Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.

Voor de experimenten worden mannelijke 10 tot 14 weken oude wildtype muizen of RyR2-R2474S/+ muizen (C57BL/6 achtergrond) met een gewicht van 20-25 g gebruikt. Alle procedures zijn goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Southwest Medical University, Sichuan, China (goedkeuring nr.20160930) in overeenstemming met de nationale richtlijnen waaronder de instelling opereert.
1. Voorbereiding
<ol><li>Voorraad oplossingen<ol><li>Blebbistatin...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.
Bereiding van de oplossing De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houde...

Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 die codeert voor ryanodinereceptor 2 (RyR2) van Ca2+ afgiftekanalen5,6, FKBP12.67, CASQ2 codeert voor cardiale calsequestrine8, TRDN codeert voor het junctionele SR-eiwit triadine 9, en CALM19, CALM2 10 en CALM3 codeert identiek voor calmoduline11,12. Deze genotypische patronen schrijven de aritmische gebeurtenissen toe aan de ongereguleerde pathologische afgifte van SR-opslag Ca2+12.
Spontane Ca 2+ afgifte van SR kan worden gedetecteerd als Ca 2+ vonken of Ca 2+ golven, die de Na+/Ca 2+ wisselaar (NCX) activeert. De wisselaar van één Ca2+ voor drie Na+ genereert een inwaartse stroom, die de diastolische depolarisatie versnelt en de membraanspanning naar de actiepotentiaaldrempel (AP) drijft. Bij RyR2 knock-in muizen leidt de verhoogde activiteit van RyR2R4496C in de sinusknoop (SAN) tot een onverwachte afname van de SAN-automaticiteit door Ca 2+-afhankelijke afname van I Ca,L en SRCa 2+ depletie tijdens diastole, waarbij subcellulaire pathofysiologische veranderingen worden geïdentificeerd die bijdragen aan de SAN-disfunctie bij CPVT-patiënten13,14. Het optreden van de verwante cardiomyocyt cytosolischeCa 2+ golven is waarschijnlijker na verhogingen van het cytosolische [Ca2+] op de achtergrond na RyR-sensibilisatie door catecholamine, waaronder isoproterenol (ISO), provocatie.
Gedetailleerde kinetische veranderingen in Ca 2+-signalering na RyR2-gemedieerde Ca2+-afgifte als reactie op activering van actiepotentiaal (AP) die de oorzaak kunnen zijn van de waargenomen ventriculaire aritmieën in intacte cardiale CPVT-modellen moeten nog worden bepaald voor het volledige bereik van gerapporteerde RyR2-genotypen12. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput mapping van Ca2+ signalen en transmembraanpotentialen (Vm) in muizen wild-type (WT) en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en na isoproterenol provocatie. Dit protocol biedt een methode voor de mechanistische studie van CPVT-ziekte in geïsoleerde muizenharten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.

Optical mapping is de afgelopen tien jaar een populaire benadering geweest bij het bestuderen van complexe hartritmestoornissen. De optische mapping-opstelling bestaat uit een EMCCD-camera, die een bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz en een ruimtelijke resolutie van 74 x 74 μm voor elke pixel oplevert. Het maakt een vrij hoge signaal-ruisverhouding mogelijk tijdens signaalbemonstering (Figuur 1). Zodra het met Langendorff doorbloede hart een stabiele toestand bereikt en het laden van de kl...

Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Deze methode zal ons helpen om de elektrofysiologische eigenschappen en mechanismen van ventriculaire uitstrijkjes te onthullen die verband houden met ziekten zoals catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie. Met behulp van deze techniek kunnen we de membraanpotentiaal en intercellulaire calciumsignalen tegelijkertijd verkrijgen onder verschillende geprogrammeerde elektrische pacingprotocollen, wat vooral geschikt is voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen en dynamiek van hartritmestoornissen zoals CPVT. Om dit experiment met succes uit te voeren, moet u zorgen voor een goed doorbloed hart, een goede kleurstofbelasting, excitatie-contractie-ontkoppeling en zorgvuldige camera-instellingen.Stel om te beginnen het optische mappingsysteem in en zet de camera aan voor een stabiele bemonsteringstemperatuur bij min 50 graden Celsius. Plaats het geoogste muizenhart in de koude CREB-oplossing om de stofwisseling te vertragen en het hart te beschermen. Verwijder het omringende weefsel van de aorta.Gebruik een op maat gemaakte canulerende naald om het te cannuleren en fixeer het met een 4-0 zijden hechtdraad. Doordrenk nu het hart met het Langendorff-systeem met een constante snelheid van 3,5 tot 4,0 milliliter per minuut. Steek een klein plastic buisje in de linker hartkamer om de congestie van de oplossing in de kamer te verwijderen om overbelasting te voorkomen en bevestig het plastic buisje in de canulerende naald.Plaats vervolgens twee draden in het perfusaat in het bad en schakel de voedingen voor de elektrocardiogram versterkerbox en elektrische stimulatiecontroller in. Start vervolgens het elektrocardiogram of de ECG-software waarnaar wordt verwezen en controleer het ECG continu. Voer de volgende stappen in het donker uit wanneer het hart een stabiele toestand bereikt.Doordrenk het blebbistatine CREBs-oplossingsmengsel constant gedurende 10 minuten in het hart om contractie los te koppelen van excitatie en contractieartefacten tijdens het filmen te voorkomen. Onderzoek vervolgens met een rode zaklamp het hart om de volledige stopzetting van de weeën te bevestigen. Doordrenk het hart gedurende 15 minuten met Rhod-2 AM-werkoplossing in het Langendorff-perfusiesysteem na het ontkoppelen van de excitatiecontractie.Handhaaf de zuurstoftoevoer tijdens het laden van intracellulaire calciumkleurstoffen. Om de vorming van luchtbellen door pluronic F-127 te voorkomen, plaatst u een bellenvanger in het perfusiesysteem. Verdun 10 microliter RH 237 stockoplossing in 50 milliliter perfusaat en laad gedurende 10 minuten.Na voltooiing van het laden van de dubbele kleurstof, maakt u een reeks foto's. Controleer of de spannings- en calciumsignalen voldoende zijn voor analyse. Schakel de twee LED's in voor excitatielichten en pas hun intensiteit aan tot een goed bereik.Plaats het hart onder het detectieapparaat en zorg ervoor dat het goed wordt verlicht door de twee LED's die de diameter van de lichtvlek aanpassen tot twee centimeter. Stel de werkafstand tussen de lens en het hart in op 10 centimeter om de gewenste bemonsteringsfrequentie en ruimtelijke resolutie te bereiken. Open de software voor signaalbemonstering om tegelijkertijd de camera te bedienen en spannings- en calciumsignalen vast te leggen.Start de MyoPacer Field Stimulator en stel het stimulatiepatroon in op transistortransistorlogica met twee milliseconden stimulatieduur per puls. Stel de initiële intensiteit in op 0.3 volt. Plaats een paar platina-elektroden die zijn bevestigd aan de epicardiale apex van de linker hartkamer.Pas 30 opeenvolgende S1-stimuli van 10 hertz toe om de diastolische spanningsdrempel van het hart te testen met behulp van de ECG-opnamesoftware. Verhoog geleidelijk de spanningsamplitude totdat één-op-één opname is bereikt. Implementeer het S1-S1-protocol om calcium- of actiepotentiaalalternatieven en restitutie-eigenschappen te meten.Verhoog het hart achtereenvolgens, beginnend met een basiscycluslengte van 100 milliseconden. Verkort de cycluslengte met 10 milliseconden in elke volgende reeks tot 50 milliseconden. Start tegelijkertijd optische mapping voorafgaand aan stimulatie.Om de ventriculaire effectieve refractaire periode te meten met behulp van het S1-S2-stimulusprotocol, begint u met een S1-S1-stimulatiecycluslengte van 100 milliseconden. Koppel S2 na 60 milliseconden en verlaag met een stapafname van twee milliseconden totdat S2 er niet in slaagt het ectopische QRS-complex vast te leggen. Voor aritmie-inductie dient u eeuwigdurende burst-pacing van 50 hertz toe en voert u dezelfde pacing-episode uit na een rustpauze van twee seconden.Houd de elektrocardiogramopnamen zorgvuldig in de gaten tijdens de continue hoogfrequente stimulatieperiode om onmiddellijk te beginnen met gelijktijdige optische mapping-opnames wanneer een interessante aritmische golf wordt gegenereerd. Ga verder met het vastleggen van beelden met behulp van de camera van het elektronenvermenigvuldigende ladinggekoppelde apparaat. Druk in de beeldacquisitiesoftware op Map selecteren en laad afbeeldingen om het semi-automatische analyseproces voor enorme videogegevens te starten.Voer de juiste bemonsteringsparameters voor de analyse in. Stel handmatig de afbeeldingsdrempel in en selecteer het interessegebied. Pas een Gaussiaans ruimtelijk filter van drie bij drie pixels, een Savitzky-Golay-filter en een basislijncorrectie met hoge hoed toe.Druk vervolgens op Afbeeldingen verwerken om de basislijn te verwijderen en elektrofysiologische parameters zoals APD-80 en CATD-50 te berekenen. Stel de initiatietijd van de actiepotentiaalduur in op de piek en het eindpunt op 80% repolarisatie voor het berekenen van APD-80. Definieer op dezelfde manier de starttijd van de calciumtransiënte duur als de piek, met als eindpunt 80% ontspanning.Typische sporen in heatmaps van APD-80 en CATD-80 worden getoond. Isoproterenol verkort APD-80 en wildtype en catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie of CPVT-muizen, maar er werd geen verschil gevonden na isoproterenolprovocatie. CATD-80- en CPVT-muizen waren langer dan bij wildtype na de isoproterenolprovocatie, terwijl er vóór de behandeling geen significantie was.Volgens de spanningssignalen bezaten het wildtype en CPVT-harten hetzelfde geleidingsvermogen over het epicardium bij baseline en na isoproterenol-interventie. Warmtekaarten toonden aan dat CPVT-muizen hetzelfde geleidingsvermogen hebben als de wildtype muizen voor en na de isoproterenol-provocatie. Analyse van calciumamplitude-alternatieven toonde aan dat de calciumsignalen in wild-type harten stabiel bleven bij baseline tijdens opeenvolgende S1-S1-pacing op 14,29 en 16,67 hertz, terwijl de CPVT-harten frequentieafhankelijke alternatieven vertoonden.Na de isoproterenol-provocatie vertoonden CPVT-harten frequentieafhankelijke afwisselingen en calciumsignaal tijdens S1-S1-stimulatie, terwijl wild-type harten niet werden beïnvloed. Analyse van tachy-aritmie suggereerde dat zowel wildtype- als CPVT-harten normale geleiding vertonen tijdens een burst-tempo van 50 hertz bij baseline. Na overdaad met isoproterenol vertoonden CPVT-harten hoogfrequente rotoren na een burst-pacing van 50 hertz, terwijl wild-type harten een normale geleiding behielden.Volgens deze procedure worden adogene types en wildtype muizen gebruikt om de elektrofysiologische en functionele eigenschappen in deze modellen of in de uitvinding van geneesmiddelen te illustreren. Optische mapping is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van hartritmestoornissen, maar het kan niet klinisch worden gebruikt vanwege de beperking van fluorescerende kleurstof onder de excitatiecontractie-ontkoppeling. Met de ontwikkeling van fluorescerende juiste voor verschillende doelmoleculen onder de ontwikkeling van rekentechnologie met hoge omwenteling, zal de cardiale optische mappingtechniek alleen toepassingen bereiken.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Een goede verzorging en reiniging van de microscoop

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

Belangrijke componenten van de lichtmicroscoop

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatische Optical Heartbeat Analyse van kleine hart

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...