Name: characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

E.E.L.L. поддерживается грантом Национального научного фонда PRFB 2011010. Мы хотели бы поблагодарить Цуёси Момосэ и Эвелин Хулистон за помощь в создании наших колоний Клиции, Жана-Батиста Ренье за сбор изображений заживления микроран, Гарри Кириазеса за строительство резервуаров псевдо-крейзеля и Элизабет Бальдо за поддержание среды обитания Клитии. Рисунок 1B был создан с помощью BioRender.com.

Нечего раскрывать.

Здесь представлена методология визуализации ран in vivo у Clytia, относительно нового модельного организма беспозвоночных40,43,58. Есть несколько факторов, которые делают эту систему уникальным и мощным исследовательским инструментом, отличным от других моделей, используемых для изучения заживления ран и реэпителизации. Во-первых, монослойный эпителий прикрепляется к прозрачному ECM, что напоминает анализы культуры тканей in vitro (рис. 1, рис. 2, рис. 3 , рис. 4). Как и в анализах in vitro, клетки могут быть визуализированы с высоким разрешением. Однако, в отличие от культуры тканей, существует подлинная клеточная среда и ECM, так что заживление ран можно рассматривать в контексте сложных сигнальных событий, которые происходят у живого раненого животного. Во-вторых, у Clytia отсутствуют воспалительные реакции, мигрирующие фибробласты, сосудистая сеть и кровь. Это позволяет изучать процесс реэпителизации in vivo при отсутствии перекрывающихся событий, которые происходят у более сложных взрослых животных во время заживления ран59. В-третьих, ECM является бесклеточным (дополнительный фильм 1) и большим, что обеспечивает легкий доступ с помощью иглы для микроинъекций (рис. 5 и рис. 6). Используя этот подход, исследователи могут проверить влияние фармакологических реагентов, которые нарушают структуру ECM или передачу сигналов о заживлении ран in vivo. Реагенты также могут быть введены в эпителиальные клетки, и их влияние на заживление ран in vivo может быть оценено. В-четвертых, существуют протоколы создания мутантов и трансгенных животных в системе Clytia42,43,44,45. Таким образом, заживление ран in vivo может наблюдаться у животных с повышенной/пониженной экспрессией интересующих генов.
В этой технике есть несколько важных шагов. Во-первых, как показано на рисунке 3, необходимо использовать микроскоп, который правильно сконфигурирован для ДВС-микроскопии, поскольку плоские, прозрачные эпителиальные клетки почти невидимы при стандартной световой микроскопии. Также важно выработать навык аккуратно ранить животных, чтобы эпителий был поврежден, не выдолбив ЭКМ. Такое же мягкое прикосновение необходимо для микроинъекций материалов в ECM, так как обширное повреждение животного во время инъекции может поставить под угрозу последующий анализ заживления раны. Несмотря на то, что этим методам нужно учиться, даже начинающие студенты быстро освоили их в лаборатории Малами. Действительно, эти протоколы использовались для демонстрации миграции клеток на лабораторных курсах бакалавриата в Чикагском университете.
Для оптимальной визуализации важно, чтобы животное не двигалось, а выбранная область раны не выходила из поля зрения. Если животные пульсируют, лечение трикаином, как описано, очень эффективно. Для дрейфа часто приходится вручную перемещать образец. Эти движения могут быть удалены из финального фильма с помощью функции регистрации в FIJI/ImageJ.
Ограничением этой системы является то, что невозможно создать идентичные раны, так как раны различаются как по форме, так и по размеру с использованием методов, описанных здесь. Поэтому может быть трудно количественно определить точную скорость закрытия раны или миграции клеток. Позиционные маркеры, такие как углеродные зерна, прилипают к открытому ECM у раненого животного и могут использоваться для измерения скорости коллективной миграции клеток в больших ранах (не показаны). Для анализа закрытия небольших ран, даже с переменным размером и формой раны, существует ограниченный диапазон скоростей закрытия среди ран такого размера (рис. 4). Таким образом, можно количественно обнаружить эффекты стимулирующих или репрессивных фармакологических реагентов.
Хотя в этой работе описывается характеристика заживления ран с использованием только ДВС-микроскопии, те же подходы могут быть использованы для визуализации заживления с использованием флуоресценции или конфокальной микроскопии. Чтобы помочь в этом, существуют протоколы для создания трансгенных животных, у которых различные клеточные и внеклеточные белки флуоресцентно мечены. Одновременная визуализация с ДВС-синдромом и флуоресценцией в сочетании с нарушением заживления ран с использованием фармакологических агентов или мутантных линий станет мощным подходом к пониманию механизмов, лежащих в основе процесса заживления ран в эпителии.

Листы эпителиальных клеток покрывают внешнюю поверхность всех многоклеточных, выстилают внутренние органы и делят тело животного на отдельные отсеки. Эпителий также отделяет внутреннее тело от внешней среды и защищает его от повреждений и инфекций. Следовательно, появление эпителиальных слоев было существенной частью эволюции многоклеточных животных, а эпителиальные слои наблюдаются у всех животных от позвоночных до большинства базальных многоклеточных1. Эпителий некоторых органов представляет собой единый монослой, например, в воздушных мешочках легких, кровеносных сосудах и кишечнике2, а также в эпидермисе беспозвоночных, таких как планарии и книдарии3. В других тканях, таких как кожа4 и роговица5 позвоночных, эпителий стратифицирован, что означает, что есть несколько слоев эпителиальных клеток2. Во всех случаях самый базальный эпителиальный слой прикрепляется к базальной мембране, белковому листу, который образует специализированную область внеклеточного матрикса (ECM)6,7,8.
Разрывы в эпителии должны быть быстро восстановлены, чтобы воссоздать непрерывный эпителиальный лист. Повреждение эпителия происходит во время естественных процессов, таких как отшелушивание эпителиальных клеток в кишечнике,9,10 а также в результате воспаления или физической травмы. Когда одна эпителиальная клетка повреждена, она должна либо восстановиться, либо быть устранена, чтобы позволить окружающим клеткам прикреплиться друг к другу и закрыть отверстие11,12. В ранах, превышающих размер одной клетки, эпителиальные клетки должны двигаться, чтобы достичь друг друга и восстановить лист13. Это может быть достигнуто путем распространения клеток, если промежутки малы или может потребоваться миграция эпителиальных клеток с краев раны, чтобы закрыть раневую щель; Этот последний процесс называется реэпителизацией14,15. В эмбриональных тканях эпителиальные клетки распространяются и мигрируют к закрытым ранам или вытягиваются через щель за счет сокращения актомиозиновых кабелей, которые образуются между клетками на краю раны, в механизме, напоминающем кошельковую нить16. Во многих тканях взрослого человека реэпителизация включает миграцию когерентных клеточных листов, где клетки сохраняют свои соединения с соседними клетками14,17,18. В других тканях клеточные связи демонтируются, и эпителиальные клетки ведут себя больше как мезенхимальные клетки, перемещаясь скоординированным, но независимым образом в область раны во время повторной эпителизации 14,19,20,21.
Движения эпителиальных клеток регулируются сложными взаимодействиями между мигрирующими клетками, а также между клетками и ECM. Несмотря на то, что существует огромное количество экспериментальной литературы, посвященной механизмам раневой активации эпителиальных клеток и последующей миграции, многое еще предстоит открыть. Например, первоначальный сигнал, который активирует эпителиальные клетки для миграции в ответ на рану, не был окончательно идентифицирован 22, и не до конца понятно, как актин перераспределяется для создания ламеллиподий на стороне эпителиальных клеток, ближайших к ране 22,23,24,25,26,27. Коллективная миграция клеток требует, чтобы информация от клеток в ране передавалась клеткам дистальнее раны, и путь связи до сих пор неясен28. Ячейка: клеточные соединения и ячейка: ECM насадки должны быть разобраны и преобразованы по мере того, как ячейки в листе перестраиваются, но регулирование этого процесса плохо изучено14,29. Достижение прогресса в этих и других связанных с ними вопросах важно не только как фундаментальная биологическая проблема, но и из-за клинической значимости правильного заживления ран. Заболевания, которые нарушают способность эпителиальных клеток правильно мигрировать, приводят к хроническим ранам; примером может служить генетическое заболевание буллезный эпидермолиз, при котором гены, участвующие в прикреплении эпителиальных клеток к ECM, мутируют, в результате чего кожа становится хрупкой, которая шелушится и покрывается волдырями. Реэпителизация также нарушается в естественно стареющих тканях30,31. Поэтому лучшее понимание имеет важное значение для разработки вмешательств для улучшения результатов заживления ран.
Миграция эпителиальных клеток при заживлении ран была изучена с использованием как подходов in vitro, так и модельных организмов. Большинство исследований заживления ран и механизмов миграции клеток было проведено в культуре тканей, где монослои одного типа эпителиальных клеток выращиваются на субстрате, замещающем ECM. Клеточные монослои либо царапают, либо выращивают с помощью трафаретов для создания промежутков определенных форм и размеров, а затем наблюдают32,33,34. Модель in vitro позволяет идеально визуализировать поведение клеток, а также дает возможность изменять качества субстрата, подвергать клетки воздействию лекарств и абиотических и биотических факторов, а также трансфицировать клетки конструкциями, которые экспрессируют или подавляют различные интересующие гены. Однако этот редукционистский подход может не охватить некоторые важные параметры, участвующие в поведении эпителиальных клеток в контексте in vivo, включая связь между различными типами клеток и сигнальные события, которые происходят в ECM11. Модели in vivo обеспечивают аутентичный контекст раны с несколькими типами клеток, перекрывающимися сигнальными путями и сложным ECM35. Одной из таких моделей для исследований заживления ран является мышь19, в которой последние достижения позволили исследователям наблюдать эпидермальные клетки во время заживления ран на всю толщину у живых животных36. Однако мышь и другие системы in vivo создают проблемы для изучения реэпителизации. Во-первых, большое преимущество наблюдения за поведением клеток в естественном контексте уравновешивается сложностью временно перекрывающихся событий, которые происходят во время заживления ран позвоночных, включая свертывание крови, рекрутирование иммунных клеток и воспаление, рекрутирование фибробластов и дедифференцировку клеток, реваскуляризацию и ремоделирование ECM. Кроме того, непрозрачные ткани затрудняют визуализацию. Системы эпидермиса личинок дрозофилы и рыбок данио-рерио 37,38 преодолели некоторые из этих трудностей из-за их относительной простоты39.
Наша лаборатория недавно представила новую модель для изучения заживления эпителиальных ран: форма медузы (медузы) гидрозоя книдария Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia является новым модельным организмом с полностью секвенированным и аннотированным геномом41, транскриптомом 42 одноклеточной РНКseq и протоколами модификации генома (мутагенез и трансгенез)43,44,45. Книдарии являются одной из старейших сохранившихся линий с эпителиальными слоями, поэтому понимание заживления ран книдария дает представление о предковых путях, которые обеспечивали целостность эпителия. Для тех путей, которые были сохранены на протяжении всего древа жизни, Clytia предлагает захватывающую новую систему для изучения динамики эпителиальных клеток и функциональной регуляции заживления ран in vivo.
Эпителий, покрывающий верхнюю поверхность Clytia medusa (exumbrella), представляет собой монослой прозрачных плоских эпителиальных клеток шириной примерно 50 мкм и толщиной 1-2 мкм (рис. 1). Они прикреплены к ECM, называемому мезоглеей — «желе» медузы. Мезоглея композиционно сходна с ECM, обнаруженным у других животных 46,47,48, включая позвоночных, имеет базальную мембрану 40 и полностью прозрачна. Эпителиальный слой у Clytia medusa можно легко поцарапать или ранить (см. Ниже). Простота и прозрачность эпителия и ECM позволяют получать изображения клеток и их движений во время заживления с высоким разрешением. Недавно Kamran et al. подробно охарактеризовали заживление небольших ран в эпителии Clytia40. Было продемонстрировано, что заживление у Clytia происходит за счет ползания клеток на основе ламеллиподий, распространения клеток и коллективной миграции клеток, а также закрытия кошельковых нитей, что более типично для эмбриональных систем (хотя ранее наблюдалось в структурах взрослых животных, таких как роговица49). Заживление ран Clytia происходит чрезвычайно быстро, как это было замечено в других системах, у которых отсутствует воспалительная реакция40,50. Заживление зонтика Clytia полностью зависит от движений существующих эпителиальных клеток — ни одна клетка не размножается и не мигрирует через ECM к месту раны (Дополнительный фильм 1). Все эти данные свидетельствуют о том, что Clytia является полезной модельной системой для изучения заживления эпителиальных ран. Действительно, легкость визуализации эпителиальных клеток в Clytia во время заживления ран привела к открытию, что ламеллиподии эпителиальных клеток расширяются и распространяются по областям открытого ECM до тех пор, пока есть неповрежденная базальная мембрана; Если базальная мембрана повреждена, эпителиальное заживление переключается на механизм40 кисетной струны. Это была первая демонстрация механизма, лежащего в основе решения о закрытии с помощью ползания на основе ламелиподий по сравнению с закрытием кошелька, что подчеркивает важность специфических взаимодействий клеток: ECM в заживлении и наблюдении за клетками в их естественном контексте.
Ниже описаны протоколы для создания и визуализации одноклеточных микроран, небольших ран, которые закрываются в основном за счет распространения клеток, и больших ран, для закрытия которых требуется коллективная миграция клеток. Кроме того, описан протокол введения малых молекул в ECM и эпителиальные клетки, что позволяет экспериментально возмущать предполагаемые регуляторные пути заживления ран.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Kramer Scientific Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam 506 mono</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>426557-0000-000-MA285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab143482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression slides</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>BS-C12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A16520-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>70022</td>
			<td>Excitation/Emission: 480/598 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62249</td>
			<td>Excitation/Emission: 361/497 nm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips (0.5-10 &#956;L /2-20 &#956;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3301R / M3301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass (22X40-1.5)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-544-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB085713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle v2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-ALL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate vacuum, desiccator</td>
			<td>Bel-art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMI Sv11 Dissection scope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>STEMI SV11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td>Dow Silicones</td>
			<td>1024001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Hab mini system</td>
			<td>Pentair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscopy software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing epithelial wound healing in vivo using the cnidarian model organism clytia hemisphaerica

Все органы животных, от кожи до глаз и кишечника, покрыты листами эпителиальных клеток, которые позволяют им поддерживать гомеостаз, защищая их от инфекции. Поэтому неудивительно, что способность заживлять эпителиальные раны имеет решающее значение для всех многоклеточных. Заживление эпителиальных ран у позвоночных включает перекрывающиеся процессы, включая воспалительные реакции, васкуляризацию и реэпителизацию. Регуляция этих процессов включает сложные взаимодействия между эпителиальными клетками, соседними клетками и внеклеточным матриксом (ECM); ECM содержит структурные белки, регуляторные белки и активные малые молекулы. Эта сложность, наряду с тем фактом, что большинство животных имеют непрозрачные ткани и недоступные ECM, затрудняет изучение заживления ран на живых животных. Поэтому большая работа по заживлению эпителиальных ран выполняется в системах культивирования тканей с одним типом эпителиальной клетки, покрытым монослоем на искусственном матриксе. Clytia hemisphaerica (Clytia) является уникальным и захватывающим дополнением к этим исследованиям, позволяя изучать заживление эпителиальных ран у интактного животного с подлинным ECM. Эктодермальный эпителий Clytia представляет собой один слой крупных плоских эпителиальных клеток, что позволяет получать изображения с высоким разрешением с использованием дифференциально-интерферирующей контрастной (ДВС-микроскопии) у живых животных. Отсутствие мигрирующих фибробластов, сосудистой сети или воспалительных реакций позволяет проанализировать критические события при реэпителизации in vivo. Можно проанализировать заживление различных типов ран, включая одноклеточные микрораны, мелкие и большие эпителиальные раны, а также раны, повреждающие базальную мембрану. В этой системе можно наблюдать образование ламеллиподий, сокращение кисетной нити, растяжение клеток и коллективную миграцию клеток. Кроме того, фармакологические агенты могут быть введены через ECM для модификации клеточных: ECM-взаимодействий и клеточных процессов in vivo. В этой работе показаны методы создания ран у живых клиций, съемки видеороликов о заживлении и зондирования механизмов заживления путем микроинъекций реагентов в ECM.

В соответствии с приведенными выше протоколами были визуализированы одноклеточные микрораны, небольшие раны и большие раны. Зарегистрированные стопки файлов изображений были сохранены в виде файлов .avi.
В фильме 1 можно увидеть, как микрораны закрываются между клетками и внутри них (рис. 1 и рис. 2). Небольшие ламеллоподии наблюдаются при закрытии с последующим сокращением и заживлением. Мусор исключается и выпускается в воду. Заживление завершается за минуту или меньше.
В фильмах 2 и 3 небольшие раны разной формы заживают за счет образования ламеллиподий, расширения ламеллиподиальных контактов и распространения клеток на краю раны, как описано ранее40 (рис. 1 и рис. 2). Клетки, расположенные ярусами позади маргинальных клеток, не участвуют в заживлении ран такого размера, и коллективной миграции клеток не происходит. Быстрое и прогрессирующее закрытие эпителиальных промежутков сопровождается сокращением тканей вдоль новообразованного раневого шва40. Показана нормализованная скорость заживления этих двух ран, выраженная в процентах от исходной площади с течением времени (рис. 4C, D). Несмотря на некоторую изменчивость динамики закрытия раны, усреднение процентного закрытия площади с течением времени для 14 ран различной формы в диапазоне от 0,02 до 0,125 мм2 позволяет построить среднюю кривую заживления ран у необработанных животных (рис. 4E).
Повреждение базальной мембраны хорошо видно при его возникновении (рис. 2). В фильме 4 клетки на краю небольшой раны, в которой есть повреждение базальной мембраны, распространяются вокруг поврежденного участка, и закрытие щели завершается сокращением кисетной нити.
Если ткань обезвожена или слишком повреждена для восстановления, движение клеток может прекратиться, или весь лист клеток может лопнуть (Фильм 5 и Фильм 6). Обычно это происходит после длительных периодов визуализации (45 минут или дольше). Если разрыв клеток происходит на ранней стадии визуализации, образец отбрасывается.
Как показано в фильме 7, большие раны заживают в несколько этапов. Во-первых, край раны становится гладким и правильным из-за схваток на краю, о чем сообщалось ранее57. Затем видно, что ламеллиподии образуются из клеток на краю раны, при этом ламеллиподии движутся вперед, чтобы максимизировать контакт с соседними ламеллиподиями. Отслеживание ядер в клетках на краю раны и на нескольких ярусах позади маргинальных клеток показывает, что большие промежутки закрываются коллективной миграцией клеток40. Клетки никогда не отделяются, а движутся вместе, как лист.
Введение красителей и фармакологических средств может стать мощным инструментом для препарирования биологических механизмов. Многие вещества исключены из Clytia (не показаны), вероятно, из-за слоя слизи, который покрывает поверхность животного. Тем не менее, микроинъекция может быть использована для непосредственного введения молекул в ECM, нарушая структуру ECM или нарушая регуляторную активность в ECM. Кроме того, красители и другие молекулы способны проникать в эпителиальные клетки с базальной стороны. Например, на рисунке 6 показано ядерное окрашивание с помощью Хёхста, окрашивание мембраны с помощью FM1-43 и ингибирование образования ламеллиподий цитохалазином B после микроинъекции этих реагентов в ECM. Введение этих молекул в ECM и эпителиальные клетки перед ранением позволяет проводить эксперименты, которые проверяют влияние фармакологических средств на процесс заживления.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg"> Рисунок 6: Эпителиальные клетки медузы после микроинъекций красителей или фармакологических средств. (A) Эпителиальные клетки, показанные на верхней панели через 5 мин после инъекции с 20 мкМ Hoechst (ядра) и 50 мкМ FM1-43 (мембраны). (В,В) Заживление ран после инъекции с контролем 1:1,000 ДМСО (B) или 100 мкМ цитохалазина B (C). Раны были нанесены через 15 минут после инъекции. Снимки были сделаны через 5 минут после ранения. Образование ламеллиподий ингибируется цитохалазином В. Считается, что кажущиеся «волокна», часто наблюдаемые между клетками в области раны, являются результатом растяжения растяжения базальной мембраны — они не окрашиваются фаллоидином (не показаны). Масштабные линейки: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Фильм 1: Покадровая съемка заживления одноклеточных микроран. Прошедшее время: 20 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 2: Покадровая съемка заживления небольшой эпителиальной раны. Хронометраж: 9 мин 54 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 3: Замедленная съемка заживления небольшой эпителиальной раны. Эта рана больше и имеет более неправильную форму, чем рана в фильме 2. Хронометраж: 20 мин 54 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 4: Замедленная съемка небольшой раны и микрораны, заживающей с разрывом базальной мембраны. Ламеллиподии распространяются вокруг разрыва базальной мембраны, хотя они могут распространяться на остальную часть ECM. Как только область раны с повреждением базальной мембраны окружена, сокращение кисетной нити тянет клетки над областью. Хронометраж: 19 мин 4 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 5: Клетки умирают в небольшой эпителиальной ране. Гибель клеток, вероятно, связана с обезвоживанием животного. Хронометраж: 4 мин 24 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 6: Небольшая эпителиальная рана не заживает . Хронометраж: 42 мин 32 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Фильм 7: Заживление большой эпителиальной раны. Хронометраж: 25 мин 29 с. Частота кадров: 10 кадров в секунду. Масштабная линейка: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>
Дополнительный рисунок 1: Схемы размеров резервуара Clytia. 3D визуализация танков Clytia по индивидуальному заказу. (А) Вид спереди и сзади. (B) Вид сбоку. Вырез в изделии, показанном зеленым цветом, покрыт нейлоновой сеткой. Вода поступает в резервуар непосредственно над сеткой, проносится по сетке и создает круговой поток. Вода выходит из системы через отверстие в торцевой части, показанное синим цветом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный фильм 1: Бесклеточный внеклеточный матрикс у Клитии. Z-стек Clytia взят с помощью конфокальной микроскопии. Стек сначала фокусируется на эксзонте, а затем сканирует каждые 10 мкм через ECM до энтодермы и субзонта пластины. Изображения с использованием ДВС-синдрома (слева) и ядерного окрашивания Хёхста (справа) демонстрируют отсутствие клеток в ЭВМ. Масштабная линейка: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica at JoVE.com

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

В данной работе описан способ создания ран в эпителии живой медузы Clytia hemisphaerica и изображения заживления ран с высоким разрешением in vivo. Дополнительно представлена методика введения красителей и лекарственных препаратов для возмущения сигнальных процессов в эпителиальных клетках и внеклеточном матриксе при заживлении ран.

Характеристика заживления эпителиальных ран in vivo с использованием книдарийского модельного организма Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Этот протокол позволяет визуализировать эпителиальные клетки во время заживления ран у живых животных. Это позволяет нам увидеть, как клетки ведут себя в своей естественной сложной среде. Этот метод вводит реагенты во внеклеточный матрикс и цитоплазму клетки для изучения влияния этих реагентов на распространение и миграцию клеток во время заживления ран у живых животных.Заживление эпителиальных ран и Clytia удивительно напоминает заживление у более сложных животных. Таким образом, мы можем многое узнать из этой системы о механизмах заживления ран и о том, как они возникли. Продемонстрируют эти процедуры Элизабет Ли и техник-исследователь Эмили Уотто.Чтобы начать процесс ранения, приготовьте модифицированную пипетку для переноса, отрезав кончик пипетки ножницами, создав увеличенное отверстие диаметром от 0,5 до 0,7 сантиметра. Используя модифицированную пипетку для переноса, поместите медузу, собранную из установленных колоний полипов, на предметное стекло с углублением зонтиком медузы X вверх. Убедитесь, что животное покрыто достаточным количеством искусственной морской воды или ASW.Чтобы создать микрораны внутри и между клетками, поместите покров на животное. Покровное скольжение сжимает мезоглею, и отскок сжатой ткани заставляет клетки слегка раздвигаться. Снимите животное сразу, чтобы наблюдать за созданными микроранками.Чтобы создать небольшие эпителиальные раны, поместите медузу на углубление зонтиком медузы X вверх, используя модифицированную пипетку для переноса, как показано ранее. Используя наконечник пипетки объемом 200 микролитров, аккуратно поцарапайте поверхность медузы. Легкое царапание может привести к разрывам в базальной мембране.Накройте животное покровным листом для визуализации. Иногда достаточно разместить покровное стекло, чтобы создать небольшие эпителиальные раны даже без царапин. Подготовьте иглу для микроинъекций, используя микропипетку и стеклянную капиллярную трубку, следуя шагам, описанным в тексте.Поместите пустую иглу для микроинъекций в держатель для микроинъекций, прикрепленный к микроманипулятору, и отрежьте кончик иглы так, чтобы отверстие составляло приблизительно от 20 до 40 микрон. Установите давление удержания на микроинжекторе на ноль, а давление выброса примерно на 20 фунтов на квадратный дюйм. Настройте микроинжектор на подачу двухсекундного импульса воздуха.Чтобы создать большие эпителиальные раны, поместите медузу на горку с углублением, как показано ранее. Используя микроманипулятор, отрегулируйте кончик иглы для микроинъекций так, чтобы он оставался чуть выше воды, осторожно опустив наконечник в воду, а затем втянув его так, чтобы он находился близко к эпителиальной поверхности медузы. Нагнетайте воздух, нажимая кнопку «Пуск» на инжекторе.Повторите пульс в одном и том же месте от двух до четырех раз, в зависимости от ширины наконечника. Большие наконечники требуют меньшего количества импульсов. Накройте раненое животное покровным листом для визуализации больших ран.Отрегулируйте фокус на зонтик x. Шестиугольные клетки должны быть четкими. Вручную определите рану, чтобы визуализировать ее.Запустите программу, которая собирает изображения в виде фильма в режиме реального времени, или программу, которая собирает серию изображений через равные промежутки времени. Следите за прогрессом, чтобы убедиться, что область раны не выходит из поля зрения и что интересующие клетки остаются в фокусе. Для инъекций красителей и лекарств сделайте иглу для микроинъекций, следуя шагам, описанным в тексте.Засыпьте иглу для микроинъекций с помощью длинного наконечника пипетки с избыточным объемом красителя или препарата для инъекции в медузу. Используя модифицированную пипетку для переноса, поместите медузу субзонтиком вверх в форму для инъекций полидиметилсилоксана или PDMS, чтобы ее хватило для покрытия животного. Поместите чашку на столик препарирующего микроскопа.Сосредоточьтесь на кончике иглы для микроинъекций и опустите ее в воду рядом с медузой. С помощью микроманипулятора вдавливайте иглу в посуду до тех пор, пока она не согнется и не сломается. Создание отверстия для наконечника размером примерно от 10 до 20 микрон.Используя микроманипулятор, введите кончик иглы через подзонтик в мезоглею, не прокалывая зонтик X. На микроинжекторе установите давление удержания на ноль, а давление впрыска ниже или равно 20 фунтам на квадратный дюйм. Вводят в один или два квадранта, заполняя каждый пятном красителя или лекарства примерно на одну четвертую площади этого квадранта.В зависимости от того, какой краситель или лекарство вводится, животных помещают в стакан со свежей противолодочной жидкостью, чтобы обеспечить диффузию и инкубацию красителя или лекарства. Для визуализации установите медузу на слайд с углублением с помощью модифицированной пипетки, расположив животное зонтиком X лицом вверх. Животные могут быть ранены на этом этапе, чтобы проверить действие введенного реагента.Микрораны внутри и между клетками образовали небольшие ламеллиподии во время закрытия раны. За этим последовали схватки, и раны зажили менее чем за минуту. Небольшие эпителиальные раны также заживали за счет образования ламеллиподий и расширения контактов с ламеллиподиями.Быстрому и прогрессирующему закрытию раны предшествовало сокращение тканей по вновь образованному раневому шву. Нормализованная скорость заживления двух небольших ран, выраженная в процентах от общей площади раны с течением времени, указывает на некоторую вариабельность динамики закрытия раны. Данные из 14 различных ран были использованы для установления средней кривой заживления ран у нелеченных животных.В небольшой ране, имеющей повреждение базальной мембраны, краевые клетки распространяются вокруг поврежденного участка, и щель закрывается сокращением кисетной нити. Когда ткань была обезвожена или слишком повреждена для восстановления, движение клеток могло прекратиться, или весь лист клеток мог лопнуть. Большие раны заживали в несколько этапов.Сглаживание края после сокращений на краю, образование ламеллиподий и расширение ламеллиподий контактирует с коллективной миграцией клеток на краю и на расстоянии нескольких клеточных ярусов от края, закрывая большие промежутки. Ядерное и мембранное окрашивание достигалось путем микроинъекции реагентов в ЭВМ. Микроинъекция цитохалазина В ингибировала образование ламеллиподий после ранения.Обращайтесь с животными аккуратно. При введении реагентов убедитесь, что кончик иглы для микроинъекций находится в мезоглее и не прошел весь путь через животное. В настоящее время трансгенные животные изготавливаются с флуоресцентными белками-метками, комбинированная флуоресценция и дифференциально-интерферирующая контрастная микроскопия дадут еще более четкое представление о клеточных событиях в заживлении эпителиальных ран.

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Холерный вибрион: Модель Организм по изучению бактериальных Патогенез - Интервью

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Микроинъекция эмбрионов оризии для использования в качестве модели Генетические организма

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Исследуя распространение и токсичности прионами как белков с использованием многоклеточных животных модельного организма<em&gt; C. Элеганс</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...