Name: dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia at JoVE.com

Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700308 à XO et 31871181 à ML, et 82270334 à XT), le Programme de soutien à la science et à la technologie (CN) de la province du Sichuan (2021YJ0206 à XO, 23ZYZYTS0433 et 2022YFS0607 à XT et 2022NSFSC1602 à TC) et le Laboratoire d’État clé pour la chimie et l’ingénierie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi) (CMEMR2017-B08 à XO), MRC (G10031871181 à ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE à Oxford (ML) subventions.

Des souris mâles de type sauvage âgées de 10 à 14 semaines ou des souris RyR2-R2474S/+ (fond C57BL/6) pesant 20 à 25 g sont utilisées pour les expériences. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Sud-Ouest, Sichuan, Chine (approbation NO :20160930) conformément aux directives nationales en vertu desquelles l’institution fonctionne.
1. Préparation
<ol><li>Solutions...

<ol>
	<li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++handling+and+arrhythmogenesis.">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li><li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+(RyR2)+gene+in+genetically+modified+murine+hearts.">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li><li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).</li><li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Ca2++homeostasis,+atrial+arrhythmogenesis,+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification.">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).</li><li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients.">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+(hRyR2)+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li><li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+(ryanodine+receptor)+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death.">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li><li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations.">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li><li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CACNA1C-related+disorders.">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. , (1993).</li><li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility.">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li><li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+(CALM3-A103V)+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks.">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li><li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li><li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2++release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li><li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na(+)-Ca(2+)+exchanger:+molecular+partners+in+pacemaker+regulation.">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ElectroMap:+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology.">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li><li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system.">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).</li><li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool,+(-)-blebbistatin.">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li><li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells.">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li><li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology &amp; Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap.">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts.">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).</li><li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmogenesis:+a+tale+of+two+clocks.">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li><li>Mal Baudot, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+&#945;1D+and+T-type+Cav3.1+&#945;1G+Ca2++channels+disrupts+heart+automaticity.">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 &#945;1D and T-type Cav3.1 &#945;1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction.">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li><li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1.">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li><li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge:+Modulation+by+p21-activated+kinase-1.">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li><li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing.">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart.">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).</li><li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart.">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li><li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3/4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium.">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li></ol>

Sur la base de notre expérience, les clés d’une cartographie optique à double colorant réussie d’un cœur de souris comprennent une solution et un cœur bien préparés, la charge du colorant, l’obtention du meilleur rapport signal/bruit et la réduction de l’artefact de mouvement.
Préparation de la solution La solution de Krebs est essentielle pour la réussite d’une expérience cardiaque. Les solutions mères de MgCl 2 et de CaCl2 (1 mol/L) sont ...

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique héréditaire (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe (TVP) à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’une provocation aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle 1,2,3,4 . Des preuves récentes à la suite de son premier rapport en tant que syndrome clinique en 1995 ont impliqué des mutations dans sept gènes, tous impliqués dans la libération de Ca 2+ dans le stockage réticulaire sarcoplasmique (SR) dans cette condition : le récepteur RYR2 codant pour la ryanodine 2 (RyR2) le plus fréquemment rapporté des canaux de libération de Ca2+5,6, FKBP12.67, CASQ2 codant pour la calséquestrinecardiaque 8, TRDN codant pour la protéine jonctionnelle SR triadine 9, et CALM1 9, CALM2 10 et CALM3 codant de manière identique pour la calmoduline11,12. Ces profils génotypiques attribuent les événements arythmiques à la libération pathologique non régulée de SR stock Ca2+12.
La libération spontanée de Ca 2+ par SR peut être détectée sous forme d’étincelles de Ca 2+ ou d’ondes de Ca 2+, ce qui active l’échangeur Na+/Ca 2+ (NCX). L’échangeur d’un Ca2+ pour trois Na+ génère un courant entrant, qui accélère la dépolarisation diastolique et conduit la tension membranaire jusqu’au seuil du potentiel d’action (PA). Chez les souris knock-in RyR2, l’activité accrue de RyR2R4496C dans le nœud sino-auriculaire (SAN) conduit à une diminution inattendue de l’automaticité du SAN par une diminution dépendante du Ca 2+ de l’épuisement de l’ICa,L et du SR Ca2+ pendant la diastole, identifiant des altérations physiopathologiques subcellulaires contribuant au dysfonctionnement du SAN chez les patients atteints de CPVT13,14. L’apparition des ondes cytosoliques Ca 2+ cardiomyocytaires associées est plus probable après l’augmentation du cytosolique de fond [Ca2+] à la suite de la sensibilisation RyR par la catécholamine, y compris l’isoprotérénol (ISO).
Les changements cinétiques détaillés dans la signalisation du Ca 2+ après la libération de Ca2+ médiée par RyR2 en réponse à l’activation du potentiel d’action (PA) qui pourrait être la cause des arythmies ventriculaires observées dans les modèles de CPVT cardiaque intacts restent à déterminer pour l’ensemble des génotypes RyR2 rapportés12. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie à haut débit des signaux Ca2+ et des potentiels transmembranaires (Vm) dans les cœurs murins de type sauvage (WT) et hétérozygotes RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et après le défi isoprotérénol. Ce protocole fournit une méthode pour l’étude mécanistique de la maladie CPVT dans des cœurs de souris isolés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To filter solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pasteur pipette</td>
			<td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China</td>
			<td>00900026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>B. Braun Medical Inc.</td>
			<td>YZB/GER-5474-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L PCR tube</td>
			<td>Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China</td>
			<td>F611541-0010</td>
			<td>Aliquote the stock solutions&#160; to avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td>Store Tyrode&#39;s solution at 4 &#176;C for follow-up heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>585/40 nm filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Filter for calcium signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630 nm long-pass filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>G15604AJ</td>
			<td>Filter for voltage signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td>
			<td>T48402-100G</td>
			<td>To minimize suffering and pain reflex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td>
			<td>SLBV5564</td>
			<td>Excitation-contraction uncoupler to&#160; eliminate motion artifact during mapping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBK1794V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made thermostatic bath</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>TBC-2.1</td>
			<td>To keep temperature of perfusion solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>(RNBT7442)</td>
			<td>Solvent for dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAF030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroMap software</td>
			<td>University of Birmingham</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantification of electrical parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td>
			<td>A18G150001</td>
			<td>Acquire images for optical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET525/36 sputter coated filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>319106</td>
			<td>Excitation filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBT4811V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td>
			<td>(H51021209)</td>
			<td>To prevent blood clots in the coronary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Iris forceps</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YAA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>HY-B0468/CS-2582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS5003</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7355/7356</td>
			<td>The excitation light of fluorescence probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacroLED light source</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>7352</td>
			<td>Control the LEDs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China</td>
			<td>YBC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Optical signals sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBS6841V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICRO3-1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>M5337</td>
			<td>Connect the electrical stimulator and Spike2 software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer EP field stimulator</td>
			<td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td>
			<td>S006152</td>
			<td>Electric stimulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBS2340V</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>BCBW9042</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td>
			<td>SLBX3605</td>
			<td>For Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroLog System</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>NL905-229</td>
			<td>For ECG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmapScope5</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Calcium alternans and arrhythmia analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scissors</td>
			<td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td>
			<td>T4-3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptoSplit</td>
			<td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td>
			<td>6970</td>
			<td>Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm&#160; simultaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristalic pump</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td>To pump the solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCD010060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1899021</td>
			<td>To enhance the loading with Rhod2AM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RH237</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td>
			<td>1971387</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2 AM</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td>
			<td>1890519</td>
			<td>Calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel tube</td>
			<td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td>
			<td>96402-16</td>
			<td>Connect with the peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China</td>
			<td>20172650032</td>
			<td>To fix the aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike2</td>
			<td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To record and analyze ECG data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation electrode</td>
			<td>MappingLab, United Kingdom</td>
			<td>SE1600-35-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T510lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>312461</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>321343</td>
			<td>For light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual-dye optical mapping of hearts from ryr2r2474s knock-in mice of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’un défi aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Le cœur de souris est une espèce répandue pour modéliser les maladies arythmiques cardiaques héréditaires, y compris la TVPC. La cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire (Vm) et des transitoires calciques (CaT) à partir de cœurs de souris perfusés par Langendorff a le potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents à l’arythmogenèse. Par rapport à l’étude au niveau cellulaire, la technique de cartographie optique peut tester certains paramètres électrophysiologiques, tels que la détermination de l’activation, de la vitesse de conduction, de la durée du potentiel d’action et de la durée du CaT. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie optique à haut débit du CaT et de la Vm dans des cœurs murins de type sauvage et hétérozygote RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et pendant le défi isoprotérénol. Cette approche a démontré une méthode réalisable et fiable pour étudier mécanistiquement la maladie CPVT dans une préparation ex vivo de cœur de souris.

La cartographie optique a été une approche populaire dans l’étude des arythmies cardiaques complexes au cours de la dernière décennie. La configuration de cartographie optique se compose d’une caméra EMCCD, offrant un taux d’échantillonnage allant jusqu’à 1 000 Hz et une résolution spatiale de 74 x 74 μm pour chaque pixel. Il permet d’obtenir un rapport signal/bruit assez élevé lors de l’échantillonnage du signal (Figure 1). Une fois que le cœur perfusé par Langend...

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Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Ce protocole introduit une cartographie optique à double colorant des cœurs de souris obtenus à partir d’animaux de type sauvage et knock-in atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, y compris des mesures électrophysiologiques de la tension transmembranaire et des transitoires intracellulaires Ca2+ avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Cartographie optique à double colorant des cœurs de souris knock-in RyR2R2474S de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Cette méthode nous aidera à révéler les propriétés électrophysiologiques et les mécanismes des frottis d’arrêt ventriculaire associés à des maladies telles que la tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique. En utilisant cette technique, nous pouvons obtenir simultanément le potentiel membranaire et les signaux calciques intercellulaires sous divers protocoles de stimulation électrique programmée, ce qui est particulièrement adapté à l’exploration des mécanismes et de la dynamique sous-jacents des maladies arythmiques cardiaques telles que la TVPC. Pour mener à bien cette expérience, assurez-vous d’avoir un cœur bien perfusé, une charge de colorant appropriée, un découplage excitation-contraction et des réglages minutieux de l’appareil photo.Pour commencer, configurez le système de cartographie optique et allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à moins 50 degrés Celsius. Placez le cœur de souris récolté dans la solution froide de CREB pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur. Retirez le tissu environnant de l’aorte.Utilisez une aiguille de canule sur mesure pour le canuler et fixez-le avec une suture en soie 4-0. Maintenant, perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5 à 4,0 millilitres par minute. Insérez un petit tube en plastique dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge et fixez le tube en plastique dans l’aiguille de canulation.Placez ensuite deux fils dans le perfusat dans le bain et allumez les alimentations du boîtier d’amplification de l’électrocardiogramme et du contrôleur de stimulation électrique. Ensuite, lancez le logiciel d’électrocardiogramme ou d’ECG référencé et surveillez en permanence l’ECG. Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable.Perfusez constamment le mélange de solution de blebbistatine CREBs dans le cœur pendant 10 minutes pour découpler la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage. Ensuite, à l’aide d’une lampe de poche rouge, examinez le cœur pour confirmer l’arrêt complet des contractions. Perfuser le cœur avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff après découplage de la contraction d’excitation.Maintenir l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire de colorant calcique. Pour éviter la formation de bulles par le F-127 pluronique, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion. Diluer 10 microlitres de solution mère RH 237 dans 50 millilitres de perfusat et charger pendant 10 minutes.Une fois le chargement du colorant double terminé, capturez une séquence de photos. Confirmez que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse. Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée.Placez le cœur sous le dispositif de détection, en veillant à ce qu’il soit bien éclairé par les deux LED ajustant le diamètre du point lumineux à deux centimètres. Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur à 10 centimètres pour obtenir le taux d’échantillonnage et la résolution spatiale souhaités. Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler simultanément la caméra et capturer les signaux de tension et de calcium.Démarrez le stimulateur de champ MyoPacer et réglez le modèle de stimulation sur la logique du transistor avec deux millisecondes de durée de stimulation par impulsion. Réglez l’intensité initiale sur 0,3 volt. Positionnez une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicardie de l’apex du ventricule gauche.Appliquez 30 stimuli S1 consécutifs de 10 hertz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur à l’aide du logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture un-à-un soit atteinte. Mettre en œuvre le protocole S1-S1 pour mesurer les alternatives de calcium ou de potentiel d’action et les propriétés de restitution.Stimulez le rythme cardiaque consécutivement en commençant par une durée de cycle de base de 100 millisecondes. Diminuez la durée du cycle de 10 millisecondes dans chaque séquence suivante jusqu’à ce qu’elle atteigne 50 millisecondes. Lancez simultanément la cartographie optique avant la stimulation.Pour mesurer la période réfractaire ventriculaire effective à l’aide du protocole de stimulation S1-S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1-S1 de 100 millisecondes. Couplez S2 à 60 millisecondes et diminuez avec un décrément par pas de deux millisecondes jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique. Pour l’induction de l’arythmie, administrez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 hertz et effectuez le même épisode de stimulation après avoir attendu un intervalle de repos de deux secondes.Surveillez attentivement les enregistrements de l’électrocardiogramme pendant la période de stimulation continue à haute fréquence pour commencer rapidement les enregistrements de cartographie optique simultanés lorsqu’une onde arythmique intéressante est générée. Procédez à la capture d’images à l’aide de la caméra du dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons. Dans le logiciel d’acquisition d’images, appuyez sur Sélectionner un dossier et chargez les images pour commencer le processus semi-automatique d’analyse de données vidéo massives.Saisissez les paramètres d’échantillonnage corrects pour l’analyse. Définissez manuellement le seuil d’image et sélectionnez la région qui vous intéresse. Appliquez un filtre spatial gaussien de trois x trois pixels, un filtre de Savitzky-Golay et une correction de la ligne de base chapeau haut-de-forme.Appuyez ensuite sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques tels que APD-80 et CATD-50. Réglez le temps d’initiation de la durée du potentiel d’action au pic et le point terminal à 80% de repolarisation pour le calcul de l’APD-80. De même, définissez l’heure de début de la durée transitoire du calcium comme le pic avec le point terminal étant 80% de relaxation.Les traces typiques dans les cartes thermiques d’APD-80 et de CATD-80 sont indiquées. L’isoprotérénol raccourcit l’APD-80 et la tachycardie ventriculaire polymorphe de type sauvage et catécholaminergique ou CPVT, mais aucune différence n’a été trouvée après la provocation à l’isoprotérénol. Les souris CATD-80 et CPVT étaient plus longues que les souris sauvages après le test de provocation à l’isoprotérénol alors qu’il n’y avait pas de signification avant le traitement.Selon les signaux de tension, les cœurs de type sauvage et CPVT possédaient la même capacité de conduction à travers l’épicarde au départ et après l’intervention de l’isoprotérénol. Les cartes thermiques ont démontré que les souris CPVT ont la même capacité de conduction que les souris de type sauvage avant et après le défi de l’isoprotérénol. L’analyse des alternances d’amplitude calcique a montré que les signaux calciques dans les cœurs de type sauvage restaient stables au départ pendant les stimulations consécutives S1-S1 à 14,29 et 16,67 hertz, tandis que les cœurs CPVT présentaient des alternances dépendantes de la fréquence.Après le test de provocation à l’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont présenté des alternances dépendantes de la fréquence et un signal calcique pendant la stimulation S1-S1, tandis que les cœurs de type sauvage n’ont pas été influencés. L’analyse de l’arythmie tachymatique a suggéré que les cœurs de type sauvage et CPVT présentent une conduction normale pendant la stimulation en rafale de 50 hertz au départ. Après une profusion d’isoprotérénol, les cœurs CPVT ont montré des rotors à haute fréquence après une stimulation en rafale de 50 hertz, tandis que les cœurs de type sauvage ont maintenu une conduction normale.À la suite de cette procédure, des souris de type dogen et de type sauvage sont utilisées pour illustrer les propriétés électrophysiologiques et fonctionnelles de ces modèles ou dans l’invention de produits pharmaceutiques. La cartographie optique est un outil puissant pour l’étude des arythmies cardiaques, mais elle ne peut pas être utilisée cliniquement en raison de la limitation du colorant fluorescent lors du découplage de la contraction de l’excitation. Avec le développement de la fluorescence propre pour différentes molécules cibles dans le cadre du développement de la technologie de calcul à haute révolution, la technique de cartographie optique cardiaque est vouée à ne réaliser que des applications.

Research

JoVE Journal

Biology

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Entretien et nettoyage du microscope

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Principales composantes d&#39;un microscope optique

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Contraste de phase et les interférences de contraste différentiel (DIC) Microscopie

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

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Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

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Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Tension et calcium double cartographie de canal optique de Cultured HL-1 auriculaire myocytes monocouche

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Cartographie optique du commerce intra-réticulum sarcoplasmique Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Et potentiel transmembranaire dans le Lapin Coeur Langendorff perfusé

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Enregistrements de potentiel d’Action optique sous-type spécifique dans l’homme induit pluripotentes cellules souches dérivées des Cardiomyocytes ventriculaires