Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Denne undersøgelse støttes af National Natural Science Foundation of China (81700308 til XO og 31871181 til ML og 82270334 til XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 til XO, 23ZYZYTS0433 og 2022YFS0607 til XT og 2022NSFSC1602 til TC) og State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 til XO), MRC (G10031871181 til ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE i Oxford (ML) tilskud.

Mandlige 10 til 14 uger gamle vildtypemus eller RyR2-R2474S / + mus (C57BL / 6 baggrund), der vejer 20-25 g, anvendes til forsøgene. Alle procedurer er godkendt af dyrepleje- og brugsudvalget ved Southwest Medical University, Sichuan, Kina (godkendelse NO: 20160930) i overensstemmelse med de nationale retningslinjer, som institutionen opererer under.
1. Forberedelse
<ol><li>Lager løsninger<ol><li>Blebbistatin-stamopløsning: Der tilsættes 1 ml 100% dimethylsulfox...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

Baseret på vores erfaring inkluderer nøglerne til en vellykket dobbeltfarvet optisk kortlægning af et musehjerte en velforberedt løsning og hjerte, farvestofbelastning, opnåelse af det bedste signal-støj-forhold og reduktion af bevægelsesartefakten.
Fremstilling af opløsning Krebs-løsningen er afgørende for et vellykket hjerteeksperiment. MgCl2- ogCaCl2-stamopløsninger (1 mol/l) fremstilles på forhånd under hensyntagen til deres vandabsorption og til...

Arvelig hjertesygdom katekolaminminerg polymorf ventrikulær takykardi (CPVT) manifesterer sig som polymorf ventrikulær takykardi (PVT) episoder efter fysisk aktivitet, stress eller catecholamin udfordring, som kan forværres til potentielt dødelig ventrikelflimmer 1,2,3,4 . Nylige beviser efter sin første rapport som et klinisk syndrom i 1995 implicerede mutationer i syv gener, alle involveret i sarkoplasmatisk retikulær (SR) lagerbutik Ca 2+ frigivelse i denne tilstand: den hyppigst rapporterede RYR2-kodning af ryanodinreceptor 2 (RyR2) af Ca2+ frigivelseskanaler 5,6, FKBP12.67, CASQ2-kodning af hjertekalsekvestrin8, TRDN kodning af det junctionale SR-proteintriadin 9 og CALM1 9, CALM2 10 og CALM3 identisk kodende calmodulin11,12. Disse genotypiske mønstre tilskriver de arytmiske hændelser til den uregulerede patologiske frigivelse af SR-lager Ca2+12.
Spontan Ca 2+ frigivelse fra SR kan detekteres som Ca 2+ gnister eller Ca 2+ bølger, som aktiverer Na+/Ca 2+ veksleren (NCX). Veksleren af en Ca2+ for tre Na+ genererer en indadgående strøm, som fremskynder den diastoliske depolarisering og driver membranspændingen til tærsklen for handlingspotentiale (AP). Hos RyR2-knock-in-mus fører den øgede aktivitet afRyR2 R4496C i sinoatriale knude (SAN) til et uventet fald i SAN-automaticitet ved Ca 2+-afhængigt fald i I Ca,L og SR Ca2+ udtømning under diastol, hvilket identificerer subcellulære patofysiologiske ændringer, der bidrager til SAN-dysfunktionen hos CPVT-patienter13,14. Forekomst af de relaterede kardiomyocytcytosoliske Ca2+-bølger er mere sandsynlig efter stigninger i baggrundscytosolisk [Ca2+] efter RyR-sensibilisering af catecholamin, herunder isoproterenol (ISO), udfordring.
Detaljerede kinetiske ændringer i Ca 2+ signalering efter RyR2-medieret Ca2+ frigivelse som reaktion på aktivering af handlingspotentiale (AP), der kan være årsagen til de observerede ventrikulære arytmier i intakte hjerte-CPVT-modeller, mangler at blive bestemt for hele spektret af rapporterede RyR2-genotyper12. Dette papir præsenterer instrumenteringsopsætningen og den eksperimentelle procedure til kortlægning med høj kapacitet af Ca2+ signaler og transmembranpotentialer (Vm) i murine vildtype (WT) og heterozygote RyR2-R2474S / + hjerter kombineret med programmeret elektrisk pacing før og efter isoproterenoludfordring. Denne protokol giver en metode til mekanistisk undersøgelse af CPVT-sygdom i isolerede musehjerter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

Den pro-arytmiske hjertesygdom catecholaminerge polymorfe ventrikulære takykardi (CPVT) manifesterer sig som polymorfe ventrikulære takykardi episoder efter fysisk aktivitet, stress eller catecholamin udfordring, som kan forværres til potentielt dødelig ventrikelflimmer. Musens hjerte er en udbredt art til modellering af arvelige hjertearytmiske sygdomme, herunder CPVT. Samtidig optisk kortlægning af transmembranpotentiale (Vm) og calciumtransienter (CaT) fra Langendorff-perfunderede musehjerter har potentiale til at belyse mekanismerne bag arytmogenese. Sammenlignet med undersøgelsen på celleniveau kan den optiske kortlægningsteknik teste nogle elektrofysiologiske parametre, såsom bestemmelse af aktivering, ledningshastighed, aktionspotentiel varighed og CaT-varighed. Dette papir præsenterer instrumenteringsopsætningen og den eksperimentelle procedure til optisk kortlægning med høj kapacitet af CaT og Vm i murine vildtype og heterozygote RyR2-R2474S / + hjerter kombineret med programmeret elektrisk pacing før og under isoproterenoludfordringen. Denne fremgangsmåde har vist en gennemførlig og pålidelig metode til mekanisk undersøgelse af CPVT-sygdom i et ex vivo-musehjertepræparat.

Optisk kortlægning har været en populær tilgang til at studere komplekse hjertearytmier i det sidste årti. Den optiske kortlægningsopsætning består af et EMCCD-kamera, der giver en samplinghastighed på op til 1.000 Hz og en rumlig opløsning på 74 x 74 μm for hver pixel. Det muliggør et ret højt signalstøjforhold under signalprøveudtagning (figur 1). Når Langendorff-perfunderet hjerte når en stabil tilstand, og farvestofbelastningen er afsluttet, placeres hjertet i det homote...

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Denne protokol introducerer dobbeltfarvet optisk kortlægning af musehjerter opnået fra vildtype- og knock-in-dyr, der er ramt af katekolaminer polymorf ventrikulær takykardi, herunder elektrofysiologiske målinger af transmembranspænding og intracellulære Ca2+ transienter med høj tidsmæssig og rumlig opløsning.

Dual-Dye optisk kortlægning af hjerter fra RyR2R2474S Knock-In mus af katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Denne metode hjælper os med at afsløre de elektrofysiologiske egenskaber og mekanismer for ventrikulære arrestudstrygninger forbundet med sygdomme som katekolaminerg polymorf ventrikulær takykardi. Ved hjælp af denne teknik kan vi opnå membranpotentialet og intercellulære calciumsignaler samtidigt under forskellige programmerede elektriske pacingprotokoller, hvilket er særligt velegnet til at udforske de underliggende mekanismer og dynamikker i hjertearytmisk sygdom såsom CPVT. For at udføre dette eksperiment med succes skal du sørge for at have et godt perfuseret hjerte, korrekt farvestofbelastning, afkobling af excitationskontraktion og omhyggelige kameraindstillinger.For at begynde skal du konfigurere det optiske kortlægningssystem og tænde kameraet for stabil prøveudtagningstemperatur ved minus 50 grader Celsius. Placer det høstede musehjerte i den kolde CREB-opløsning for at bremse stofskiftet og beskytte hjertet. Fjern det omgivende væv i aorta.Brug en specialfremstillet kanylenål til at kannulere den, og fastgør den med en 4-0 silkesutur. Nu perfuser hjertet med Langendorff-systemet med en konstant hastighed på 3,5 til 4,0 ml pr. Minut. Indsæt et lille plastrør i venstre ventrikel for at frigøre overbelastning af opløsningen i kammeret for at undgå overbelastning og fastgør plastrøret i kanylenålen.Placer derefter to ledninger i perfusatet i badet, og tænd for strømmen til elektrokardiogramforstærkerboksen og den elektriske stimuleringscontroller. Start derefter det refererede elektrokardiogram eller EKG-software og overvåg kontinuerligt EKG. Udfør de efterfølgende trin i mørket, når hjertet når en stabil tilstand.Perfus blebbistatin CREBs opløsningsblanding konstant ind i hjertet i 10 minutter for at afkoble sammentrækning fra excitation og undgå sammentrækningsartefakter under optagelsen. Brug derefter en rød lommelygte til at undersøge hjertet for at bekræfte fuldstændig ophør af sammentrækninger. Perfus hjertet med Rhod-2 AM arbejdsløsning i 15 minutter i Langendorff perfusionssystemet efter frakobling af excitationskontraktion.Oprethold iltforsyningen under intracellulær calciumfarvestofbelastning. For at forhindre bobledannelse fra pluronic F-127 skal du indsætte en boblefælde i perfusionssystemet. Fortynd 10 mikroliter RH 237 stamopløsning i 50 ml perfusat og læg i 10 minutter.Når du har afsluttet den dobbelte farveindlæsning, skal du tage en række fotos. Bekræft, at spændings- og calciumsignaler er tilstrækkelige til analyse. Tænd for de to lysdioder for excitationslys, og juster deres intensitet til et passende område.Placer hjertet under detekteringsenheden, og sørg for, at det er godt oplyst af de to lysdioder, der justerer lyspunktdiameteren til to centimeter. Indstil arbejdsafstanden mellem linsen og hjertet til 10 centimeter for at opnå den ønskede samplinghastighed og rumlige opløsning. Åbn signalsamplingssoftwaren for samtidig at styre kameraet og fange spændings- og calciumsignaler.Start MyoPacer Field Stimulator og indstil pacing mønsteret til transistor transistor logik med to millisekunder pacing varighed pr puls. Indstil startintensiteten til 0,3 volt. Placer et par platinelektroder fastgjort til epikardialen i venstre ventrikelspids.Anvend 30 på hinanden følgende 10 hertz S1-stimuli til at teste hjertets diastoliske spændingstærskel ved hjælp af EKG-optagelsessoftwaren. Forøg gradvist spændingsamplituden, indtil en-til-en-optagelse opnås. Implementer S1-S1-protokollen til måling af calcium eller handlingspotentielle alternativer og restitutionsegenskaber.Tempo hjertet fortløbende startende ved en grundlæggende cykluslængde på 100 millisekunder. Reducer cykluslængden med 10 millisekunder i hver efterfølgende sekvens, indtil den når 50 millisekunder. Start samtidig optisk kortlægning før stimulering.For at måle den ventrikulære effektive ildfaste periode ved hjælp af S1-S2-stimulusprotokollen skal du starte med en S1-S1-pacingcykluslængde på 100 millisekunder. Par S2 ved 60 millisekunder og fald med et to millisekund trin decrement, indtil S2 undlader at fange ektopisk QRS-kompleks. Til arytmi induktion, administrere evig 50 hertz burst pacing og udføre den samme pacing episode efter at have ventet på en to sekunders interval af hvile.Overvåg omhyggeligt elektrokardiogramoptagelserne i den kontinuerlige højfrekvente pacingperiode for straks at begynde samtidige optiske kortlægningsoptagelser, når der genereres en interessant arytmisk bølge. Fortsæt med at tage billeder ved hjælp af elektronmultiplicerende ladningskoblet enhedskamera. I billedoptagelsessoftwaren skal du trykke på Vælg mappe og indlæse billeder for at starte den halvautomatiske massive videodataanalyseproces.Indtast de korrekte prøveudtagningsparametre til analysen. Indstil billedtærsklen manuelt, og vælg det interessante område. Anvend et Gaussisk rumligt filter på tre gange tre pixel, et Savitzky-Golay-filter og en baselinekorrektion med høj hat.Tryk derefter på Behandl billeder for at fjerne basislinjen og beregne elektrofysiologiske parametre som APD-80 og CATD-50. Indstil initieringstiden for aktionspotentialvarigheden ved toppen og terminalpunktet til 80% repolarisering til beregning af APD-80. På samme måde defineres starttidspunktet for calciumtransient varighed som toppen, hvor terminalpunktet er 80%afslapning.Typiske spor i varmekort over APD-80 og CATD-80 vises. Isoproterenol forkorter APD-80 og vildtype og catecholaminerge polymorfe ventrikulære takykardi eller CPVT mus, men ingen forskel blev fundet efter isoproterenol udfordring. CATD-80 og CPVT-mus var længere end i vildtype efter isoproterenol-udfordringen, mens der ikke var nogen betydning før behandlingen.Ifølge spændingssignalerne havde vildtype- og CPVT-hjerterne den samme ledningsevne over epikardiet ved baseline og efter isoproterenolintervention. Varmekort viste, at CPVT-mus har samme ledningsevne som vildtypemusene før og efter isoproterenoludfordringen. Calciumamplitudealternativ analyse viste, at calciumsignalerne i vildtypehjerter forblev stabile ved baseline under på hinanden følgende S1-S1-pacing ved 14,29 og 16,67 hertz, mens CPVT-hjerterne viste frekvensafhængige alternativer.Efter isoproterenol-udfordringen udviste CPVT-hjerter frekvensafhængige alternativer og calciumsignal under S1-S1-pacing, mens vildtypehjerter ikke blev påvirket. Tachy arytmi analyse foreslog, at både vildtype og CPVT hjerter udviser normal ledning under 50 hertz burst pacing ved baseline. Efter overflod med isoproterenol viste CPVT-hjerter højfrekvente rotorer efter 50 hertz burst pacing, mens vildtypehjerter opretholdt normal ledning.Efter denne procedure anvendes adogentyper og vildtypemus til at illustrere de elektrofysiologiske og funktionelle egenskaber i disse modeller eller i opfindelsen af lægemidler. Optisk kortlægning er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af hjertearytmier, men det kan ikke bruges klinisk på grund af begrænsning i fluorescerende farvestof under excitationskontraktionsafkoblingen. Med udviklingen af fluorescerende korrekt til forskellige målmolekyler under udviklingen af beregningsteknologi med høj revolution er den hjerteoptiske kortlægningsteknik bundet til kun at opnå applikationer.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolering af embryonale Ventrikulære endotelceller

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spænding og Calcium Dual Channel Optical Kortlægning af dyrkede HL-1 Atriel myocyt Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kortlægning af Intra-reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembrane potentiale i Langendorff-perfunderet kanin Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...