが必要です。これらのテクニックには学習曲線がありますが、初心者の学生でもマラミーラボですぐに習得しています。実際、これらのプロトコルは、シカゴ大学の学部ラボコースで細胞移動を実証するために使用されています。
最適なイメージングのためには、動物が動かず、選択された創傷領域が視野から外れないことが重要です。動物が脈動している場合、記載されているトリカインによる治療は非常に効果的です。.ドリフトの場合、多くの場合、サンプルを手動で再配置する必要があります。これらの動きは、FIJI / ImageJの登録機能を使用して、最終的なムービーから排除できます。
このシステムの制限は、ここで説明する方法を使用して傷の形状とサイズの両方が異なるため、同一の傷を作成できないことです。したがって、創傷閉鎖または細胞移動の正確な速度を定量化することは困難な場合があります。炭素粒子などの位置マーカーは、負傷した動物において露出したECMに付着し、大きな創傷における集団細胞移動の速度を測定するために使用することができる(図示せず)。小さな創傷閉鎖分析では、創傷のサイズと形状が変動しても、このサイズの創傷の閉鎖率の範囲は限られています(図4)。したがって、促進的または抑制的な薬理学的試薬の効果を定量的に検出することが可能です。
この研究では、DIC顕微鏡のみを使用した創傷治癒の特性評価について説明していますが、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用した画像治癒にも同じアプローチを使用できます。これを支援するために、さまざまな細胞および細胞外タンパク質が蛍光標識されたトランスジェニック動物を生成するためのプロトコルが実施されています。DICと蛍光による同時イメージングと、薬理学的薬剤または変異株を使用した創傷治癒の摂動を組み合わせることは、上皮の創傷治癒過程の根底にあるメカニズムを理解するための強力なアプローチになります。

上皮細胞のシートは、すべての後生動物の外面を覆い、内臓を裏打ちし、動物の体を個別の区画に分割します。上皮はまた、内部体を外部環境から分離し、損傷や感染から保護します。したがって、上皮層の出現は多細胞動物の進化の重要な部分であり、上皮層は脊椎動物から最も基底的な後生動物までのすべての動物に見られます1。一部の臓器の上皮は、肺気嚢、血管、腸2、およびプラナリアや刺胞動物3などの無脊椎動物の表皮などの単一の単層です。脊椎動物の皮膚4や角膜5などの他の組織では、上皮が重層化しており、複数の上皮細胞層2が存在することを意味する。すべての場合において、最も基底上皮層は、細胞外マトリックス(ECM)の特殊な領域を形成するタンパク質シートである基底膜に貼り付けられています6、7、8。
上皮の破れは、連続した上皮シートを再現するために迅速に修復する必要があります。上皮の損傷は、腸内の上皮細胞の脱落などの自然のプロセス中に発生します9,10、および炎症または身体的外傷の結果として発生します。単一の上皮細胞が損傷を受けた場合、周囲の細胞が互いに付着して穴を閉じることを可能にするために、それ自体を修復するか、または排除されなければならない11,12。単一細胞のサイズよりも大きい創傷では、上皮細胞は、シート13を修復するために互いに到達するために移動しなければならない。これは、ギャップが小さい場合、または創傷ギャップを閉じるために創傷の縁から上皮細胞の移動を必要とする場合、細胞拡散によって達成され得る。この後者のプロセスは、再上皮化14,15と呼ばれます。胚組織において、上皮細胞は、巾着紐16に似た機構において、創傷縁部で細胞間に形成されるアクトミオシンケーブルの収縮によって、接近創傷に広がって遊走するか、または隙間を横切って引っ張られる。多くの成体組織において、再上皮化はコヒーレント細胞シートの移動を伴い、そこでは細胞は隣接する細胞との接合を維持する14、17、18。他の組織では、細胞:細胞結合が解体され、上皮細胞は間葉系細胞のように振る舞い、再上皮化中に協調しているが独立した方法で創傷領域に移動する14、19、20、21。
上皮細胞の動きは、移動する細胞間および細胞とECMの間の複雑な相互作用によって調節されています。上皮細胞の創傷活性化とその後の移動のメカニズムを扱った膨大な量の実験文献がありますが、まだ多くの発見が残されています。例えば、創傷に応答して上皮細胞を活性化して遊走させる初期シグナルは、決定的に同定されておらず22、創傷に最も近い上皮細胞の側にラメリポディアを作成するためにアクチンがどのように再展開されるかも完全には理解されていない22、23、24、25、26、27.集団的な細胞遊走は、創傷の細胞からの情報を創傷の遠位の細胞と共有することを必要とし、コミュニケーション経路はまだ不明である28。セル:セル接合部とセル:ECMアタッチメントは、シート内のセルが再配置されるにつれて分解および再形成する必要がありますが、このプロセスの制御はあまり理解されていません14,29。これらの問題やその他の関連する質問を進めることは、基本的な生物学的問題としてだけでなく、正しい創傷治癒の臨床的意義のためにも重要です。上皮細胞が正しく移動する能力を損なう疾患は、慢性創傷をもたらす。一例は遺伝病表皮水疱症であり、ECMへの上皮細胞の付着に関与する遺伝子が変異し、剥離して水疱ができた脆弱な皮膚をもたらす。再上皮化は、自然に老化した組織においても損なわれる30、31。したがって、創傷治癒の結果を改善するための介入を開発するには、より良い理解が不可欠です。
創傷治癒における上皮細胞遊走は、in vitroアプローチおよびモデル生物の両方を用いて研究されている。創傷治癒および細胞移動のメカニズムに関する研究の大部分は、単一の上皮細胞タイプの単層がECMに代わる基質上で増殖する組織培養で行われている。細胞単層は、特定の形状およびサイズのギャップを作成するためにステンシルで引っかかれるか成長され、次いで観察される32、33、34。in vitroモデルにより、細胞の挙動を理想的に可視化できるだけでなく、基質の質を変えたり、細胞を薬物や非生物的因子にさらしたり、目的のさまざまな遺伝子を発現または抑制するコンストラクトを細胞にトランスフェクトしたりすることができます。しかしながら、この還元主義的アプローチは、様々な細胞型間の通信およびECM11において生じるシグナル伝達事象を含む、インビボの状況における上皮細胞挙動に関与する重要なパラメータのいくつかを捕捉することができない可能性がある。in vivoモデルは、複数の細胞型、重複するシグナル伝達経路、および複雑なECM35を備えた創傷の本物のコンテキストを提供します。創傷治癒研究のためのそのようなモデルの1つはマウス19であり、最近の進歩により、研究者は生きた動物における全層創傷の治癒中に表皮細胞を観察することができるようになった36。しかし、マウスやその他のin vivoシステムは、再上皮化の研究に課題を提示します。第一に、自然な状況で細胞の挙動を観察することの大きな利点は、血液凝固、免疫細胞の動員および炎症、線維芽細胞の動員、および細胞の脱分化、血管再形成、およびECMのリモデリングを含む、脊椎動物の創傷治癒中に発生する時間的に重複するイベントの複雑さによってバランスが取れています。さらに、不透明な組織はイメージングを困難にします。ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの表皮システム37,38は、比較的単純であるため、これらの困難のいくつかを克服しました39。
私たちの研究室は最近、上皮創傷治癒を研究するための新しいモデルを導入しました:ヒドロ虫刺胞動物Clytia hemisphaerica(Clytia)40のメデューサ(クラゲ)型。Clytiaは、完全に配列決定され注釈が付けられたゲノム41、シングルセルRNAseqトランスクリプトーム42、およびゲノム改変(突然変異誘発および導入)のためのプロトコルを備えた新興モデル生物です43,44,45。刺胞動物は上皮層を持つ最も古い現存する系統の1つであるため、刺胞動物の創傷治癒を理解することで、上皮の完全性を確保した祖先経路への洞察が得られます。生命の木を通して保存されている経路のために、Clytiaは上皮細胞のダイナミクスとin vivoでの創傷治癒の機能調節を研究するためのエキサイティングな新しいシステムを提供します。
Clytia medusa(exumbrella)の上面を覆う上皮は、幅約50μm、厚さ1〜2μmの透明な扁平上皮細胞の単層です(図1)。それらは、クラゲの「ゼリー」であるメソグレアと呼ばれるECMに取り付けられています。メソグレアは、脊椎動物を含む他の動物46、47、48に見られるECMと組成的に類似しており、基底膜40を有し、完全に透明である。Clytia medusaの上皮層は、簡単に引っかいたり傷ついたりする可能性があります(以下を参照)。上皮とECMのシンプルさと透明性により、治癒中の細胞とその動きの高解像度イメージングが可能になります。最近、Kamranらは、Clytia上皮における小さな創傷の治癒を詳細に特徴づけた40。Clytiaでの治癒は、ラメリポジアベースの細胞クロール、細胞拡散、および集団細胞移動、および胚系に典型的な巾着ストリング閉鎖によって行われることが実証されました(ただし、以前は角膜49などの成体動物の構造で見られました)。Clytia創傷治癒は、炎症反応を欠く他のシステムで見られるように、非常に速いです40,50。Clytia exumbrellaの治癒は、既存の上皮細胞の動きに完全に依存しており、細胞が増殖したり、ECMを介して創傷部位に移動したりすることはありません(補足動画1)。これらの発見はすべて、Clytiaが上皮創傷治癒を研究するための有用なモデルシステムであることを示唆しています。実際、創傷治癒中にClytiaの上皮細胞を画像化する容易さは、無傷の基底膜がある限り、上皮細胞の層状突起が露出したECMの領域に広がり、広がることを発見しました。基底膜が損傷すると、上皮治癒は巾着紐機構40に切り替わる。これは、ラメリポディアベースのクロールと財布のひも閉鎖による閉鎖の決定の根底にあるメカニズムの最初のデモンストレーションであり、治癒における特定の細胞:ECM相互作用と自然な状況での細胞の観察の重要性を強調しました。
以下では、単一細胞の微小創傷、主に細胞の広がりによって閉じる小さな創傷、および閉じるために集団的な細胞遊走を必要とする大きな創傷を作成およびイメージングするためのプロトコルについて説明します。さらに、ECMおよび上皮細胞への小分子の導入のためのプロトコルが記載されており、創傷治癒の推定調節経路の実験的摂動を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

皮膚から目、腸まで、すべての動物の臓器は上皮細胞のシートで覆われているため、感染から保護しながら恒常性を維持できます。したがって、上皮創傷を修復する能力がすべての後生動物にとって重要であることは驚くべきことではありません。脊椎動物の上皮創傷治癒には、炎症反応、血管新生、再上皮化などの重複するプロセスが含まれます。これらのプロセスの調節には、上皮細胞、隣接細胞、および細胞外マトリックス(ECM)間の複雑な相互作用が含まれます。ECMには、構造タンパク質、調節タンパク質、および活性低分子が含まれています。この複雑さは、ほとんどの動物が不透明な組織とアクセスできないECMを持っているという事実とともに、生きている動物で創傷治癒を研究することを困難にします。したがって、上皮創傷治癒に関する多くの作業は、人工マトリックス上に単層として播種された単一の上皮細胞タイプで組織培養システムで実行されます。 Clytia hemisphaerica (Clytia)は、これらの研究をユニークでエキサイティングな補完物を提供し、本物のECMを備えた無傷の動物で上皮創傷治癒を研究することを可能にします。Clytiaの外胚葉上皮は、大きな扁平上皮細胞の単層であり、生きている動物における微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用した高解像度イメージングを可能にします。遊走性線維芽細胞、血管系、または炎症反応がないため、 in vivoでの再上皮化における重要な事象を解剖することができます。単細胞微小創傷、大小の上皮創傷、基底膜を損傷する創傷など、さまざまな種類の創傷の治癒を解析できます。ラメリポディアの形成、巾着糸の収縮、細胞の伸張、および集団的な細胞移動はすべて、このシステムで観察できます。さらに、薬理学的物質をECM を介して 導入して、細胞:ECM相互作用およびin vivoでの細胞プロセスを改変することができる。この研究は、生きているClytiaに傷を作り、治癒の動画をキャプチャし、ECMに試薬をマイクロ注入することによって治癒メカニズムを調べる方法を示しています。

上記のプロトコルに従って、単一細胞の微小創傷、小さな創傷、および大きな創傷を画像化した。登録された画像ファイルのスタックは、.aviファイルとして保存されました。
動画1では、細胞間および細胞内の微小創傷が閉じているのが見られます(図1 および 図2)。閉鎖中に小さなラメリポディアが観察され、その後収縮と治癒が続きます。破片は排除され、水中に放出されます。癒しは1分以内に完了します。
動画2および3では、異なる形状の小さな創傷は、前述のように、ラメリポディアの形成、ラメリポジアル接触の伸展、および創傷縁での細胞の拡散によって治癒する40(図1および図2)。辺縁細胞の後ろの層の細胞は、このサイズの創傷の治癒に参加せず、集団的な細胞移動もありません。上皮間隙の急速かつ漸進的な閉鎖に続いて、新たに形成された創傷縫い目40に沿った組織収縮が続く。これら2つの創傷の正規化された治癒率を、経時的な元の領域のパーセンテージとして表して示します(図4C、D)。創傷閉鎖のダイナミクスにはいくらかのばらつきがあるが、0.02〜0.125mm2の範囲の様々な形状の14創傷について経時的なパーセント面積閉鎖を平均すると、未処置動物における創傷治癒の平均曲線を確立することができる(図4E)。
基底膜の損傷は、それが発生するとはっきりと見ることができます(図2)。 動画4では、基底膜損傷のある小さな傷の縁の細胞が損傷部位の周囲に広がり、巾着紐収縮で隙間閉鎖が完了します。
組織が脱水状態または損傷しすぎて修復できない場合、細胞の動きが止まるか、細胞のシート全体が破裂する可能性があります(ムービー5 および ムービー6)。これは通常、長時間のイメージング(45分以上)後に発生します。イメージングの早い段階で細胞バーストが発生した場合、サンプルは廃棄されます。
動画7のように、大きな傷はいくつかの段階で治ります。第一に、創傷の縁は、以前に報告されたように、縁での収縮のために滑らかで規則的になる57。次に、ラメリポディアが創傷縁の細胞から形成されるのが見られ、ラメリポディアは隣接するラメリポディアとの接触を最大化するために前進します。創傷縁および辺縁細胞の背後にある数層における細胞内の核の追跡は、集団細胞移動によって大きな間隙が閉じることを示している40。細胞は決して切り離されませんが、シートとして一緒に移動します。
染料および薬理学的物質の導入は、生物学的メカニズムを解剖するための強力なツールとなり得る。多くの物質がClytia(図示せず)から除外されていますが、これはおそらく動物の表面を覆う粘液層が原因です。ただし、マイクロインジェクションを使用して、ECMに分子を直接導入し、ECM構造を破壊したり、ECMの規制活動を混乱させたりすることができます。さらに、染料および他の分子は基底側から上皮細胞に入ることができる。例えば、 図6 は、Hoechstによる核染色、FM1-43による膜染色、およびこれらの試薬をECMにマイクロ注入した後のサイトカラシンBによるラメリポディア形成の阻害を示す。創傷前にこれらの分子をECMおよび上皮細胞に導入することで、治癒過程に対する薬理学的ツールの効果を試験する実験が可能になります。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> 図6:色素または薬理学的物質のマイクロインジェクション後のメデューサの上皮細胞。(A)20 μM Hoechst(核)および50 μM FM1-43(膜)を注入してから5分後にトップパネルに示す上皮細胞。(B,C)1:1,000 DMSOコントロール(B)または100 μMサイトカラシンB(C)による注射後の創傷治癒。注射の15分後に創傷を作製した。画像は負傷後5分で撮影した。ラメリポディアの形成は、サイトカラシンBによって阻害される。創傷領域の細胞間によく見られる明らかな「繊維」は、基底膜を伸ばす張力の結果であると考えられています—それらはファロイジンで染色しません(図示せず)。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:シングルセル微小創傷治癒のタイムラプス動画。経過時間:20秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画2:小さな上皮創傷治癒のタイムラプス動画。経過時間:9分54秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画3:小さな上皮創傷治癒のタイムラプス動画。この傷は、映画2の傷よりも大きく、不規則な形をしています。経過時間:20分54秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画4:基底膜裂傷による小さな傷と微小創傷治癒のタイムラプス動画。 ラメリポディアは基底膜の裂け目の周りに広がっていますが、ECMの残りの部分に進む可能性があります。基底膜損傷を伴う創傷の領域が囲まれると、財布のひも収縮がその領域の上に細胞を引っ張る。経過時間:19分4秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画5:小さな上皮創傷で死滅する細胞。 細胞死は動物の脱水による可能性があります。経過時間:4分24秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画6:小さな上皮創傷が治癒を完了できない。 経過時間:42分32秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画7:大きな上皮創傷治癒。 経過時間:25分29秒フレームレート:10 fps。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:クリティアタンクの寸法概略図。 カスタムメイドのクリティア戦車の3Dビジュアライゼーション。 (A) 正面図と背面図。 (B) 側面図。緑色で示されている作品の切り欠きはナイロンメッシュで覆われています。水はメッシュの真上をタンクに入り、メッシュ上を掃引して円形の流れを作り出します。水は、青色で示されているエンドピースの穴からシステムから排出されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足動画1:クリチアの無細胞細胞外マトリックス。 共焦点顕微鏡を使用して撮影されたクリティアのZスタック。スタックは最初に外傘に焦点を合わせ、次にECMを介してプレート内胚葉とサブ傘まで10μmごとにスキャンします。DIC(左)とヘキスト核染色(右)を使用した画像は、ECMに細胞がないことを示しています。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

本論文では、生きた Clytia hemisphaerica medusa の上皮に創傷を作製し、 in vivoで高解像度で創傷治癒を画像化する方法について説明します。さらに、創傷治癒中に上皮細胞および細胞外マトリックスにおけるシグナル伝達プロセスを混乱させるために色素および薬物を導入する技術が提示される。

刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

このプロトコルは、生きた動物における創傷治癒中の上皮細胞の可視化を可能にする。それは私達が細胞が彼らの自然な複雑な環境でどのように振る舞うかを見ることを可能にします。この技術は、細胞外マトリックスと細胞質に試薬を導入して、生きた動物の創傷治癒中の細胞の広がりと遊走に対するこれらの試薬の効果を研究します。上皮創傷治癒とクリティアは、より複雑な動物の治癒に非常に似ています。したがって、創傷治癒のメカニズムとそれらがどのように始まったかについて、このシステムから多くを学ぶことができます。これらの手順を実演するのは、エリザベス・リーと研究技術者のエミリー・ワットです。創傷のプロセスを開始するには、ピペットチップをハサミで切断し、直径約0.5〜0.7センチメートルの拡大開口部を作成して、修正トランスファーピペットを準備します。修正されたトランスファーピペットを使用して、確立されたポリープコロニーから収集されたメデューサを、メデューサX傘を上に向けて、くぼみスライドに置きます。十分な量の人工海水(ASW)が動物を覆っていることを確認してください。細胞内および細胞間に微小な傷を作るには、動物の上にカバースリップを置きます。カバースリップはメソグレアを圧迫し、圧縮された組織のリバウンドは細胞をわずかに離します。作成された微小創傷を観察するために、動物をすぐに画像化します。小さな上皮創傷を作成するには、前に示したように、修正されたトランスファーピペットを使用して、メデューサX傘を上に向けてメデューサをくぼみスライドに置きます。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、メデューサの表面をそっと引っ掻きます。穏やかな引っかき傷は、基底膜に裂け目を作る可能性があります。イメージング用のカバースリップで動物を覆います。カバースリップを配置するだけで、引っかき傷がなくても小さな上皮の傷を作るのに十分な場合があります。マイクロピペットピラーとガラスキャピラリーチューブを使用して、テキストで概説されている手順に従って、マイクロインジェクションニードルを準備します。空のマイクロインジェクションニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクションホルダーに入れ、開口部が約20〜40ミクロンになるように針の先端を切断します。マイクロインジェクターの保持圧力をゼロに設定し、排出圧力を約20ポンド/平方インチに設定します。マイクロインジェクターを2秒間の空気パルスを供給するように設定します。大きな上皮創傷を作成するには、前に示したように、メデューサをうつ病スライドに置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロインジェクションの針先を水に注意深く浸し、メデューサの上皮表面に近づくように引っ込めて、マイクロインジェクション針の先端を水のすぐ上にとどまるように調整します。インジェクターのスタートを押して空気をパルスします。先端の幅に応じて、同じ場所でパルスを2〜4回繰り返します。チップが大きいほど、必要なパルスは少なくなります。大きな傷を画像化するために、負傷した動物をカバースリップで覆います。フォーカスを x 傘に合わせます。六角形のセルは透明でなければなりません。傷を手動で識別して画像化します。画像をムービーとしてリアルタイムで収集するプログラム、または一連の画像を一定の間隔で収集するプログラムを起動します。進行状況を監視して、創傷領域が視野から外れないようにし、目的の細胞に焦点が合ったままであることを確認します。染料や薬を注入するには、テキストで概説されている手順に従ってマイクロ注射針を作ります。メデューサに注射するための過剰量の染料または薬物を入れた長いピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルを埋め戻します。改造トランスファーピペットを使用して、サブ傘を上に向けてメデューサをポリジメチルシロキサンまたはPDMS注射皿に入れ、動物を覆うのにちょうど十分なASWを入れます。皿を解剖顕微鏡のステージに置きます。マイクロインジェクションの針先に焦点を合わせ、メデューサ近くの水中に進めます。マイクロマニピュレーターを使用して、針が曲がって折れるまで針を皿に押し込みます。約10〜20ミクロンの先端開口部を作成します。マイクロマニピュレーターを使用して、X傘に穴を開けることなく、針の先端をサブ傘を通してメソグレアに挿入します。マイクロインジェクターで、保持圧力をゼロに設定し、射出圧力を20ポンド/平方インチ以下に設定します。1つまたは2つの象限に注入し、それぞれにその象限の領域の約4分の1の染料または薬物のスポットを充填します。注入される染料または薬物に応じて、動物は新鮮なASWのビーカーに入れられ、染料または薬物の拡散とインキュベーションが可能になります。イメージングのために、修正されたトランスファーピペットを使用してメデューサをうつ病スライドに取り付け、X傘を上に向けて動物を配置します。注射された試薬の効果をテストするために、この段階で動物を負傷させることができます。細胞内および細胞間の微小創傷は、創傷閉鎖中に小さな層状突起を形成した。これに続いて収縮し、傷は1分以内に治癒しました。小さな上皮創傷はまた、ラメリポディアの形成およびラメリポディア接触の伸展によって治癒した。急速かつ進行性の創傷閉鎖は、新たに形成された創傷縫合に沿った組織収縮に先行した。経時的な全創傷面積のパーセンテージとして表された2つの小さな創傷の正規化された治癒率は、創傷閉鎖動態におけるいくらかの変動性を示した。14の異なる創傷からのデータを使用して、未処置動物における平均創傷治癒曲線を確立した。基底膜損傷を有する小さな創傷では、辺縁細胞が損傷領域の周囲に広がり、隙間は巾着紐収縮で閉じた。組織が脱水状態になったり、損傷しすぎて修復できない場合、細胞の動きが止まったり、細胞のシート全体が破裂したりする可能性があります。大きな傷はいくつかの段階で治癒しました。縁での収縮、ラメリポディアの形成、およびラメリポディアの伸展に続くエッジの平滑化は、マージンでの集合的な細胞移動、およびマージンから離れたいくつかの細胞層に接触し、大きなギャップを埋めました。核および膜染色は、試薬をECMにマイクロインジェクションすることによって達成されました。サイトカラシンBのマイクロインジェクションは、創傷後のラメリポディア形成を阻害した。動物を優しく扱います。試薬を注入するときは、マイクロインジェクション針の先端がメソグレアにあり、動物を完全に通過していないことを確認してください。現在、トランスジェニック動物は蛍光タグタンパク質を用いて作製されており、蛍光と示差干渉コントラスト顕微鏡を組み合わせると、上皮創傷治癒における細胞事象のさらに鮮明な画像が得られます。

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

コレラ菌：細菌性病因を研究するモデル生物 - インタビュー

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

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トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

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RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

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Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

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拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...